全 文 ：第6 卷 第 6 期
1 9 9 3 年 1 2 月
林 亚 科 学 研 究
F O R E ST R E S E A R CH
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低温驯化的黑荆树悬浮培养细胞中
可溶性蛋白质含量变化 *
王敬文 蒋 晶
摘要 低温驯化能够诱导黑荆树悬浮培养细胞增强抗冻性 , L T S 。从 一 3 . 4 ℃下降到 一 8 . 2 ℃ 。低
温驯化诱导可溶性蛋白质含量增加 , 其增加的时间进程与细胞抗冻性发育呈平行关系 。 环已亚胺抑
制可溶性蛋白质含量增加 , 同时也抑制细胞抗冻性发育 . 在低温驯化期间不同时间加入环己亚胺抑
制抗冻性发育 , 表明低温驯化10 d 后抗冻性发育接近完成 。 糖对增加驯化细胞中可溶性蛋白质有促
进作用 , 加快增加含量的时间进程 , 但对最终提高蛋白质含量水平无效 , 糖不是木本植物低温驯化
诱导抗冻性的因子 。
关键词 黑荆树 、 悬浮细胞、 低温驯化 、 可溶性蛋白质 、 抗冻性
木本植物在低温驯化过程 中许多生化代谢活动仍活跃地进行着 , 它们是植物抗寒基因表
达的中间过程 , 一方面接受低温和短光照的驯化诱导 , 另一方面又为最终抗冻结构的形成奠
定基础 , 而且这些生化过程本身也在抗冻 中起着作用 , 因此与低温驯化有关的代谢变化是许
多研究者们的重要课题 。 植物在低温驯化过程中 , 碳水化合物 、 蛋白质 、 脂类 、 氨基酸 、 激
素等都发现有许多重大的相关变化〔1 ’, 所研究的这些代谢变化基本上都是越冬草木植物完整
植株在越冬前自然寒冷驯化条件下发生的相关变化 , 由于完整植株的吸收、 光合 、 代谢和运
输等过程依然进行着 , 不可否认对这些代谢变化与抗寒性发育之间的关系往往是 似 是 而 非
的。 树木与草木植物其内生节奏和抗寒性发育有所不 同, 而且直接针对树木的研究较少 。 黑
荆树是我国中、 南亚热带栽培树种 , 冬季气温 一 5 ℃左右即遭受严重冻害 。 黑荆树悬浮培养细
胞经低温驯化提高了抗冻性 , L T 。。达到 一 7 . 6 ℃〔“〕, 在人工条件下低温驯化悬浮培养细胞 ,
研究驯化过程中细胞的生化代谢变化与抗寒性发育的关系 , 有助于认识抗寒性发育的生理机
制。
1 材料和方法
。
1 黑荆树瓜浮培养细胞制备
取黑荆树 ( A c a e ia m e a r n s i‘ D e W ild ) 种子投入 5 0 0 m l沸水中, 待其自然冷却至室温
后用纱布搓去种皮蜡质 , 经消毒后接种在 1 写琼脂培养基上 , 25 ℃发芽 , 待 幼 茎 长 至 4 ~
5 e m 时切取茎段接于 M S 培养基上 , M S 含 B A o . 9 3 x l o 一 Z m M , 2 , 4 一D o . g x lo 一 , m M , 蔗
1 993一 03一09收稿 。
王敬文副研究员 , 蒋晶 ( 中国林业科学研 究院亚热带林业研究所 浙江 富阳 3 1 14 朋 ) 。
* 国家 自然科学基 金资助 项目。
6心2 林 业 科 学 研 究 6 卷
糖 3 0 9 / L , 酪阮水解物1 9 / L , p H S . 8 , 培养约 2 周诱导出愈伤组织 。 将旺盛生长的愈 伤 组
织转移到M S培养液中 ( 内含 1 %果胶酶 ) , 35 ℃保温30 m in , 略加摇动即释 散 出 大 量 细
胞 , 经 2 0 目尼龙布过滤去除细胞块团 , 滤液离心沉降分离 出细胞 , 用M S液洗涤 3 次 , 重新
悬浮于 M S培养液中 , 单细胞在95 % 以上 。
1
.
2 低沮驯化
将 制备的细胞在M S培养液 ‘{,正常悬浮培养 Z d , 随 后转入调整过的 M S 培 养 液 ( 减 去
B 八 , 减去酪肮水解物 , 蔗糖 50 9八 ) 中 , 在 2 ℃ 、 何少、 s h 光照和每分钟1 1 0转转动条件 下
进行悬浮培养。
.
