全 文 ：第 51 卷 第 1 期
2 0 1 5 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 1
Jan．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150107
收稿日期: 2013 － 11 － 07; 修回日期: 2014 － 11 － 09。
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项“重大森林病虫灾害防控技术的关键理论基础”(201204501) ; 黑龙江省自然科学基金项目项目
(ZD201404) ; 中央高校基本科研业务费专项资金项目(DL13BA01)。
* 马玲为通讯作者。
松材线虫乙酰胆碱酯酶 1基因沉默及蛋白抑制剂*
刘立宏 王 峰 马 玲 王步勇 陈俏丽 刘晓晗 董婉莹 薛 羿
(东北林业大学 哈尔滨 150040)
摘 要: 【目的】为提高苦参碱的杀虫效果，对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶 1 基因 ( BxACE1 )进
行研究。【方法】松材线虫采集自广东省内马尾松，贝曼漏斗法分离，灰葡萄孢菌苔上25 ℃ 避光培养扩繁线
虫。克隆 BxACE1 基因全长并进行序列分析，通过基因沉默和蛋白抑制 2 种技术阻断该基因功能，研究苦参
碱的杀虫效果，并应用 Q － PCＲ 技术鉴定 ＲNAi 效果。【结果】5 和 3 序列拼接得到基因全长 2 145 bp，命名
为 BxACE1。同源序列多序列比对表明线虫 ACE 的进化速度与线虫进化速度一致。蛋白质三维结构分析表
明，BxACE1 由 14 个 α 螺旋包围着 13 个 β 折叠，鉴于氢键数量越多结合越稳定，利用 docking 技术筛选出石
杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶 1 蛋白的较佳抑制剂。ＲNAi 明显增加了苦参碱的杀虫效果，石杉碱甲本身
对线虫毒性较小，共同施用 ＲNAi 和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小，但 ＲNAi 处理组线虫与 Inhibitor( 0 ． 03%
苦参碱 + 1μmol·L － 1石杉碱甲处理线虫 )处理组线虫在 24，48 及 72 h 存活率差异不显著，表明石杉碱甲处理
线虫和 BxACE1 基因 ＲNAi 处理效果相近。【结论与其他】通过基因沉默和蛋白抑制 2 种技术阻断 BxACE1 功
能均可以提高苦参碱的杀虫效果，ＲNAi 技术能够简单易行地证明若阻断 BxACE1 功能可以提苦参碱的杀虫
效果，但 dsＲNA 容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用。石杉碱甲可以与 BxACE1 稳定结
合，鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果，具有生防药剂辅剂的开发潜力，可替代基因沉默技术实
现抑制 BxACE1 的目的。因此，通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断 BxACE1 的功能，进而达到提高苦
参碱等植物源药剂杀虫效果的目的。ACEIs 通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性，使线虫体内的胆碱
水平短时间内大量提高，从而导致其中毒死亡。该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸
酯类化合物，大多为非可逆型 ACEIs。石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱，是一种
高效、高选择性、可逆性的 ACEIs。本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究，是对该植物源药剂的一个新
尝试。
关键词: 松材线虫; 乙酰胆碱酯酶; 石杉碱甲; 抑制剂; 苦参碱; ＲNA 干扰
中图分类号: S432. 1 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)01 － 0066 － 08
BxACE1 Gene ＲNAi and Protein Inhibition of Acetylcholinesterase in
Pine Wood Nematode Bursaphelenchus xylophilus
Liu Lihong Wang Feng Ma Ling Wang Buyong Chen Qiaoli Liu Xiaohan Dong Wanying Xue Yi
(Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: 【Objective】Bursaphelenchus xylophilus(nematode)，the causative agent of pine wilt disease，has devastated
pine forests for a long time． A safe and efficient technique is needed urgently to control the nematode and prevent the pine
wilt disease． The previous studies indicated that the matrine is not suitable for preventing the pine wilt disease although it
