全 文 ：第 52 卷 第 5 期
2 0 1 6 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 5
May，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160512
收稿日期: 2015 － 12 － 31; 修回日期: 2016 － 01 － 28。
基金项目: “十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD01B0704)。
* 成仿云为通讯作者。
凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术*
王 新1 成仿云1，2 钟 原1 文书生1 李刘泽木1 黄弄璋1
(1． 北京林业大学园林学院 北京 100083; 2． 国家花卉工程技术研究中心 北京 100083)
摘 要: 【目的】研究建立凤丹牡丹离体快繁技术体系，为油用牡丹优良单株无性快繁与新品种培育开拓新途
径。【方法】早春从不同单株采集鳞芽外植体，置于 WPM + 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA3 0. 2 mg·L
－ 1培养基中离体培
养，根据启动诱导率及增殖系数，筛选适宜离体培养的单株，并对最优单株展开深入研究; 在增殖阶段，采用单因子
和随机区组试验设计，研究 WPM 培养基中 Ca(NO3 ) 2 浓度和植物生长调节剂 ( PGRs) (6-BA，GA3，NAA，KT 及
TDZ)配比对增殖的影响，获得最佳增殖培养基及其 PGRs 组合; 在诱导生根阶段，采用单因子试验设计，研究冷处
理时间和 IBA 浓度对生根率及生根质量的影响，获得最佳生根培养方案; 根据生根质量划分生根苗等级，并观察
移栽成活率。【结果】1)凤丹牡丹启动培养存在基因型差别，供试的 17 个高结实单株中有 7 个诱导率≥50%、增
殖系数≥2. 50，适宜进行离体培养，其中单株 FD10 表现最佳(诱导率 100%、增殖系数 4. 58)，被用于研究建立离体
快繁技术体系; 2)对培养基中 Ca2 +浓度与 PGRs 对增殖影响的研究结果表明，最佳增殖培养基及其 PGRs 组合为
WPM［Ca(NO3 ) 21 544 mg·L
－ 1］+ 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA3 0. 2 mg·L
－ 1，以 40 天为继代周期，增殖系数为 3. 87，共继
代 6 次; 3)对冷处理天数与 IBA 浓度对生根影响的研究表明，无根苗先在根诱导培养基(1 /2 MS + IBA 2. 0 mg·
L － 1 + 腐胺 1. 0 mg·L － 1 )上培养 30 天(其中前 8 天进行 4 ℃冷处理)，再转入生根培养基［1 /2 MS(CaCl2 加倍) +
活性炭 4. 0 g·L － 1］培养 20 天后生根率达 56. 67% ; 4)把生根苗按生根质量分为 1 ～ 3 级，其中 1 级苗占比 84%，
2 级和 3 级苗占比分别为 12. 5%和 3. 5%，移栽至基质泥炭土 +蛭石 +珍珠岩(体积比 1∶ 1∶ 1)中，60 天后发现愈伤
组织少的 1 级苗成活率达 66. 67%，而愈伤组织发达的 2 级和 3 级苗则死亡，表明生根质量对移栽成活至关重要。
【结论】凤丹牡丹离体快繁技术必须建立在基因型选择的基础上，本研究初步建立优株 FD10 的离体快繁技术体
系，确定其最佳增殖培养基为 WPM［Ca(NO3 ) 2 1 544 mg·L
－ 1］+ 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA3 0. 2 mg·L
－ 1 ; 最佳生根培
养方案为 1 /2 MS + IBA 2. 0 mg·L － 1 + 腐胺 1. 0 mg·L － 1，诱导初期冷处理 8 天; 1 级生根苗移栽 60 天后成活率
达 66. 67%。
关键词: 凤丹牡丹; 基因型; 硝酸钙; 植物生长调节剂; 生根; 驯化移栽
中图分类号: S723. 1; S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2016)05 － 0101 － 10
Establishment of in vitro Rapid Propagation
System for Tree Peony(Paeonia ostii)
Wang Xin1 Cheng Fangyun1，2 Zhong Yuan1 Wen Shusheng1 Li Liu Zemu1 Huang Nongzhang1
(1 ． College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University Beijing 100083;
2 ． National Engineering Research Center for Floriculture Beijing 100083)
Abstract: 【Objective】An in vitro rapid propagation protocol was developed for Paeonia ostii to provide new method for
the rapid propagation and cultivating elite varieties of oil tree peony． 【Method】Buds were collected as explants in spring
from selected individual plants of P． ostii and inoculated in the medium WPM + 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1 ．
Individuals or genotypes suitable for in vitro culture were selected by induction and multiplication ratios at initiation stage，
among which the optimal one was studied further to set up rapid propagation protocol． During multiplication， the