3 冷冻试验
收集悬浮细胞样品 , 明水洗涤 3 次 , 再重新悬浮于水中 , 每份样品等分于 3 次试管中 。
制备O℃到 一 1 ℃的梯度冷浴 , 每梯度降低 2 ℃ , 用氯化钠和冰块调节冷浴温度 。 细胞在 。℃
保持 3 0 m il , 然后在梅一相应梯度温度保持 l h 。 冷冻处理后取出试管 , 在 2 ℃保持 Z h 解
冻 。 测 定细胞存活率川质壁分离法 , 取细胞悬浮液滴入 o . S M蔗糖液 中 , 镜检细胞质壁分离 ,
能发生正常典型质壁分离 r心细胞计数为活细胞 , 不能发生典型质壁分离的都计数 为死细胞 ,
侮份样 品观测 2 0个视野 , 统计2 0 (j0 个细胞的存活率 。
1
.
4 可溶性蛋白质侧定
离心收集悬浮培养细胞样品 , 以 20 倍量 (犷/ 不 )的 一 巧℃冰冻内酮脱水制得丙酮粉 , 称取
2 0 0 m g
, 加入 l u m l 0 . 0 5 入[ t r i s 一 H e l缓冲液 (p H 7 . o ) , 一f o ~ 4 ℃浸提过夜 。 提取液经离心
去渣后 ]J11入 5 % 三氯乙酸2 0 In l, 3 0 m in 后再离心 (5 0 0 0 r p m ) 1 0 m in , 弃去上清液 , 获得 的
蛋白质再悬浮于 0 . I N 氢氧化钠中 , 再按 L o w r y等〔‘’方法测定蛋 白质含量 。
2 实验结果
2
.
1 低湿驯化对抗冻性 的诱导作用
树木悬浮培养细胞低 温驯化象它的亲
本母株一样 , 诱异条件必须包括低温和短
光照〔2 〕, 黑荆树悬浮培养细胞在 2 ℃ 、 行
天 s h 光照下驯化 1 4 d , 抗冻性显者增强 。
未经低温事l}化 (2 5 C每天 2 6 1, 光照 )的对娥龙
L T
S 。为 一 3 . 5 ℃ , 在 一 6 ℃自比胞全部死亡 ,
而经低温驯化的细胞 L ‘f s。 为 一 8 . 4 ℃ , 在
一 12 ℃仍有8 . 6 % 的细胞存洁 ( 图 1 ) 。
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对照
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2
.
2 可溶性蛋白质含 , 的变 化
黑荆树悬浮培养细胞在 Z C 、 睡天 s h 光照下进行低温驯化 1 4 d , 侮 2 天取样分析可溶
性蛋白质含从 ( 图 2 ) 。 片之低 i人八驯化的对照 可溶性蛋白质含星 比较稳定 , 而经低温驯化的其
含量显著增加 , 随了洲1化天数增加而增高 , 第12 天达到高峰 。
2
.
3 外源糖对蛋白质含t 的影响
植物在低温 I: 含糖童增高是 · 个普遍现象 , 搪在植物抗冻 ‘1, 也有重要作川 。 黑荆树悬浮
6 期 王敬文等 : 低温驯化的黑荆树悬浮培养细胞中可溶性蛋白质含量变化
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丁氏公驯 化天 数 ( d )
图 2 黑荆树悬浮 培养细胞低温 驯化 过程 中可溶性 蛋白质
含量的变化和抗冻性 发育
( 抗冻性是在 一 6 ℃下测定的细胞存活率 ( % ) ,
未驯化 ( 对照 ) 存 活率为 O )
细胞在含 5 % 、 10 % 、 1 5 %蔗糖 的 M S
培养液中进行低温驯化1 4 d , 每 2 天取
样分析细胞中蛋白质含量的变化 , 结果
如图 3 。 从图3中可 以看出 , 未经低温驯
化的悬浮培养细胞在含5 %蔗糖MS培养
液中的对照 , 其蛋白质含量没有显著的
变化 , 而经低温驯化的 3 种蔗糖浓度处
理 , 其蛋白质含量显著增高 , 但是尽管
蛋白质含量增高的时间进程有差异 , 而
最终其蛋白质含量还是达到同一水平 ,
这表明蛋白质含量增高是低温驯化诱导
的结果 , 而不是由蔗糖直接诱导的 。
2
.