is an environmentally friendly biocontrol agent． To develop low toxicity and effecient nematicides，the gene，function and
protein inhibition of acetylcholinesterase 1 in pine wood nematode B． xylophilus，was studied．【Method】The B． xylophilus
populations used in this study were collected from Guangdong Province in 2007． The host is masson pine ( Pinus
massoniana) ． The nematodes were separated by the Behrman funnel method，cultured at 25 ℃ without light and fed on
Botrytis cinerea moss． The gene，function and protein inhibition of acetylcholinesterase 1，was studied． The full-length of
第 1 期 刘立宏等: 松材线虫乙酰胆碱酯酶 1 基因沉默及蛋白抑制剂
BxACE1 gene was cloned and the sequence was analysed． The BxACE1 gene function was silenced by the method of ＲNAi
and inhibited by proteins inhibitor to study the insecticidal effect of matrine． In the meantime，Q-PCＲ was used to identify
ＲNAi effects．【Ｒesult】A total of 2 145 bp full-length gene was obtained by splicing 5 and 3 sequence，named BxACE1 ．
Homologous sequences of multiple sequence alignment showed that the nematode ACE evolution speed was consistent with
nematodes． Protein 3D structure analysis showed that BxACE1 was 13 β-fold surrounded by 14 α-helix． In view of the fact
that the more hydrogen bonds in combination with the more stable，the huperzine A was selected as a more efficient
inhibitor of acetylcholinesterase 1 protein by docking technique． Huperzine A itself had low toxicity to nematodes and the
common aplication of ＲNAi and huperzine A had still low toxicity to nematodes，but the nematodes survivals in 24 h，48 h
and 72 h after ＲNAi treatment and inhibitor ( treated nematodes with 0． 03% matrine + 1 μmol·L － 1 Huperzine )
treatment were not significantly different with each other indicating that Huperzine A and ＲNAi BxACE1 genes had similar
treatment effects to nematodes．【Conclusion and other】The results indicated that the nematicidal activity of matrine was
improved after the BxACE1 was silenced by the method of ＲNAi or the BxACE1 was inhibited． ＲNAi technology easily
proved that blocking BxACE1 gene function could improve the nematicidal effect of matrine，while dsＲNA could degrade
easily，which limited the extensive application of the technique in production practice． Huperzine A，screened with
docking technique，was able to combine with BxACE1 stabily． Appraisal of inhibitory effects of inhibitors showed that
huperzine A improved the nematicidal effect of matrine，which had the development potential as bio-control auxiliary
