全 文 ：12　Liang P , Pardee A D.Dif ferential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain react ion.S cience ,
1992 , 257:967～ 991
(1997-10-17收稿 , 1998-01-06收修改稿)
马桑根瘤内生菌纯培养物的成功
回接及其分子鉴定
胡传炯①　周平贞②　周 启①　陈华癸①　A.D.L .Akkermans③
(①华中农业大学生命科技学院 ,武汉 430070;②中国农业科学院油料作物研究所 ,武汉 430062;③Department
of M icrobiology , Wageningen Agricultural University , 6703 C T , Wageningen , The Netherlands)
摘要　从马桑(Coriaria nepalensis)根瘤中分离获得 4 株具典型弗兰克氏菌(F rankia)形态特征的内生菌纯培
养物.结瘤试验证实它们均能侵染原寄主形成根瘤.特异性寡核苷酸探针杂交结果也表明这些内生菌纯培
养物属于 Frankia 属的成员.进一步用 nifHDK 探针杂交还显示这些菌株的基因组中均具有相应的同源片
段 ,并且表现出 nif基因限制性片段长度多型性差异.现已克隆出其中的 nifH 基因片段 , 为进一步研究马桑
类群 Frankia的系统发育奠定基础.
关键词　弗兰克氏菌　马桑　结瘤　分子鉴定
弗兰克氏菌(Frankia)是能与 8科 24属 200多种非豆科双子叶植物共生结瘤的一类放线
菌[ 1] ,自从 1978年首次分离获得 Frankia纯培养以来 ,已经从赤杨属(Alnus),木麻黄科(Ca-
suarinaceae),胡颓子科(Elaeagnaceae),杨梅科(Myricaceae)中 9属结瘤植物根瘤中成功地分离
到几百株具典型形态并能侵染结瘤的 Frankia 菌株.马桑类群的典型 Frankia 菌至今尚无成
功分离的报道[ 2] .
我们经多年探索从马桑根瘤中分离到一些具典型 Frankia形态特征的放线菌 ,即菌丝体
上形成孢囊(Sporangia)和泡囊(Vesicles)[ 3] .经结瘤试验证实有几个菌株能侵染原寄主形成
根瘤 ,并检测到这些菌株含有 nifHDK 同源片段和克隆出其中的 nifH 基因片段 ,这些结果都
表明我们所分离的菌株是 Frankia属的成员 ,其中 nifH 基因的分离 ,为进一步研究马桑内生菌
的系统发育奠定基础.
1　材料与方法
　　Frankia菌纯培养物 Cs030 , Cs103 , Cs150 , Cs641分离自我国不同地域来源的尼泊尔马
桑根瘤[ 3] .参考菌株 ArI3 , Cc01 , Hr18 , Mg+(丁鉴先生赠送)分别分离自赤杨(Alnus
rubra)、细枝木麻黄(Casuarina cunningham iana)、沙棘(Hippophae rhamnoids)和杨梅
(Myrica gale).所有菌株培养在 Bap[ 4]液体培养基中 , 28℃下静止或轻微振荡培养.
回接试验在温室中进行.种子经表面灭菌 ,催芽生根后移栽到灭菌的土壤蛭石(2∶1)或珍
珠岩或半固体斜面上 , 用无菌的 1/4 强度的 Hoagland 溶液浇灌 , 回接后浇以不含氮的
Hoagland溶液.回接前 ,先将纯培养物接种到 Bap中培养 1 ～ 2周 ,离心收集的菌丝体加适量
PBS(磷酸缓冲液 , pH6.8)于匀浆器中研磨 ,再大量接种到无氮 Bap中培养 2周后 ,制成菌悬液
969
第43卷　第 9期 科 学 通 报 1998年 5月
研究简报
用于回接.每个菌号接种 8 ～ 20株苗 ,沿根部加入菌悬液 2 mL(约 0.2 mg 湿菌体),每隔2周
接 1次 ,于生长期内共接 3次.每周补加营养液 1 ～ 2次 , 设不接种为对照 ,在温室中培养 ,常
规方法管理.