Ca(NO3 ) 2 concentrations in the basal medium and combinations of plant growth regulators ( PGRs: 6-BA，GA3，NAA，
KT and TDZ) were studied by single-factor and randomized block design． During root inducing phase，the effects of cold
treatments and IBA concentrations were evaluated by single-factor design． And at acclimation stage， in vitro rooted
plantlets were classified by the rooting quality and transplanted into a greenhouse to investigate their survival rates．
林 业 科 学 52 卷
【Result】1) The initiation performance of P． ostii in vitro culture was genotype-dependent． In 17 selected individuals
with high seed yield，7 individuals were suitable for in vitro initiation with induction rate≥50% and multiplication rate≥
2. 50，and the best FD10 ( induction rate = 100%，multiplication rate = 4. 58) was selected to set up rapid propagation
protocol． 2) The optimal multiplication medium was WPM (Ca(NO3 ) 2 1 544 mg·L
－ 1 ) + 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2
mg·L － 1，on which the highest multiplication rate (3. 87) was obtained after 40 days of culture． And 6 subcultures were
carried out． 3) By the effects of cold treatments and IBA concentrations in rooting，a two-step rooting protocol was set up．
The shoots were cultured in the medium 1 /2 MS + IBA 2. 0 mg·L － 1 + putrescine 1. 0 mg·L － 1 for 30 days ( including a
4 ℃ cold treatment of 8 days at the beginning) for root induction，and finished within 30 days，followed by culture in the
medium 1 /2 MS (double strength of CaCl2 ) + activated charcoal 4. 0 g·L
－ 1 for 20 days for root formation． The highest
rooting percentage (56. 67% ) was obtained． 4) The in vitro rooted plantlets were classified into 3 grades by their rooting
quality，and the percentage of grade 1 was 84%，while the grade 2 and grade 3 were 12. 5% and 3. 5% ． During
acclimatization the rooted plantlets were transferred into pots containing a mix of peat ∶ vermiculite ∶ perlite ( 1 ∶ 1 ∶ 1 by
volume) substrate． After 60 days，plantlets of the grade 1 that had less callus survived 66. 67%，but those plantlets that
had obvious callus development died away totally，indicating the rooting quality was really an essential factor for survival of
in vitro rooted plantlets of tree peony． 【Conclusion】The rapid cloning propagation of P． ostii was genotype-dependent，
and a rapid propagation protocol of FD10 was developed． The optimal medium for multiplication was WPM (Ca(NO3 ) 2
1 544 mg·L － 1 ) + 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA3 0. 2 mg·L
－ 1，and the protocol for optimal rooting was 1 /2MS + IBA
2. 0 mg·L － 1 + putrescine 1. 0 mg·L － 1，with 8 days cold treatment at the beginning of the rooting stage． The survival rate
of transplanted plantlets in grade 1 was 66. 67% 60 days after transplanting．
Key words: Paeonia ostii; genotype; Ca(NO3 ) 2 ; plant growth regulator; rooting; acclimatization and transplanting