agents，could be used as an alternative of gene silencing technology that inhibited acetylcholinesterase 1 gene of
nematodes． Therefore，this study further put forward that huperzine A，the acetylcholinesterase inhibitor，used to block
BxACE1 gene function could improve the effects of botanical nematicidal like matrine and so on． Through inhibition of
ACE，ACEIs made the acetylcholine accumulate in the synaptic clearance，and hence made the effect time of acetylcholine
longer． ACEIs caused the choline levels to increase acutely in a short period of time by inhibiting nematodes
acetylcholinesterase activity，which resulted in the poisoning death of nematodes． The representative pesticides class are
organophosphorus compounds and carbamate compounds，most of which were non-reversible ACEIs． Huperzine A is a half
terpene alkaloid derived from Huperziaceae plants，Huperzia serrata，and is a kind of high efficient，high selective，and
reversible ACEIs． In this study，huperzine A was introduced to B． xylophilus，which was a new attempt to apply the
botanical source medicament．
Key words: Bursaphelenchus xylophilus; acetylcholinesterase; huperzine A; inhibitor; matrine; ＲNAi
乙酰胆碱酯酶 ( acetylcholinesterase，ACE)在生
物神经传导中具有关键性作用，可降解乙酰胆碱，终
止神经传递对突触后膜兴奋的刺激作用，确保神经
信号正常传递，是有机磷( organophosphates)和氨基
甲酸酯 ( carbamates)类杀虫剂的作用靶标。目前，
已克隆到秀丽线虫(Caenorhabditis elegans) (Martine
et al．，1994) 和甘薯茎线虫 ( Ditylenchus destructor)
(丁中等，2010; 2008a; 2008b)等多种线虫的 ACE
基因。秀丽线虫的 ACE 编码基因有 CeACE1，
CeACE2，CeACE3 和 CeACE4。ACE1 是有机磷类和
氨基甲酸酯类化合物的作用靶标。ACEl 和 ACE2
的主要区别在于 ACEl 中缺少一个含有 31 个氨基
酸的“亲水肽片段”(Arpagaus et al．，1994)，但 ACEl
和 ACE2 在功能上可相互补偿。已报道的松材线虫
(Bursaphelenchus xylophilus) ACE 基因有 BxACE1，
BxACE2 和 BxACE3( Jae et al．，2011)，并有应用有机
磷 类 和 氨 基 甲 酸 酯 类 ACE 抑 制 剂
( acetylcholinesterase inhibitors，ACEIs)防治松材线
虫的相关研究( Jae et al．，2012)。本研究在此基础
上开发植物源 ACE 抑制剂用于松材线虫防治，可以
避免有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂引起的环境污染
以及害虫抗药性等问题。
目前阻断 ACE 基因功能的技术有 2 种:一种是
ＲNA 干扰(ＲNAi)技术，即通过 dsＲNA 介导的基因
沉默阻断 ACE 基因在线虫体内的表达;另一种是通
过 ACEIs 抑制 ACE 蛋白功能，同样可以达到阻断
ACE 基因功能的目的。ＲNAi 技术简单易行，只要
已知基因序列即可合成相应的 dsＲNA，通过浸泡或
注射等技术将 dsＲNA 导入线虫体内即可介导相应
基因沉默;但由于 dsＲNA 容易降解，因此该技术更
适用于实验室内验证基因功能等试验。若应用于生
产实践，采用 ACEIs 与植物源药剂同时施用的技术
则更具优势。通过 ACEIs 抑制 ACE 蛋白功能，又有
2 种方法:一种是应用有机磷类或氨基甲酸酯类
ACEIs，另一种是应用非共价结合的植物源 ACEIs。
非共价结合的 ACEIs 可以减少对人和动物的危害，
76
林 业 科 学 51 卷
具有良好的发展前景。
苦参碱、α 蒎烯等植物源农药具有安全无公害
的特性，但杀虫效果不理想。Matsuda 等 (1989)研
究发现苦参碱及其衍生物对松材线虫的杀虫活性很
弱。为了有效提高苦参碱的药效，本研究采用 ＲNAi
技术研究 ACE 基因沉默对苦参碱杀虫活性的增效
作用，并在此基础之上筛选出更适合推广应用的植
物源 ACEIs 即石杉碱甲。
1 材料与方法
1. 1 线虫培养及 ＲNA 提取
试验所用松材线虫种群于 2007 年采集自广东