弗兰克氏菌总 DNA和 DNA 提取分别采用 Simonet等[ 5]和 Hahn等[ 6]方法.用作标记或
转化的 DNA片段用低融点胶法分离 ,纯化.探针的放射性标记 ,斑点(dot)或条带(slot)杂交 ,
Southern杂交等均用 Maniatis等[ 7]方法;探针的非放射性标记及杂交按 DIG_试剂盒方法操
作.用作 nif基因同源片段鉴别的探针为 pCclGX[ 8]中的来自 Cc01 的 nifHDK 同源片段 ,用作
Frankia属特异性鉴别和马桑根瘤内生菌鉴别的寡核苷酸探针分别为:Fp:5′ATAAATCTTTC-
CACACCACCAG 3′[ 6]和 Cor/dat探针:5′GAGCCCTTACGGACCCCGTATC 3′[ 2] .
用于扩增 nifH 片段的双向引物分别为 nifHF(5′CACGGATCCGCAAGGGTGG TATTGG
3′)和 nifHR(5′GTGAAGCTTCTCGATGACCGTCATCCGGC)[ 9] .PCR反应同文献[ 2] .产
物用低溶点胶法回收 、纯化;用 pGEM_T 载体系统转化感受态 E.coli JM109 , 方法参考
Promega Technical Bulletin(1995).
2　结果与讨论
2.1　马桑内生菌纯培养物的回接
温室条件下马桑菌株在土壤/蛭石 ,珍珠岩或半固体斜面上回接的结果见表 1.
表 1　马桑内生菌纯培养物的回接结果
菌株 成活苗的结瘤情况土壤/蛭石 珍珠岩 半固体斜面
Cs030 1/ 17a) 1/ 12b) 1/ 9c)
Cs103 1/ 20 0/ 12 1/ 8
Cs150 1/ 19 1/ 11 0/ 9
Cs641 1/ 20 0/ 12 0/ 0d)
对照 0/ 20 0/ 12 0/ 9
　　a)重复 4盆的结果 ,每盆 5株;b)重复 4盆的结果 ,每盆 3株;c)重复 3管的结果 ,每管 3株;d)死苗
4株纯培养物的回接结果较稳定 ,都能使盆栽土壤上的植株结瘤.除 Cs030在 3 种基质
上都能成功回接外 ,其他 3株菌还能使其生长在土壤和珍珠岩或半固体琼脂上的马桑结瘤.
但在所有条件下 ,结瘤率都较低 ,为 5.0%～ 12.5%.我们以前的工作也表明即使是用马桑根
瘤压碎汁或根际土接种马桑苗 ,其结瘤率也较低.目前已知影响回接的因素很多 ,除了菌株本
身特性外 ,各种环境因子如温度 、pH 、水分 、营养及植物生长状况等都影响到结瘤[ 1] .试验已
表明所用紫色土较供试的其他土壤更有利于马桑的生长和结瘤1)
2.2　寡核苷酸探针杂交
Hahn等人(1990)通过比较 23种来源于不同属的放线菌及几个来自赤杨属的 Frankia的
16S rRNA特定区域的序列异同 ,设计出具有 Frankia属特异性的寡核酸探针 F p[ 5] ,它只能和
Frankia菌的 RNA相杂交.同样地 ,Mirza 等人分析马桑和达提斯加属(Datisca)根瘤内生菌
以及其他 Frankia菌的 16S rRNA序列 ,设计出根瘤特异性探针 Co r/dat ,它只能特异性地和马
桑或达提斯加属内生菌的 RNA 相杂交.达提斯加属根瘤在形态解剖上与马桑的相类似 ,
1)胡传炯 ,硕士学位论文.1990
970
第43卷　第 9期 科 学 通 报 1998年 5月
研究简报
其内生菌至今也没有被成功地分离出来.马桑分离菌株 RNA 与 Fp 和 Cor/dat探针的条带杂
交的结果见图 1.结果表明试验菌株都能和 Fp 和Cor/dat探针杂交 ,而且与Cor/dat探针有更
强的杂交信号 ,因而得出这些菌株的确是分离自马桑根瘤的内生菌纯培养 ,并且是弗兰克氏菌
属的成员.