我国每年食用油消费 3 000 万 t 以上，其中
60% 以上要靠进口，严重威胁着国家的食物安全
(王汉中，2007)。立足国内油料作物多元化种植，
重点扶持并培育高产量、高产值、高出油率的油料品
种，已成为国家粮油发展的主要战略，其中木本油料
作物已成为今后发展的重要方向之一。2014 年国
务院颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》，
首次把油用牡丹列为国家重点发展的木本油料作
物，并在全国范围内大力推广种植，但由于缺乏良种
壮苗，其推广种植受到极大限制。因此，筛选并培育
高产优质的油用牡丹优良品种，建立无性快繁技术，
成为目前我国油用牡丹产业发展迫切需要解决的
问题。
凤丹牡丹(Paeonia ostii)是由原种杨山牡丹(P．
ostii)长期栽培演化形成的药用栽培种，包含‘凤丹
白’( P． ostii‘Fengdan Bai’)、‘凤丹粉’( P． ostii
‘Fengdan Fen’) 等 多 个 品 种 ( 李 嘉 珏， 1999;
2006)。花色多样，花型多为单瓣，其根皮是著名中
药材“丹皮”，是我国传统的药用植物; 同时，因其生
长势与适应性强、种子产量多 (图 1A)且播种繁殖
方便，常作为嫁接观赏牡丹(P． suffruticosa)的砧木
使用(Cheng，2007)。近期研究表明，凤丹牡丹种子
出油率为 27% ～ 33%，籽油含大量不饱和脂肪酸
( ＞ 90% )，特别是 α － 亚麻酸含量达 39% 以上( Li
et al．，2015)。由于 α －亚麻酸对于保护心血管、抑
制癌症发生等具有显著的生理活性(Barcelo-Coblijn
et al．，2009)，具有较高的医疗保健价值，因此凤丹
牡丹籽油是具有巨大发展潜力的高端食用油，2011
年已被国家卫生部批准为新资源食品。然而，栽培
凤丹牡丹仍然保持着原种杨山牡丹专性种子繁殖的
特点(成仿云等，1997)，其播种苗不仅结实性等各
种性状分化明显，而且从种子到成熟植株开花结实
至少需要 5 ～ 6 年时间(陈让廉，2004)。因此，建立
优良单株无性快繁技术，生产无性系种苗，是实现凤
丹牡丹高产、稳产亟待解决的问题。
植物的无性快繁包括扦插、嫁接、组织培养等多
种方法，具有遗传稳定性高、繁殖速度快、经济价值
高 等 优 点，已 成 功 应 用 于 刺 槐 ( Robinia
pseudoacacia)、落羽杉 ( Taxodium distichum )、杉木
(Cunninghamia lanceolata)等多种木本植物(高明寿
等，1988; 欧阳磊等，2007)。就凤丹牡丹而言，种
子繁殖不能保持母本的优良特点; 在观赏牡丹中常
用嫁接和分株等常规无性繁殖技术，因繁殖系数低
而很难实现规模生产(曾瑞香等，2000)。因此，以
组织培养为基础的无性快繁技术，在凤丹牡丹种苗
生产中具有巨大发展潜力。
有关牡丹 ( Paeonia Sect． Moutan) 的组织培养
研究，自 Demoise 等(1969)首次报道以来，经过近半
201
第 5 期 王 新等: 凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
个世纪，国内外学者开展了大量研究，但至今尚未建
立能在生产中应用的技术体系(Cheng，2007; Qin et
al．，2012)。过去的研究，主要以观赏牡丹的不同品
种为主，少量研究包括了凤丹牡丹与紫斑牡丹(P．
rockii)(Qin et al．，2012)。过去以观赏牡丹研究为
主，由于凤丹牡丹的观赏价值不高，因而对其组织培
养的研究也较少。以凤丹牡丹鳞芽为外植体的微繁
殖研究，仅见 Beruto 等(2007)的报道，在培养 16 周
后获得了 2. 2 左右增殖率，但并未得到生根试管苗;
其他研究则零散地涉及以离体胚 (何桂梅等，
2006)、花药( Shoyama et al．，1990)、根(时侠清等，
2005)以及叶柄(李玉龙等，1984; 秦磊等，2012)等
为外植体进行的愈伤组织诱导，普遍存在愈伤组织
褐化严重、再分化率极低的问题，尚未建立成熟
体系。
已有研究发现，除生长调节剂是影响牡丹离体
培养的关键因素外，基本培养基中 Ca2 +浓度对于其
试管苗的增殖生长也起到重要作用，其浓度增加可
有效抑制玻璃化及茎尖坏死( Li et al．，2008; Bouza
et al．，1994a); 此外，生根培养阶段冷处理可促进试
管苗营养物质吸收，有效提高生根率 (贾文庆等，
2013; Beruto et al．，2004)。为此，本研究从前期筛
选出的 17 个高结实凤丹牡丹单株中，进一步筛选出
适宜离体培养的单株，并对最优株增殖阶段最佳
Ca2 +浓度和生长调节剂配比、生根阶段最佳冷处理
及 IBA 浓度，以及移栽阶段生根质量对成活率的影
响进行深入研究，首次建立了凤丹牡丹离体快繁技
术体系，为全面建立油用牡丹无性快繁技术体系奠
定了基础，也为油用牡丹种苗生产与新品种培育提
供一种新途径。
1 材料与方法
1. 1 鳞芽启动培养
本课题组自 2001 年以来，从安徽亳州、山东菏
泽、河南洛阳以及日本岛根县大根岛 (岛根大学青
木宣明教授赠送种子培育)等地，收集了大批不同
来源的凤丹牡丹种子，栽培保存于北京林业大学鹫
峰试验林场牡丹研究基地。本研究根据形态观察，
从中筛选出 17 个蓇葖果发育良好、结种量高的单
株，编号为 FD1—FD17，作为本研究的试验材料。
于 2014 年春季，在植株即将萌动时，剪取带有
饱满鳞芽的枝，带回实验室后取下鳞芽，剥除 1 ～ 2
层外层鳞片，流水冲洗 1 h，之后洗洁精溶液浸泡 10
min，再流水冲洗 15 min，吸干水分后置于超净工作
台上消毒灭菌处理。先用 70%乙醇表面灭菌 20 ～
30 s，再用 2% NaClO 溶液处理 14 ～ 15 min，无菌水
冲洗 6 次，剥去剩余鳞片及小叶，接种于 WPM +
6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1 (李萍，2007)
培养基上。每瓶接种 1 个外植体，每单株接种 10
瓶，重复 3 次。培养 14 天后调查统计芽诱导率［诱
导率(% ) = (芽萌发外植体数 /接种外植体数) ×
100］，培养 40 天后调查统计增殖系数(增殖系数 =
培养末期茎长≥1 cm 芽数 /接种芽数)，筛选适宜离
体培养的单株。