省，寄主为马尾松 ( Pinus massoniana)。采用贝曼
漏斗法分离，在灰葡萄孢 ( Botrytis cinerea)菌苔上
25 ℃避光培养，扩繁线虫。用 M9 缓冲液( Sulston
et al．，1988)清洗线虫(卵 ∶ 幼虫 ∶ 成虫 = 1 ∶ 2 ∶ 3)后
液氮研磨，应用 TＲIzol( Invitrogen，Cat． No． 15596-
026)提取线虫总 ＲNA，DNase I( ＲNase-free) 37 ℃
处理 ＲNA 20 min，重新抽提后 － 80 ℃ 保存，供基
因克隆所用。
1. 2 BxACE1 基因全长克隆及序列分析
对本课题组 2007 年构建的松材线虫 cDNA 文
库 EST 测序结果(王峰，2008; Wang et al．，2012)进
行 BLASTN 比对，鉴定到 ACE 基因序列片段，根据
该序列设计 5 ＲACE 引物( Bx-ACE1-3 F: 5-ATC
CCG CCA AGA GTT GAG TC -3) 和 3 ＲACE 引物
(Bx-ACE1-5 Ｒ: 5-GAG CCA TCA TCC AAA GCG
GA -3)，于 2009 年采用 Clontech 公司的 Marathon
ＲACE 试剂盒 ( Cat． No． 634913)进行基因全长克
隆，PCＲ 产物连接 pGEM-T Easy Vector 转化到大肠
埃希菌(Escherichia coli)DH5α 感受态细胞，送上海
生工进行 DNA 测序。
全长基因序列应用 OＲF-Finder 进行开放阅读
框分 析，翻 译 氨 基 酸 序 列。 BLASTX /BLASTP
(Stephen et al．，1997)筛选 NCBI 收录的同源序列，
Clustal W 进行多序列比对。应用 PSIPＲED server
对 BxACE1 进行蛋白质二级结构分析。在二级结构
分析的基础上，应用 SWISS-MODEL 对 BxACE1 进
行三维建模。搜索 ExPdb 晶体图像数据库中的高
相似度同源序列，建立原子模型返回。此返回结果
提交“Optimize”模式，进行优化从而产生结构模型，
根据结构模型对结果进行评估，并做适当修正 (谌
容等，2006)。分析该 BxACE1 的三维结构，进行同
源三维结构比对，进一步修正后输出三维立体结
构图。
1. 3 BxACE1 基因沉默
为确保基因沉默的特异性，选取 BxACE1 序列
中 GC 含量 20% ～ 50%、涵盖不同剪接型的区段作
为靶序列，并设计引物对 ( BxACE1-SiF: 5-AGC
CCC AGG GAA TAT GGG AT-3; BxACE1-SiＲ: 5-
TGG ATC CGA GGG TTC GTA CT-3)。应 用
MEGAscript ＲNAi 试剂盒和 T7 引物(5-TAA TAC
GAC TCA CTA TAG GGA GA-3)进行体外转录反应
生产相对应的 ssＲNA。正义链与反义链 ssＲNA，经
退火生产 dsＲNA，酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)抽提
纯化，甲醛变性凝胶电泳检测。用 2. 0 mL 离心管分
装50 μL M9 缓冲液稀释的 3 μg·μL － 1的 dsＲNA(含
有 10 mmol·L － 1章鱼胺)，每管加入线虫1 000条，利
用线虫 ＲNAi 路径中内源核糖核酸内切酶 Dicer 降
解 dsＲNA 为 21 ～ 23 bp 的 siＲNAs 诱导 ＲNAi。避光
振荡处理 8 h 后无菌水清洗(Wang et al．，2012)，以
M9 缓冲液处理线虫为对照线虫组。
应用 Q-PCＲ 技术鉴定 ＲNAi 效果，分别提取
ＲNAi 处理和对照线虫 ＲNA，DNase I(ＲNase-free)消
化去除基因组 DNA 残留后，选用特异引物对
(BxACE1-QF: 5-AGC CAT CAT CCA AAG CGG AA
-3; BxACE1-QＲ: 5-TCC ACC ATG AAA TCC CCG
TC-3)，采用 iTM 5 多重实时荧光定量 PCＲ 仪进行
Q-PCＲ 检验基因沉默效果。Actin 基因作为内参基
因，选用引物对 ＲsACT_F: 5-GAA AGA GGG CCG
GAA GAG-3和 ＲsACT _Ｒ: 5-AGA TCG TCC GCG
ACA TAA AG-3 ( Joachim et al．，2007)。采用相对
定量法计算 3 次重复试验初始模板量比值的对数值
即 log2(对照线虫 /ＲNAi 处理线虫)，通过两配对样
本 t 检验的差异显著性，判断 BxACE1 基因表达是否
受抑制。
用对松材线虫低毒的苦参碱 ( 0. 03% ) 处理
ＲNAi 处理线虫或对照线虫(Matsuda et al．，1989)，
验证 BxACE1 基因沉默对苦参碱的增效作用。分别
设 ＲNAi 组(0. 03%苦参碱 + ＲNAi 处理线虫)，CK1
(苦参碱 + 对照线虫 )，CK2 ( ＲNAi 处理线虫 ) 和
CK3(对照线虫)4 个处理组测定存活率，每个处理
组 90 条虫，各重复 3 次。根据各组线虫存活率以及
ＲNAi 组与 CK1—CK3 组的差异显著性验证 BxACE1
基因沉默后苦参碱的杀虫效果。
1. 4 BxACE1 蛋白抑制剂分子辅助筛选及抑制
试验
据不同线虫 ACE1 蛋白质三维结构比对，筛选
86
第 1 期 刘立宏等: 松材线虫乙酰胆碱酯酶 1 基因沉默及蛋白抑制剂
BxACE1 结构保守区。应用 Hex 6. 3(Macindoe et al．，
2010)进行 ACE1 和候选抑制剂(ＲS)-( ± )-tacrine-
hupyridone-(ＲS)-( ± )-3(Haim et al． 2005)以及石杉
科植物蛇足石杉(Huperzia serrata)提取物石杉碱甲