2.3　nifHDK同源片段的鉴定及其多样性
nifHDK是一种编码固氮酶复合物的结构基因 ,在进化上具有较强稳定性和保守性 ,也常
被用作探针检测 Frankia菌的类似基因[ 8 ～ 10] .首先用 pSA30(带有肺炎克氏杆菌的 nifHDK
片段)作探针检测到 6株马桑菌株具有同源性 ,但只有 1个菌株经 Southern 杂交证明有 3个
nifHDK_探针杂交带[ 10] .进一步用 pCc1GX 中带有 Frankia 菌株 Cc01的 nifHDK 同源片段
(5.5 kb)作探针检测到更多的菌株具有更强的阳性杂交信号.这些结果与前面的回接试验相
印证.图 2不仅显示了马桑菌株具有 nifHDK 同源片段 ,而且这些菌株的 nifHDK杂交带分布
在不同的 BamH Ⅰ消化片段上 ,即呈现不同的 nif 基因限制性片段长度多态性类群(nifHDK_
RFLPs).其中 Cs150和 Cs030均具有 2个以上的 nifHDK 杂交带 ,其中一条带与 Cc01相似 ,
均为 5.5 kb ,但在其他杂交片段的大小上有差异.Cs103和Cs641都只有一条均为 11 kb的杂
交带.这些结果还表明马桑菌株可以按照 nif基因序列差异划分为至少 3个 nifHDK_RFLP
类型 ,即表现出遗传多样性.目前 ,只有 Mirza 报道获得了马桑根瘤内生菌分离物 ,但该分离
物不形成泡囊 ,也不具有侵染结瘤和固氮的能力[ 2] ,本工作是首次证实马桑分离菌株具有 nif
基因同源序列.
图 1　纯培养物核酸制备物(RNA)与
探针 Fp(a , b)和 Cor/ dat(c , d)的条带
杂交
a1 , c1———Ar13;b1 , d1———C s030;a2 ,
c2———Cs103;b2 , d2———Cs150;a3 , c3
———Cs641;b3 , d3——— E.coli
图 2　nif_HDK(来自 pCclGx)与纯培养物总 DNA 的斑点杂交
(a)及其与 BamHⅠ酶解片段杂交(b)
(a)a1 , a3 , a5分别为C co1 , Hr18 , Mg +;b1～ 4分别为 Cs641 , C s150 ,
Cs103和C s030;b5为 E.coli;(b)1 , 2 , 3 , 4 , 5和 1′～ 5′分别为Cs150 ,
Cc01 , C s641 , Cs103 , Cs030 , M 为λ_HindⅢ
971
第43卷　第 9期 科 学 通 报 1998年 5月
研究简报
2.4　nifH基因的扩增和克隆
由于上述菌株在形态 ,细胞化学和侵染结瘤能力方面与 Frankia属的特征比较接近 ,为此
对它们进行了较系统的生物学特性研究[ 3] .它们存在 nifHDK同源序列也为最近的工作所证
实 ,已经用特异引物进行 PCR反应扩增了 Cs030的 nifH 基因片段 ,并通过 pGEM_T 克隆到感
受态大肠杆菌 JM 109中(图 3).该 nifH 扩增片段及其转化子都能够与来自根瘤菌(Rhizobi-
um sp.)的 nifHDK片段相杂交 ,进一步证实该产物的确为 nifH 片段(未发表资料).当然更加
直接的证据还有待 nifH 基因的全序列测定 ,这些序列信息将有助于揭示马桑分离菌株的系统
发育 ,这方面工作正在进行中.
图 3　纯培养物的 nifH 基因的 PCR产物(a)及其克隆子(b)
(a)1———Cs030 , 2———空白 , 3———Ar13 , 4———空白对照 , 5———λ_EcoRⅠ/HindⅢ;(b)A ～ K和 M 为纯培养物 nifH 产
物的克隆(约 3.86 kb), L为λ_HindⅢ
致谢　中国科学院应用生态研究所丁鉴研究员赠送 F rankia参考菌株;广西农业大学生物固氮研究室赠送有
关质粒 ,特此致谢.本工作为国际科学基金(IFS , D2678_1),湖北省自然科学基金(97J057)和荷兰 Wageningen
农业大学访问研究基金资助项目.
参　考　文　献
1　Benson D R , Silvester W B.Biology of Frankia st rains , act inomycete symbionts of actinorhizal plants.Microbiol Rev , 1993 ,
57:293～ 319
2　Mirza M S.The Ph D thesis.The Netherlands:Wageningen Agricultural University , 1993.49～ 100
3　胡传炯 ,周平贞 ,周启.马桑菌株生物学特性.微生物学报 , 1996 , 36(2):132～ 137
4　Murry M A , Fontaine M S , Torrey J G.Grow th kinet ics and ni trogenase induction in Frankia sp HFP Ar13 grow n in batch
culture.Plant Soil , 1984 , 78:61～ 78
5　simonet P , Normand P , Moiroud A , et al.Restrict ion enzyme digest ion patterns of Frankia plasmids.Plant Soil , 1985 , 87:
49～ 60
972
第43卷　第 9期 科 学 通 报 1998年 5月
研究简报
6　Hahn D , Starrenbury M J C , Akkermans A D L.Oligonucleotide probes that hybridize w ith rRNA as a tool to study Frankia
st rains in root nodules.Appl Environ Microbiol , 1990 , 56:1 342～ 1 346
7　Maniatis T , Fri tsch E F , Sambrook J.Molecular cloning , a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor , 1982.