1. 2 芽增殖培养
以启动培养得到的 FD10 健壮苗(茎长≥1 cm)
为材料，按 Hosoki 等(1989)的方法进行切分后继代
培养，研究培养基中 Ca(NO3 ) 2 浓度及植物生长调
节剂(PGRs)配比对增殖的影响。首先，在附加 0. 5
mg·L － 16-BA 与 0. 2 mg·L － 1GA3 的 WPM 培养基中，
设置不同的 Ca ( NO3 ) 2 浓度［386 (原浓度)，772，
1 544，2 316，3 088 mg·L － 1共 5 个梯度］。然后，在
含最佳 Ca(NO3) 2 浓度的 WPM 培养基中，添加不同
的 PGRs 及其组合: 6-BA(0. 5，1. 0 mg·L － 1 ); 6-BA
(0. 5 mg·L － 1) + GA3(0. 1，0. 2，0. 4 mg·L
－ 1 ); 6-BA
(0. 5 mg·L － 1 ) + NAA ( 0. 1，0. 3，0. 5 mg·L － 1 );
6-BA(0. 5 mg·L － 1) + KT(0. 1，0. 3，0. 5 mg·L － 1 );
6-BA(0. 5 mg·L － 1) + TDZ(0. 002，0. 01，0. 05，0. 25
mg·L － 1)。最后，从上述试验结果获得最佳改良培
养基及 PGRs 组合。
增殖培养每处理接种 15 个芽，重复 3 次，40 天
后统计增殖系数、株高和玻璃化苗比率［玻璃化苗
比率(% ) = (玻璃化芽数 /培养末期芽数) × 100］。
1. 3 试管苗生根培养
采用两步生根法，即先把茎长≥1 cm 的 FD10
试管苗接种在诱导培养基［1 /2 MS + IBA 1. 0 mg·
L － 1 + 腐胺 1. 0 mg·L － 1］上黑暗条件下诱导生根 30
天，再转接到根形成培养基［1 /2 MS(CaCl2 加倍) +
活性炭 4. 0 g·L － 1］中光照条件下培养 20 天促进根
伸长生长。本试验在研究筛选出最佳诱导生根的冷
处理天数的基础上，进一步筛选有利于生根的 IBA
浓度。
1. 3. 1 冷处理天数对试管苗生根的影响 在根诱
导培养阶段，先用 4 ℃冷处理不同时间(0，6，8，10，
12，15 天)，再转正常培养温度条件继续暗培养至 30
天，然后转入根形成培养基继续培养。从试验结果
中总结获得最佳冷处理诱导的天数。
1. 3. 2 IBA 浓度对试管苗生根的影响 将试管苗
接种于添加不同浓度 IBA 的诱导培养基［1 /2 MS +
IBA(0，0. 5，1. 0，2. 0，4. 0 mg·L － 1 ) + 腐胺 1. 0 mg·
301
林 业 科 学 52 卷
L － 1］中，冷处理 8 天(上述试验获得的最佳处理)后
转入正常温度条件继续暗培养至 30 天，然后完成与
上述试验相同的根形成培养，研究得出最佳的 IBA
浓度处理。
生根培养每处理接种 20 个试管苗，重复 3 次，
培养末期统计生根率［生根率(% ) = (生根茎段数 /
培养茎段数) × 100］、根数和根长。
1. 4 驯化与移栽
将生根苗置于 4 ℃黑暗条件下冷藏 30 天解除
休眠(Bouza et al．，1992)，之后转至(24 ± 1)℃光照
环境闭瓶适应 1 周，开瓶锻炼 3 ～ 5 天，从瓶内取出
后洗净根部琼脂，之后将生根苗垂直于地面放置，测
量愈伤块中部位置宽度，并结合根茎发育情况将生
根苗分为 3 级。1 级苗: 宽度≤2 mm，基本无愈伤组
织; 根数≥2 条，长、绿色、端白; 茎部发育好，无茎
尖坏死(图 1G)。2 级苗: 2 mm≤宽度≤5 mm，基部
膨大，愈伤组织较小; 根数≥1 条，较长、绿色或灰
绿色、端白; 茎部发育良好，叶黄色或无叶(图 1H)。
3 级苗: 宽度 ＞ 5 mm，基部愈伤化严重，愈伤组织较
大; 根数 = 1 条，较短、多呈白色透明状; 茎上部无
叶(图 1I)。
移栽容器为 7 cm 边长的方形塑料花盆; 移栽
基质为经高压灭菌(121 ℃，40 min)的泥炭土 + 蛭
石 +珍珠岩(体积比 1 ∶ 1 ∶ 1)。移栽后立即用 0. 1%
多菌灵浇透，置于人工气候室［温度(20 ± 1) ℃，湿
度 70%，光照强度 32. 4 μmol·m － 2 s － 1，光照周期 14
h·d － 1］培养。移栽 15，30，60 天后，分别统计成
活率。
1. 5 培养条件
如无特殊说明，启动、增殖及生根培养基均附加
蔗糖 30 g·L － 1、琼脂 7. 0 g·L － 1，pH5. 8 ～ 5. 9; 培养
温度(24 ± 1) ℃ ; 日光灯照明，光照时数 14 h·d － 1，
光强 32. 4 μmol·m － 2 s － 1。
1. 6 数据处理
采用 SPSS 19. 0 数据分析软件进行方差分析，
运用邓肯式 ( Duncan ) 新复极差法进行多重比
较(P ＜ 0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 不同凤丹牡丹单株无菌诱导的差异
接种的凤丹牡丹鳞芽离体培养 14 天后，不同单
株诱导率出现差别，其中 FD10，FD12 及 FD14 为
100%，FD15，FD16 仅 25%，其余单株居中(表 1)。
离体培养 40 天后，各单株间增殖系数差异显著(表
1)，其中 FD10 为 4. 58，显著高于其他单株，且芽长
势健壮，无黄化及坏死现象 (图 1B); 而 FD1 和
FD14 增殖系数仅 1. 42，显著低于其他单株。以诱
导率≥50%、增殖系数≥2. 50 为标准，在供试 17 个
单株中，有 7 株适合进一步离体培养，包括 FD2，
FD4，FD6，FD8，FD10，FD11 和 FD12。本研究结合
各单株表现，选取增殖率最高、综合表现最优的
FD10 进行增殖及生根研究。
表 1 凤丹牡丹不同单株离体培养的诱导与增殖表现①
Tab． 1 The initiation and multiplication of different
P． ostii in vitro cultured plantlets
单株编号
Plantlet
No．
诱导率
Induction
rate(% )
增殖系数
Multiplication
rate
芽的质量等级
Quality
of shoots
FD1 58. 33 ± 7. 35 e 1. 43 ± 0. 08 f +
FD2 72. 73 ± 4. 38 d 3. 67 ± 0. 15 c + +
FD3 75. 00 ± 2. 78 cd 2. 22 ± 0. 36 e + +