(Huperzine A，C15 H18 N2O) ( Ｒaves et al．，1997 ) 的
Docking 分子对接试验，并寻找互作位点以及相关化
学键。以石杉碱甲(上海纯优生物公司)1 μmol·L － 1
溶液处理线虫。分别设 Inhibitor(0. 03%苦参碱 + 1
μmol·L － 1石杉碱甲处理线虫)、CK4(1 μmol·L － 1石杉
碱甲处理线虫)和 CK5(1 μmol·L － 1石杉碱甲 + ＲNAi
线虫)对照组测定存活率，每个处理组 90 条虫，各重
复 3 次。
2 结果与分析
2. 1 BxACE1 基因全长克隆及序列分析
应用 TＲIzol 提取松材线虫总 ＲNA(图 1 中泳道
1)，经分光光度计检验 OD 值 ( OD260 /OD280 = 2. 0，
OD260 /OD230 ＞ 1. 8)符合标准后进行 ＲACE 克隆。5
ＲACE 克隆到序列长度为1 280 bp(图 1 中泳道 2)，
3 ＲACE 克隆到长度为1 720 bp并含有 PolyA 的序
列(图 1 中泳道 3)。5和 3序列拼接得到基因全长
2 145 bp，命 名 为 BxACE1。经 OＲF 分 析 得 到
BxACE1 氨基酸序列含有 622 个氨基酸，分子质量
71. 251 19 kD，等电点(Theoretical pI)为 5. 43。
登录 NCBI 筛选 BxACE1 同源序列 6 条(表 1)，
应用 Clustal W 对同源序列进行多序列比对，构建最
大似然树(图 2B)。另登录 NCBI 下载 BxACE1 同源
序列 100 条，采用 PAUP 4. 0 和 Modetest 3. 06，依据
AIC( akaike information criterion)选出 JTT + G 为进
化的最适模型，构建最大似然树明显分为 3 枝 (图
2A)，作为外参的旋毛形线虫 ( Trichinella spiralis)
ACE 独立成一枝，果蝇、蚂蚁、蛾类和螨虫等节肢动
物的 ACE 聚为一枝，其他线虫 ACE 聚在一起成为
一枝。这表明线虫和节肢动物 ACE 蛋白的进化速
度与物种进化速度一致。线虫 ACE 间的进化关系
如图 2B 所示，BxACE1 与 NCBI 注册的松材线虫
ACE 亲缘关系最近 ( 1 000次重复检验支持率为
100% )，表明二蛋白虽然来自不同种群的松材线
虫，但 ACE 蛋白未发生分化。线虫系统进化树分为
2 枝，第 1 枝为包括松材线虫 ACE 在内的植物寄生
线虫枝，第 2 枝则包括动物寄生线虫和自由生活线
虫。这表明线虫 ACE 的进化速度与线虫进化速度
一致。
图 1 ＲNA 提取及 BxACE1 基因全长克隆
Fig． 1 ＲNA extraction and ＲACE of BxACE1
1. 松材线虫 ＲNA ＲNA of B． xylophilus; 2. BxACE1 基因 5ＲACE 5
ＲACE of BxACE1; 3: BxACE1 基因 3ＲACE 3ＲACE of BxACE1; M.
DNA Marker DL2000．
表 1 NCBI 登录的 ACE 同源序列
Tab． 1 ACE homologous sequence in NCBI
物 种
Species
NCBI 序列号
NCBI Accession No．
蛋 白
Protein
E 值
E value
丝虫 Loa loa EFO24566. 2 乙酰胆碱酯酶 1 Acetylcholinesterase 1 0
南方根结线虫 Meloidogyne incognita AAD02835. 1 乙酰胆碱酯酶前体 Acetylcholinesterase precursor 0
马铃薯茎线虫 Ditylenchus destructor ABQ58117. 1 乙酰胆碱酯酶 1 Acetylcholinesterase 1 0
爪哇根结线虫 Meloidogyne javanica AAD25921. 1 乙酰胆碱酯酶 Acetylcholinesterase 0
秀丽线虫 Caenorhabditis elegans NP_510660. 1 乙酰胆碱酯酶 Acetylcholinesterase 0
松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus ACZ64207. 1 乙酰胆碱酯酶 1 Acetylcholinesterase 1 0
2. 2 BxACE1 基因沉默
采用浸泡法进行 BxACE1 基因沉默，并应用 Q-
PCＲ 技术检验线虫 BxACE1 基因沉默效果，分别记
录 3 次重复试验中未处理线虫 BxACE1 基因 CT值
(图 3A CK)和 Actin 对照 CT值 (图 3A Actin CK)，
ＲNAi 处理线虫 BxACE1 基因 CT值(图 3A ＲNAi)和
Actin 对照 CT值(图 3A Actin ＲNAi)，采用相对定量
法计算得初始模板量比值的对数值为 6. 81 (图
3B)。经两配对样本 t 检验 P = 0. 00 ＜ 0. 01，差异显
著，表明 BxACE1 基因表达受抑制。
96
林 业 科 学 51 卷
图 2 BxACE1 及其同源序列最大似然树
Fig． 2 The maximum likelihood tree of BxACE1and homologous sequences
A: 100 个 ACE 最大似然树 The maximum likelihood tree of 100 ACE;
B: 线虫 ACE 最大似然树 The maximum likelihood tree of nematode ACE．
2. 3 BxACE1 蛋白质结构分析及蛋白抑制剂分子
辅助筛选
蛋白质三维结构分析表明，BxACE1 由 14 个 α