4 蛋白质含盆与抗冻性
黑荆树悬浮培养细胞在低温驯化期间发生蛋 白质的相关变化 , 随着低温驯 化 时间 的 增
长 , 细胞中可溶性蛋白质含量增高 ( 图 2 ) , 与此 同时细胞的抗冻性也得以充分发育 , 提高
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了抗冻性 。 未驯化的对照细胞耐冻极限
为 一 6 ℃ , 存活率为 。, 而经低温驯化的
细胞驯化 4 d 以上就能耐受一 6 ℃冷冻 ,
随着驯化天数增加耐冻性也随之增加 ,
抗冻存活率与蛋白质含量的变化有着 明
显 的平行关系 ( 图 2 ) 。
2
.
5 环己亚胺对蛋白质含 , 和抗 冻 性
的影晌
在悬浮细胞培养液 M S 中加入不 同
浓度的环 己亚胺 , 在 2 ℃ 、每天s h 光照
下驯化12 d , 测定其可溶性蛋白质含量
,.jo氏0
低温训化天 数( d )
图 3 外源 糖对低温 WI 化细 胞可溶性 蛋白质含 量的影 响
和在 一 6 ℃的耐冻性 , 结果如表1 。 环 己亚胺抑制可溶性蛋白的合成和积累 , 浓度越高抑制作
用越强 , 浓度大于 5 m g / L 时完全抑制了蛋白质合成 , 与此相应 的 细胞抗冻性也随之降低 , 环
己亚胺浓度高于 5 rn g / L 时 , 低温驯化的细胞其抗冻能力也随 之 丧失 。
表 1 环己亚胺对蛋白质合成和细胞抗冻性的抑制作用
环己 亚胺浓度 ( 口g / L ) 0 0 . 1 1 2 弓 1 0
可液性 蛋白质含量O D 值 D . 8 3 7 士 0 . 0 22 0 . 7 14 士 0 . 0 3 2 0 . 59 6 士 0 . 0 28 0 . 2 8 2 士 0 . 0 3 7 0 . 1 3 7 士 0 . 0 2 2 0 . 1 2 9 士 D . 0 2 7
细胞存活率 ( % ) 8 4 . 4 士 2 . 2 8 1 . 7 土 1 . 8 4 6 . 2 士 3 . 1 1 7 . 4 二 2 . 6 0 0
注 : 在 黑荆树悬浮细胞M S培养液 中加 入环 己亚胺 , 低温驯化招 d 。 细胞存活率 ( % ) 是在 一 6 ℃测验的。 未加 环 己亚
胺 、 未进行低温驯化的正常培养1 2 d 的悬 浮培养细胞可溶性蛋 白质含量 O D 值为 0 . 1 5 3 8 士 0 . 02 6 。
2
.
6 环己亚胺对抗冻性发育 的影晌
环己亚胺在 5 m g / L浓度时完全抑制可溶性蛋白质合成 , 也直接影响细胞抗冻性发育 。 在
低温驯化过程中 , 在不同时间将驯化细胞转入到添加 5 m g / L环 己亚胺的培养液中 , 再继续驯
化到第 14 天 , 随即测定细胞的坑冻 能力 , 结果如图 4 。驯化开始时加入环已亚胺 , 抑制了可溶性
6 6 4 林 、1【 学 研 究 6 卷
蛋白质合成 , 也抑制了抗冻性发育 , 细胞冷
冻存活率和未经低温驯化的对照大致相同 。
驯化第 6 天加入环己亚胺 , 这 一处理的细胞
抗冻性明显增强 , 抗冻极限温度达 到 一 9 一
一 10 ℃ 。而在驯化第 1 天加入环 己亚胺时 , 细
胞的抗冻性 已得以较充分的发育 , 耐受低温
极限接近 一 12 ℃ , 这表明低温诱导的抗哟:性
发育在驯化第 10 天即接近完成 。
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冷冻诬度 (℃ )
图 4 环己 亚胺浓度为5扭 g / L对黑荆树低温驯化恐浮细胞抗冻性发育的影响
二 未驯化 的对 照 ; b 驯化开 始时加入 环 己亚胺 ,
e
. 驮l化 弓 d 后加 入 I不己 亚吠 . d . 驯化 10 d 后
加 入环己 亚胺 。
3 讨 论
植物完整植株通过低温驯化能够提高抗
寒力 , 植物悬浮培养细胞也能够 通过低温驯
化提高抗冻性 。 油菜 〔‘〕、 小麦 仁s ’、 背楷 〔. ’等悬浮培养细胞进行低温驯化时所发生的形态 、 生
理变化已作了许 多研究 , 但在木本植物方面研究较少 。 H e lle r gr e nt 7〕对欧洲赤松 ( 尸i nu :