FD4 57. 14 ± 2. 74 e 3. 44 ± 0. 20 c + + +
FD5 72. 73 ± 4. 38 d 1. 50 ± 0. 11 f +
FD6 76. 47 ± 3. 07 cd 4. 08 ± 0. 14 b + + +
FD7 87. 50 ± 2. 17 b 2. 15 ± 0. 07 e +
FD8 88. 24 ± 2. 16 b 2. 67 ± 0. 27 d + +
FD9 87. 50 ± 2. 41 b 1. 90 ± 0. 13 e + +
FD10 100. 00 ± 0. 00 a 4. 58 ± 0. 23 a + + +
FD11 80. 95 ± 8. 08 c 2. 58 ± 0. 29 d + +
FD12 100. 00 ± 0. 00 a 3. 78 ± 0. 10 bc + +
FD13 46. 15 ± 3. 34 f —
FD14 100. 00 ± 0. 00 a 1. 43 ± 0. 12 f + +
FD15 25. 00 ± 0. 00 h —
FD16 25. 00 ± 5. 00 h —
FD17 33. 33 ± 0. 00 g —
①表中所列数据为平均数 ± 标准差; 不同小写字母表示 P ＜
0. 05 差异显著水平。芽的质量等级 + + + : 粗壮; + + : 健壮;
+ : 细弱。下同。Data represent means ± standard error，and different
letters indicate significant differences at P ＜ 0. 05． Quality of shoots
+ + + : Strong and thick; + + : Strong; + : Weak and thin． The same
below．
2. 2 凤丹牡丹单株 FD10 的增殖培养
2. 2. 1 Ca(NO3 ) 2 浓度对芽增殖的影响 试验结
果表明，随着 WPM 基本培养基中 Ca(NO3) 2 浓度的
增加，试管苗增殖系数及平均株高均呈先增后降趋
势(表 2)，且均在 1 544 mg·L － 1时达最佳; 此时玻
璃化 苗 比 率 最 低，丛 生 芽 较 多、长 势 健 壮。
Ca(NO3) 2浓度过低，产生的不定芽生长量小、茎秆
细弱、易玻璃化; 浓度过高，增殖系数下降、叶片变
小且卷曲萎缩(图 1C)。
401
第 5 期 王 新等: 凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
图 1 凤丹牡丹鳞芽离体快繁体系
Fig． 1 Rapid propagation from shoots culture in vitro of Paeonia ostii
A:凤丹牡丹成熟种子; B:鳞芽启动培养 40 天后的 FD10 丛生芽; C: 不同 Ca(NO3 ) 2 处理继代培养 40 天后的 FD10 丛
生芽(由左至右浓度依次为 386，772，1 544，2 316，3 088 mg·L － 1 ) ; D － F: 不同植物生长调节剂处理继代培养 40 天后
的 FD10 丛生芽(D: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 ; E: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1 ; F: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + TDZ 0. 25 mg
·L － 1 ) ; G － I:不同生根质量的 FD10 生根苗(G: 1 级苗; H: 2 级苗; I: 3 级苗) ; J: 移栽 15 天后的 FD10 组培苗; K:
移栽 60 天后的 FD10 组培苗。
A: The mature seeds of P． ostii; B: The FD10 shoot cluster induced from buds 40 days after initial culture; C: The FD10
shoot cluster 40 days after subculture under different treatments of Ca(NO3 ) 2 concentration (386，772，1 544，2 316，3 088
mg·L － 1 from left to right) ; D － F: The FD10 shoot cluster 40 days after subculture under different treatments of plant growth
regulators (D: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 ; E: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1 ; F: 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + TDZ 0. 25 mg·L － 1 ) ;
G － I: The FD10 rooted plantlets with different rooting quality (G: Grade 1; H: Grade 2; I: Grade 3) ; J: The FD10 plantlets
15 days after transplanted; K: The FD10 plantlets 60 days after transplanted．
表 2 Ca(NO3 ) 2 浓度对凤丹牡丹(FD10)芽增殖和生长的影响
Tab． 2 Effect of Ca(NO3 ) 2 concentration on the multiplication and growth of P． ostii (FD10) in vitro cultured shoots
Ca(NO3 ) 2 /
(mg·L － 1 )
增殖系数
Multiplication rate
株高
Height / cm
玻璃化苗比率
Vitrification rate(% )
芽的质量等级
Quality of shoots
386 2. 36 ± 0. 40 c 6. 39 ± 1. 41 ab 0. 75 ± 0. 12 a + +
772 2. 62 ± 0. 32 ab 5. 76 ± 1. 24 b 0. 30 ± 0. 15 b + +