螺旋包围着 13 个 β 折叠 (图 4A)。与其他物种
ACE 结构在 α 螺旋 A13 和 β 折叠 B13 之间的 Loop
区存在空间结构差异(图 4B)，此差异未改变酰基口
袋的形状，也未改变底物结合的空间(图 4C)，对底
物与抑制剂的结合影响很小。BxACE1 蛋白催化中
心( catalyticactive site，CAS)是位于蛋白质中部由氧
阴离子洞和酯水解中心构成的“芳香残基裂隙”，该
结构趋于保守，与其他物种 ACE 相比较，氨基酸序
列保守(图 4D)(Sussman，1991)。
将 BxACE1 与 抑 制 剂 ( ＲS )-( ± )- tacrine-
hupyridone-(ＲS)-( ± )-3(Haim et al．，2005)以及石杉
碱甲(Ｒaves et al．，1997)进行 Docking 分子模拟对接
试验表明结果 BxACE1 可以与这 2 种抑制剂结合(图
07
第 1 期 刘立宏等: 松材线虫乙酰胆碱酯酶 1 基因沉默及蛋白抑制剂
图 3 Q-PCＲ 检验 BxACE1 基因沉默
Fig． 3 The ＲNAi of BxACE1 tested by Q-PCＲ
A: Q-PCＲ CT值 CT of Q-PCＲ ;
B: BxACE1 基因沉默前后对数值 log2 fold change of CK /ＲNAi．
5A，C)，但 BxACE1 与抑制剂 ( ＲS)-( ± )- tacrine-
图 4 BxACE1 蛋白质空间结构及抑制剂结合位点序列比对
Fig． 4 The protein structure of BxACE1 and inhibitor binding site sequences alignment
A: BxACE1 蛋白质空间结构:A1—A13 为 d 螺旋，h1—h4 为 310螺旋，B1—B13 为 β 折叠 The protein structure of BxACE1:A1 － A13 show d
helix，h1 － h4 show 310 helix，B1 － B13 show β sheet; B: ACE 蛋白质空间结构比对 3D structure alignment of ACEs; C: BxACE1 蛋白质酰基口袋
Acyl pocket of BxACE1; D: ACE 抑制剂结合位点序列比对 Inhibitor binding site sequences alignment of ACEs．
hupyridone-(ＲS)-( ± )-3 只形成一个氢键(图 5B)，
而 BxACE1 与抑制剂石杉碱甲形成 5 个氢键 (图
5D)形成稳定的异质性结合。鉴于氢键数量越多结
合越稳定，故此选择石杉碱甲作为候选抑制剂。
2. 4 BxACE1 基因沉默及抑制剂作用效果鉴定
基因沉默处理后，连续观察 72 h，ＲNAi 处理组
线虫从 6 h 开始迅速死亡，线虫存活率迅速下降(图
6)。CK1 处理组线虫存活率下降，表明苦参碱具有
一定的杀虫效果，但杀虫效果不明显。CK2 处理组
线虫与 CK3 处理组线虫均未发生大量死亡。ＲNAi
处理组线虫与 CK1 处理组线虫在 24，48 及 72 h 存
活率差异显著。研究结果表明:CK2 处理组虽然在
72 h 内 BxACE1 基因表达受抑制，但线虫体内的胆
碱积累水平不足以致其中毒死亡，但 ＲNAi 明显增
加了苦参碱的杀虫效果。
CK4 处理组自 24 h 开始出现少量线虫死亡，72 h
后存活率稍下降(图 6)，表明石杉碱甲本身对线虫毒
性较小，72 h 内 BxACE1 活性受抑制，但线虫体内的
胆碱积累水平不足以致使大量线虫中毒死亡。
17
林 业 科 学 51 卷
图 5 BxACE1 与抑制剂 Docking 分子对接
Fig． 5 Docking of BxACE1 and inhibitors
A: BxACE1 与(ＲS)-( ± )- tacrine-hupyridone-(ＲS)-( ± )-3 分子对接 Docking of BxACE1 and(ＲS)-( ± )- tacrine-hupyridone-(ＲS)-( ± )-3;
B: BxACE1 与(ＲS)-( ± )-tacrine-hupyridone-(ＲS)-( ± )-3 之间的氢键，Y88 为第 88 位络氨酸 Hydrogen bond between BxACE1 and ( ＲS)-
( ± )- tacrine-hupyridone-(ＲS)-( ± )-3，Y88 show the 88 tyrosine; C: BxACE1 与石杉碱甲分子对接 Docking of BxACE1 and huperzine A; D:
BxACE1 与石杉碱甲之间的氢键，W137，S138，Y146，E214 分别表示第 137 位色氨酸，第 138 位丝氨酸，第 146 位络氨酸，第 214 位谷氨酸
Hydrogen bond between BxACE1 and huperzine A，W137，S138，Y146，E214 show the 137 tryptophan，the 138 serine，the 146 tyrosine，the 214
glutamic acid．
Inhibitor 处理组线虫从 6 h 开始迅速死亡(图 6)，24 h
线虫存活率迅速下降。CK5 处理组线虫存活率自 24
h 始稍下降，但与 CK2 组与 CK4 组均无显著差异，表
明共同施用 ＲNAi 和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小。
ＲNAi 处理组线虫与 Inhibitor 处理组线虫在 24，48 及
72 h 存活率差异不显著，表明石杉碱甲处理线虫和
BxACE1 基因 ＲNAi 处理效果相近。