538～ 560
8　崔玉海 ,王焰玲 ,秦 敏 ,等.弗兰克氏菌固氮基因片段的分离及其比较.科学通报 , 1990 , 35(18):1 419～ 1 421
9　Normand P , Simonet P , Bart in R.Conservation of nif sequences in F rankia.Mol Gen Genet , 1988 , 213:238～ 246
10　Hu C J , Zhou P Z , Zhou Q.DNA rest riction pat tern and nifHDK probe hybridization of Frankia isolates f rom Coriaria
nepalensis in China.In:Malik K A , Mirza M eds.Abstracts for 7th In ternational Symposium on Nit rogen Fixat ion With
Nonlegumes.Faisalabad , 1996.Sheikh Ghulam:Ali & Sons Ltd , 1996.189
(1997-10-05收稿 , 1998-01-16收修改稿)
λ噬菌体 DNA复制起始的转录激活:
体外系统的研究
Thomas W.Yoo①　黄 力②＊
(①Pomona College , Claremont CA 91711 , USA;②中国科学院微生物研究所微生物资源前期
开发国家重点实验室, 北京 100080.＊联系人)
摘要　通过构建重组质粒 , 将λ噬菌体 DNA 复制原点置于 T7 启动子控制之下 , 建立了依赖 T7 RNA聚合
酶转录激活的λDNA 复制体外纯酶系统.这一系统的建立为阐明λDNA 复制起始的转录激活的分子机理提
供了条件.同时表明 , λDNA 复制起始的转录激活不依赖大肠杆菌 RNA聚合酶与复制蛋白之间的特异相互
作用.
关键词　λ噬菌体 DNA复制　转录激活　T7 RNA 聚合酶　HU 蛋白　体外纯酶系统
很多原核和真核复制元的复制起始步骤依赖于转录或转录激活因子[ 1] .λ噬菌体 DNA
复制的起始依赖于宿主大肠杆菌 RNA 聚合酶催化的 、经过复制原点或在复制原点附近的转
录活动.这一现象被称为λDNA 复制起始的转录激活(transcriptional activation)[ 2] .利用
λDNA复制的体外纯酶系统(purified pro tein system), Mensa-Wilmot等人[ 3]发现 , 大肠杆菌类
组蛋白 HU在λDNA复制与转录的偶联中起着关键作用.HU 抑制λDNA 复制的起始 , 而大
肠杆菌 RNA聚合酶催化的转录能够解除这种抑制.他们推测 , HU 可能通过干扰预引发体的
形成抑制λDNA 复制的起始步骤.对于转录的解抑制作用的机理 , 了解则不多.遗传学证据
显示 , 大肠杆菌 RNA 聚合酶与λDNA 复制起始所必需的λP 蛋白和大肠杆菌 DNA解链酶有
着直接的相互作用[ 4] .一些作者[ 3 , 4]推测 , 这种作用是转录激活的分子基础.对转录激活的
生化研究进展较慢 , 这与缺少一个合适的体外转录激活系统有关.以往用作λDNA体外复制
模板的质粒通常含有多个不同位置和方向的 、为大肠杆菌 RNA 聚合酶所识别的启动子和启
动子类似序列[ 3] , 因此 , 当使用大肠杆菌 RNA聚合酶转录模板时 , 经过λ复制原点的转录活
动较复杂.在这样的系统中 , 难以深入分析λDNA 复制与转录的关系.我们通过构建重组质
粒 , 将λ复制原点置于 T7启动子的控制之下 , 建立了依赖 T7 RNA聚合酶转录激活的λDNA
复制体外纯酶系统.在这一系统中 , 转录由T7 RNA聚合酶从特异的 T7启动子发动 , 减少了
973
第43卷　第 9期 科 学 通 报 1998年 5月
研究简报