1 544 3. 07 ± 0. 59 a 7. 03 ± 1. 50 a 0. 28 ± 0. 15 b + + +
2 316 2. 81 ± 0. 33 ab 6. 73 ± 1. 56 ab 0. 36 ± 0. 18 b + + +
3 088 2. 50 ± 0. 22 c 6. 74 ± 1. 34 ab 0. 40 ± 0. 24 b + +
501
林 业 科 学 52 卷
2. 2. 2 植物生长调节剂对芽增殖的影响 试验表
明，不同 PGRs 对芽增殖影响的程度不同 (表 3)。
6-BA单独使用处理间无明显差异，增殖系数仅为
1. 15，茎伸长生长受抑(图 1D)，无法促进丛生芽大
量增殖。在 0. 5 mg·L － 16-BA 基础上，分别添加不同
浓度的 GA3，NAA，KT 和 TDZ，试验结果显示，GA3
对促进增殖及生长效果最好，其次是 NAA 和 KT，效
果最差的是 TDZ。在 GA3 浓度为 0. 2 mg·L
－ 1时，增
殖系数为 3. 87，平均株高 6. 18 cm，显著高于其他处
理，且试管苗生长健壮、节间较长(图 1E)，有利于继
续继代培养。在 NAA，KT 和 TDZ 处理中，增殖系数
最高分别为 2. 75，3. 04 和 2. 49，均显著低于0. 2 mg·
L － 1GA3 处理，而且 NAA 处理后愈伤组织发达，TDZ
处理随浓度增加植株节间缩短、愈伤组织膨大明显
(图 1F)，均不利于继续继代培养。
表 3 植物生长调节剂对凤丹牡丹(FD10)芽增殖和生长的影响
Tab． 3 Effect of plant growth regulators on the multiplication and growth of P． ostii (FD10) in vitro cultured shoots
处理
Treatments /(mg·L － 1 )
增殖系数
Multiplication rate
株高
Height / cm
芽的质量等级
Quality of shoots
6-BA0. 5 1. 15 ± 0. 08 f 3. 05 ± 1. 17 cd +
6-BA1. 0 1. 08 ± 0. 10 f 3. 09 ± 0. 39 cd +
6-BA0. 5 + GA30. 1 2. 23 ± 0. 20 e 4. 26 ± 1. 52 b + +
6-BA0. 5 + GA30. 2 3. 87 ± 0. 24 a 6. 18 ± 0. 91 a + + +
6-BA0. 5 + GA30. 4 2. 76 ± 0. 50 bcd 4. 41 ± 1. 27 b + +
6-BA0. 5 + NAA0. 1 2. 70 ± 0. 48 bcd 3. 61 ± 0. 69 c +
6-BA0. 5 + NAA0. 3 2. 75 ± 0. 42 bcd 2. 79 ± 0. 75 d + +
6-BA0. 5 + NAA0. 5 2. 66 ± 0. 40 bcd 3. 17 ± 0. 65 cd + +
6-BA0. 5 + KT0. 1 2. 87 ± 0. 18 bc 3. 58 ± 0. 76 c + +
6-BA0. 5 + KT0. 3 3. 04 ± 0. 48 b 3. 59 ± 0. 66 c + +
6-BA0. 5 + KT0. 5 2. 50 ± 0. 41 cde 3. 03 ± 0. 52 cd + +
6-BA0. 5 + TDZ0. 002 2. 49 ± 0. 27 cde 3. 09 ± 0. 47 cd +
6-BA0. 5 + TDZ0. 01 2. 39 ± 0. 19 de 3. 05 ± 0. 71 cd + +
6-BA0. 5 + TDZ0. 05 2. 20 ± 0. 17 e 2. 76 ± 0. 59 d + +
6-BA0. 5 + TDZ0. 10 2. 26 ± 0. 13 e 2. 70 ± 0. 66 d + +
6-BA0. 5 + TDZ0. 25 2. 21 ± 0. 13 e 2. 83 ± 0. 50 d + +
由上述试验可以确定，单株 FD10 最佳增殖培
养方案为改良 WPM 培养基［Ca(NO3 ) 2 1 544 mg·
L － 1］+ 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1。在此
培养条件下，单株 FD10 以 40 天为继代周期，可连
续继代 6 次，增殖系数保持在 3 ～ 4，试管苗生长健
壮，无玻璃化及褐化现象; 6 次之后试管苗长势减
弱，增殖系数下降。
2. 3 凤丹牡丹单株 FD10 的生根培养
2. 3. 1 冷处理天数对试管苗生根的影响 试验结
果表明，冷处理天数对试管苗生根率有显著影响、并
且与生根质量有关(表 4)。未经冷处理的试管苗生
根率为 0; 随冷处理天数增加，生根率呈先增后降趋
势，在冷处理 8 天时达到峰值(30% )，显著高于其
他处理。同时，愈伤组织发育与冷处理密切相关
(表 4)，在冷处理 10 天内，试管苗基部均无明显愈
伤组织形成; 在冷处理超过 12 天后，基部愈伤组织
开始膨大; 冷处理 15 天时愈伤组织膨大十分明显。
因此，根据上述试验结果可以认为，冷处理 8 天为最
佳处理时间，生根率高，愈伤组织极少，生根质量高
(图 1G)。
表 4 冷处理天数对凤丹牡丹(FD10)试管苗生根的影响①
Tab． 4 Effect of cold treatment days on in vitro rooting of P． ostii (FD10) shoots
冷处理天数
Cold treatments / d
生根率
Rooting percentage(% )
平均根数
Average number of roots
平均根长
Average length of roots /mm
愈伤组织等级
Callus formation
0 0 — — —
6 3. 33 ± 0. 16 b 1. 50 ± 0. 71 a 35. 00 ± 4. 60 ab 1
8 30. 00 ± 0. 73 a 1. 39 ± 0. 50 a 48. 64 ± 2. 40 a 1
10 15. 71 ± 0. 34 b 1. 73 ± 0. 90 a 24. 42 ± 7. 31 b 1
12 15. 71 ± 0. 76 b 1. 73 ± 0. 90 a 31. 95 ± 6. 77 ab 2
15 6. 25 ± 0. 16 b 1. 60 ± 0. 89 a 48. 25 ± 2. 51 a 3