3 结论与讨论
本研究克隆到松材线虫乙酰胆碱酯酶基因
BxACE1，发现施用苦参碱同时阻断 BxACE1 基因功
能可得到良好的杀虫效果。虽然 ＲNAi 技术能够简
单易行地证明若阻断 BxACE1 基因功能可以提苦参
碱的杀虫效果，但 dsＲNA 容易降解等因素限制了该
技术在生产实践中的广泛应用。为克服这一限制因
素，本研究进一步通过 ACFIs 阻断 BxACE1 基因功
能，进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的
目的。基于分子对接技术的抑制剂辅助筛选表明石
杉碱甲可以与 BxACE1 稳定结合。抑制剂抑制效果
鉴定表明，石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果，具
有生防药剂辅剂的开发潜力。
ACEIs 通过对 ACE 的抑制，使得乙酰胆碱在神
经突触的间隙中累积，从而使得乙酰胆碱的作用时
间变长。ACEIs 通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶
的活性，使线虫体内的胆碱水平短时间内大幅提高，
从而导致其中毒死亡。该类具有代表性的杀虫剂是
有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物，大多为非
可逆型 ACEIs。近年出现的非共价结合的 ACEIs 虽
27
第 1 期 刘立宏等: 松材线虫乙酰胆碱酯酶 1 基因沉默及蛋白抑制剂
未广泛应用，因对人和动物的危害小而具有广阔的
开发前景。石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉
的一种半萜生物碱，是一种高效、高选择性、可逆性
的 ACEIs。本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究，
是对该植物源药剂的一个新尝试。
图 6 BxACE1 基因 ＲNAi 及抑制剂石杉碱甲
对苦参碱杀虫效果辅助作用鉴定
Fig． 6 Identification of ＲNAi and inhibitor
参 考 文 献
丁 中，彭德良，高必达，等 ． 2010． 甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因
Dd-ace-1 全长 cDNA 的克隆和序列分析 ． 湖南农业大学学报，
36(4) : 437 － 440．
(Ding Z，Peng D L，Gao B D，et al． 2010． Molecular cloning and
characterization of a new acetylcholinesterase gene Dd-ace-1 from
Ditylenchus destructor． Journal of Hunan Agricultural University，36
(4) : 437 － 440．［in Chinese］)
丁 中，彭德良，黄文坤，等 ． 2008a． 甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基
因 Dd-ace-2 全长 cDNA 的克隆和序列分析 ． 生物工程学报，
4(2) :239 － 244．
(Ding Z，Peng D L，Huang W K，et al． 2008a． Molecular cloning and
characterization of a new acetylcholinesterase gene Dd-ace-2 from
Ditylenchus destructor． Chinese Journal of Bioteehnology，4 ( 2 ) :
239 － 244． ［in Chinese］)
丁 中，彭德良，高必达，等 ． 2008b． 甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基
因 Dd-ace-3 全长 cDNA 的克隆和序列分 ． 农业生物技术学报，
16(2) : 326 － 331．
(Ding Z，Peng D L，Gao B D，et al． 2008b． Molecular cloning and
characterization of a new acetylcholinesterase gene Dd-ace-3 from
Ditylenchus destructor． Journal of Agricultural Biotechnology，
16(2) : 326 － 331． ［in Chinese］)
谌 容，陈 敏，杨春贤，等 ． 2006． 基于 SWISS － MODEL 的蛋白
质三维结构建模 ． 生命的化学，26(1) :54 － 55．
( Shen Ｒ，Chen M，Yang C X，et al． 2006． Making protein three-
dimensional structure model by depending on SWISS-MODEL．
Chemistry of Life，26(1) :54 － 55．［in Chinese］)
王 峰 ． 2008． 松材线虫 HSP90 基因克隆及功能分析 ． 哈尔滨:东北
林业大学博士学位论文 ．
(Wang F． 2008． Gene cloning and functional analysis of HSP90 gene
from Bursaphelenchus xylophilus． Harbin: PhD thesis of Northeast
Forest University． ［in Chinese］)
Arpagaus M，Fedon Y，Cousin X，et al． 1994． cDNA sequence，gene
structure，and in vitro expression of ace-1， the gene encoding
acetylcholinesterase of class A in the nematode Caenorhabditis
elegans． Journal of Biological Chemistry，269(13) : 9957 － 9965．
Haim H，Dawn M W，Harry M G，et al． 2005． Crystal packing mediates
enantio selective lig and cognition at the peripheral site of
acetylcholinesterase． J Am Chem Soc，127(31) : 11029 － 11036．
Jae S K，Dae-Weon L，Jae Y C，et al． 2011． Three acetylcholinesterases
of the pinewood nematode，Bursaphelenchus xylophilus: Insights into
distinct physiological functions． Molecular ＆ Biochemical
Parasitology，175(2) : 154 － 161．
Jae S K， Yil S M， Si H L． 2012． Inhibition properties of three
acetylcholinesterases of the pinewood nematode Bursaphelenchus
xylophilus by organophosphates and carbamates． Pesticide
Biochemistry and Physiology，104(2) : 157 － 162．
Joachim J，Bartel V，Annelies H． 2007． Four transthyretin-like genes of the
migratory plant-parasitic nematode Ｒadopholus similis: Members of an
extensive nematode-specific family． Gene，402: 9 －19．
Macindoe G，Mavridis L，Venkatraman V，et al． 2010． HexServer: an
FFT-based protein docking server powered by graphics processors．
Nucleic Acids Ｒesearch，38: W445 － W449．
Martine A，Yann F，Xavier C，et al． 1994． cDNA sequence，gene
structure，and in vitro expression of ace-1， the gene encoding
acetylcholinesterase of class A in the nematode Caenorhabditis
elegans． The Journal of Biological Chemistry，269: 9957 － 9965．
Matsuda K，Kimura M，Komai K，et al． 1989． Nematicidal activities of
(-)-N-methylcytisine and (-)-anagyrine from Sophora flavescens
against pine wood nematodes． Agricultural and Biological
Chemistry，53(8) : 2287 － 2288．
Ｒaves M L， Harel M， Pang Y P， et al． 1997． Structure of
acetylcholinesterase complexed with the nootropic alkaloid，(-)-
huperzine A． Nature Structural Biology，4(1) : 57 － 63．
Stephen A F，Madden T L，Schffer A A，et al． 1997． Gapped BLAST
and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs． Nucleic Acids Ｒes，25(17) : 3389 － 3402．
Sulston J，Hodgkin J． 1988． Methods in the nematode Caenorhabditis
elegans． New York: Cold Spring Harbor Laboratory．
Sussman J． 1991． Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo
californica: A prototypic acetylcholine-binding protein． Science，
253(5022) : 872 － 879．
Wang F， Wang Z， Li D L， et al． 2012． Identification and
characterization of a Bursaphelenchus xylophilus ( Aphelenchida:
Aphelenchoididae) thermotolerance-related gene: Bx-HSP90 ． Int J
Mol Sci，13(7) : 8819 － 8833．
(责任编辑 朱乾坤)
37