①表中所列数据为平均数 ±标准差，不同小写字母分别表示 P ＜ 0. 05 差异显著水平。愈伤组织等级 1: 愈伤组织极少; 2: 基部膨大，有轻
微愈伤组织; 3: 愈伤组织较多。下同。Data represent means ± standard error，and different letters indicate significant differences at P ＜ 0. 05． Callus
formation 1: Nearly no callus; 2: Small callus; 3: Large callus． The same below．
601
第 5 期 王 新等: 凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
2. 3. 2 IBA 浓度对试管苗生根的影响 试验结果
表明，不同 IBA 浓度对试管苗生根的影响差异显著
(表 5)。随 IBA 浓度增加，生根率、生根数及根长呈
先增后降趋势。当 IBA 浓度为 0 时，生根率为 0; 浓
度为 2. 0 mg·L － 1时，生根率为 56. 67%，显著高于其
他处理，平均根长 22. 15 mm，且生根苗基部愈伤组
织极少、生长健壮 (图 1G)，是本试验的最佳处理;
当 IBA 浓度增加到 4. 0 mg·L － 1时，生根率也较高
(45. 00% )，但试管苗基部产生大量愈伤组织 (图
1H，I)，影响后期移栽成活。
表 5 IBA 浓度对凤丹牡丹(FD10)试管苗生根的影响
Tab． 5 Effect of IBA concentration on in vitro rooting of P． ostii (FD10) shoots
IBA /(mg·L － 1 )
生根率
Rooting percentage(% )
平均根数
Average number of roots
平均根长
Average length of roots /mm
愈伤组织等级
Callus formation
0 0 — — —
0. 5 13. 33 ± 0. 16 d 1. 33 ± 0. 58 a 6. 25 ± 3. 30 b 1
1. 0 25. 00 ± 0. 47 c 1. 50 ± 1. 00 a 23. 17 ± 4. 33 a 1
2. 0 56. 67 ± 0. 33 a 1. 63 ± 0. 41 a 22. 15 ± 3. 93 a 1
4. 0 45. 00 ± 0. 25 b 1. 29 ± 0. 76 a 12. 56 ± 1. 38 ab 3
由上述试验可以确定，单株 FD10 最佳生根培
养方案为培养基 1 /2 MS + IBA 2. 0 mg·L － 1 +腐胺
1. 0 mg·L － 1、诱导初期冷处理 8 天。将继代培养 6
次后的试管苗接种在此生根条件下，经两步生根法
及解除休眠处理后，得到可用于驯化移栽的生根苗。
2. 4 凤丹牡丹单株 FD10 的驯化与移栽
继代培养 6 次后所得生根苗中，1 级苗占比
84%，2 级苗占比 12. 5%，3 级苗占比 3. 5%。将各
级生根苗分别进行移栽成活率统计，结果发现，生根
苗质量与移栽成活率密切相关，基部愈伤组织越大，
越不利于移栽成活(表 6)。愈伤组织较少的 1 级生
根苗移栽 15 天后成活率达 83. 33%，新叶嫩绿、萌
发后逐渐开展(图 1J); 60 天后成活率为 66. 67%，
叶片浓绿、生长正常(图 1K)。而愈伤组织较多的 2
级和 3 级生根苗生长弱，后期逐渐死亡。
表 6 生根质量对凤丹牡丹(FD10)生根苗
移栽成活率的影响
Tab． 6 Effect of rooting quality on survival rate of
P． ostii (FD10) plantlets
生根质量
Rooting quality
成活率 Survival rate(% )
15 d 30 d 60 d
1 级 Class 1 83. 33 83. 33 66. 67
2 级 Class 2 56. 00 24. 00 0
3 级 Class 3 0 0 0
3 讨论
3. 1 基因型选择是建立凤丹牡丹离体快繁技术的
基础
大量研究表明，牡丹对离体培养及其培养条件
的反应因品种即基因型不同而异(Qin et al．，2012)。
具体表现在 2 个方面: 其一是不同品种在相同培养
基及培养条件下，其增殖、生根及生长状况等多存在
明显差异(Beruto et al．，2007); 其二是同一品种在
离体快繁不同阶段所需基本培养基、PGRs 以及其他
培养条件等也各不相同(Li et al．，2008; Wang et al．，
2001)。凤丹牡丹具有长期异花授粉与种子繁殖的
特性，已成为一个遗传上相当杂合的栽培品种群
(Yuan et al．，2014); 其播种苗单株的性状，包括结
实性在内都存在明显差异。因此，以油用栽培为目
的的离体快繁技术，必须建立在基因型(优良单株)
选择的基础上才有实际应用价值。为此，本试验对
17 个高结实凤丹牡丹单株进行了离体启动培养的
筛选，结果表明以离体诱导率≥50%及增殖系数≥
2. 50 为标准，其中有 7 个单株适合进行离体培养，
而大多数单株并不适合，这与观赏牡丹中离体培养
高度依赖基因型的结论一致 ( Qin et al．，2012;
Beruto et al．，2004; 2007)。正是基于这一认识，本
研究又从 7 个优良单株中，选择表现最优的 FD10
(启动诱导率 100%，增殖系数 4. 58)进行了离体快
繁技术体系研究。
3. 2 体系化是凤丹牡丹离体快繁技术的关键
植物离体快繁技术，是由包括启动培养、增殖、
生根与驯化移栽 4 个阶段组成的技术体系 (成仿
云，2012)。基于对牡丹离体快繁高度依赖于基因
型的基本认识与相关研究结果，本研究对凤丹牡丹
离体快繁的各个环节分别进行了优化筛选，旨在确
保技术的完整性、实现技术的体系化。
在启动培养阶段，本研究使用 WPM 培养基附
加 6-BA 0. 5 mg·L － 1 与 GA3 0. 2 mg·L
－ 1 (李萍，
2007)，在相同条件下筛选出适宜离体诱导的单株，
选择表现最优的 FD10 单株进行深入研究。在增殖
培养阶段，本研究重点是通过探究培养基中 Ca2 +含
量与 PGRs 的种类及浓度，筛选出增殖系数高、丛生
芽生长健壮的组合。WPM 培养基是木本植物组织
701
林 业 科 学 52 卷
培养专用培养基( Lloyd et al．，1980 )，其中 Ca2 + 以
CaCl2 和 Ca(NO3) 22 种形式存在，Cl
－浓度过高易导
致植株玻璃化(Quoirin et al．，1977)。本研究在李萍
(2007)研究基础上，以 WPM + 6-BA 0. 5 mg·L － 1 +
GA30. 2 mg·L
－ 1为增殖培养基，发现提高 Ca(NO3 ) 2
浓度至 1 544 mg·L － 1 (原浓度 4 倍)时，单株 FD10
的增殖系数由 2. 36 增至 3. 07，而且玻璃化苗少、无
茎尖坏死现象。Bouza 等(1994a)指出，提高 MS 培
养基中 CaCl2 浓度，可有效降低牡丹试管苗玻璃化
及茎尖坏死现象的发生; Li 等(2008)研究发现，降
低 MS 培养基中 NH+4 -N /NO
－
3 -N 比值，可促进牡丹试
管苗增殖及生长。本研究中，Ca(NO3 ) 2 浓度的增
加在提高 Ca2 + 浓度的同时，降低了NH +4 -N /NO
－
3 -N
比值，从而显著促进了 FD10 试管苗增殖和生长。
因此，在一定范围内提高 WPM 培养基中 Ca(NO3 ) 2
浓度，是促进凤丹牡丹丛生芽增殖生长的有效途径。
植物生长调节剂( PGRs)对牡丹试管苗的增殖
和生长起着关键作用，不同种及品种对其种类、浓度
等存在感受性差异(Qin et al．，2012)。在各类细胞
分裂素中，6-BA 使用最为广泛(Bouza et al．，1994a;
Albers et al．，1992)，然而，其单独使用时增殖率较
低，且无法促进试管苗的高生长 ( Gabryszewska，
1998)，这与本研究的结果一致; 6-BA 只有与 GA3
(Bouza et al．，1992; 1994a; 1994b)、NAA (孟清秀
等，2011)、KT(李玉龙等，1984)等配合使用，才有
利于不定芽的增殖及向高生长。本研究将 6-BA 与
GA3，NAA，KT，TDZ 配合使用，结果表明: 0. 5 mg·
L － 16-BA 与 0. 2 mg·L － 1 GA3 配合使用，在继代周期
为 40 天情况下，能实现 3. 87 的增殖系数，且试管苗
生长健壮、节间伸长明显、愈伤组织发育不明显，是
凤丹牡丹 FD10 试管苗离体增殖最佳 PGRs 组合;
而使用 NAA，KT 和 TDZ 与 6-BA 组合处理中，试管
苗增殖系数均较低，且愈伤组织较发达或节间距缩
短，不利于增殖培养。
生根困难一直是观赏牡丹离体快繁技术研究的
难题(Wang et al．，2001; Qin et al．，2012)，提高生根
率与生根质量，同样也是建立凤丹牡丹离体快繁技
术的关键。牡丹、马大杂种相思( Acacia mangium ×
A． auriculiformis)、巨桉 ( Eucalyptus grandis)等多种
木本植物组织培养生根阶段常用 1 /2 MS 培养基
(Qin et al．， 2012; 施 琼 等， 2014; 石 大 兴 等，
2003)，添加一定浓度(1. 0 mg·L － 1 )的腐胺可有效
提高紫斑牡丹多个品种的试管苗生根率 (邱金梅，
2010)。已有研究表明，4 ℃左右暗培养条件可抑制
酶活性、减少酚类物质氧化、促进试管苗营养物质吸
收，从而促进其生根(贾文庆等，2013; Beruto et al．，
2004); 此外，生长素类物质中，以 IBA 诱导生根效
果最好，其最佳使用浓度因品种不同而异(Albers et
al．，1992; Beruto et al．，2007; Wang et al．，2012; 李
萍，2007)。本研究在两步生根法的根原基诱导阶
段，以 1 /2 MS(CaCl2 加倍) + 腐胺 1. 0 mg·L
－ 1为基
本生根培养基，选取 4 ℃处理时间及 IBA 浓度为研
究对象，结果表明，4 ℃低温诱导处理 8 天，结合在
培养基中添加 2. 0 mg·L － 1 IBA，生根率最高，且基部
愈伤组织少，利于后期移栽成活，这与贾文庆等
(2013)和李萍(2007)的结论相一致。
驯化移栽是植物离体快繁技术的最后一个阶
段，也是需要克服的又一个障碍。大量研究表明，牡
丹生根苗的质量直接影响后期移栽成活，获得高质
量的生根苗是后期移栽成活的关键 ( Qin et al．，
2012; 邱金梅，2010)。本研究将单株 FD10 继代 6
次后的试管苗进行生根，并将生根苗以愈伤组织大
小为主要分级标准，分为 3 级分别进行移栽，60 天
后仅没有明显愈伤组织形成的 1 级苗移栽成活率为
66. 67%，2 级与 3 级苗则逐渐全部死亡。生根苗基
部愈伤组织越多，移栽成活率越低，这与观赏牡丹的
表现一致。其原因一方面是由于大量愈伤组织发生
时，根茎间形成离层、使不定根与茎间的维管组织连
接不畅，阻碍了养分和水分的吸收 (贾文庆等，
2013); 另一方面是移栽后愈伤组织极易腐烂导致
植株死亡(Qin et al．，2012)。因此，进一步提高组培
苗生根质量，不仅是优化凤丹牡丹离体快繁技术体
系中第 3 阶段生根、也是第 4 阶段移栽的重要问题，
是关系到油用牡丹离体快繁技术能否进入实际应用
的关键，值得进一步深入研究。
4 结论
本研究从基因型筛选入手，从 17 个高产凤丹牡
丹单株中筛选出 7 个适宜启动培养的单株，并针对
优株 FD10 在增殖、生根及移栽阶段存在的问题，开
展系统的试验研究，首次建立了凤丹牡丹离体快繁
技术体系: 初春采鳞芽外植体，在 WPM + 6-BA
0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·L
－ 1培养基中启动离体培
养; 最 佳 增 殖 培 养 方 案 为 WPM［Ca ( NO3 ) 2
1 544 mg·L － 1］+ 6-BA 0. 5 mg·L － 1 + GA30. 2 mg·
L － 1; 最佳生根培养方案为培养基 1 /2 MS + IBA
2. 0 mg·L － 1 + 腐胺 1. 0 mg·L － 1，诱导初期冷处理 8
天; 生根质量是试管苗移植成活的关键，在所得生
根苗 中，1 级 苗 占 比 84%，移 栽 60 天 后 成 活
率 66. 67%。
801
第 5 期 王 新等: 凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
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(责任编辑 徐 红)
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