sy lv es tr is ) 悬浮培养细胞进行低温驯化 , 使 L T 。。从 一 6 . 2 ℃下降到 一 1 6 . 4 ℃ 。 王敬文等〔吕, 低
温驯化黑荆树悬浮培养细胞 , 使 L T 。。从 一 2 . 5 ℃ 下降到 一 7 . 6 ℃ , 并研究了脱落酸对细胞抗冻
性的诱导作用 ( 待发表 ) 。利用悬浮培养细胞研究诱导抗寒力过程 中的生理变化有相当的优越
性 , 能够减少或排除在整株植物上 由于细胞差异和器官特异性所造成的干扰 , 而且环境条件
能够进行人工控制 , 细胞所经受的试验处理也都是均一的 。
植物的抗冻基因是一种诱发性基因 , 只是在一 定的条件下才能表达为抗冻力。 低温驯化
就是诱发抗冻基因表达 , 这不仅取决于外界的诱导条件—低温和短光照 , 而且与细胞的代谢活动有密切 的关系 。 在诱发抗冻基因表达过程 中 , 细胞代谢活动所发生的一系列变化 , 有
些是相辅的变化 , 有些则是与抗寒基因表达提高抗冻能力直接相关的 。 低温驯化诱导悬浮培
养细胞可溶性蛋 白质含量增加 ( 图 2 ) , 可溶性蛋白质含量增加的时间进程与细胞抗冻能力
增强的进程是同步的 , 环己亚胺抑制蛋白质含量增高 , 同时也抑制了细胞抗 冻 性 发 育 ( 图
4 , 表 1 ) , 这就表明低温驯化诱导合成的这种可溶性蛋白质 一与细胞 的抗冻性直接相关 , 是
抗冻基 因表达的产物 。 , ; r溶性蛋 白质的亲水胶体性质强 , 含最哟加可显著加强细 胞 的 保 水
力 , 更重要的是 , K a c p e r s k a 一 P a lac z 等〔“’认为这类可溶性蛋白质主要是 一 些功能蛋白—酶 ,这些新合成的酶在性 质 fl ifl 成 _卜都发生 了变化 , 如其反应动力学 的 Q : 。较低 , 这对 一」立细胞的
抗冻性都有其特异的作用 。
糖在植物抗冻 ‘!‘虽有 币要作川, 但并不直接相关 。 认 。 is e r 〔“1 曾 对 惬 伏 徕 术 ( C o r n “:
s to lo n if
e r a P t, a ll
.
) 植株施少tl不同浓 j变(rJ 糖 , 对促进抗寒驯化没有效果 。 S i m i : l o v i t e h等 t ” “
曾指出黑刺槐树抗寒性增强与晚秋增加含糖量并不相关 。 S a k a i (酒井 , 19 6 8) 在白杨树抗寒
研究中也没找到含糖 曦一‘j抗冻性之间的相关性 。 在本研究中 , 精对黑荆树低温驯化细胞中可
溶性蛋白质合成有促进作用 , 加快了蛋白质含最增加的时间进程 , 但并没有最终提高蛋白质
含量水平 ( 图 2 ) , 这表明糖不是木本植物低温驯化诱导抗冻性的因子。
6 期 王敬文等 : 低温驯化的黑荆树悬浮培养细胞中可溶性蛋白质含量变化 6 6 5
参 考 文 三献
1
. 简令成 . 植物 冻害和抗冻性细胞生物学研究 . 植物生理生化进展 ,
2
. 王敬文 , 蒋晶 . 黑荆树悬浮细胞低温驯化 . 林业科学研究 , 1 9 89,
3
.
L o w r 了 C H , R o se br o u g h N L , e t: a l . Pr o te in
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26 5 ~ 2 7 5
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1 ~ 1 6
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442 ~ 4 6
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S im i皿o v itc h D , G ffe lle r F , D li e a u 皿e B . T li e m u lt ip le e ha r a c te r o f th e
f , e e : i皿9 r e s is ta n c e o f p la n t ee lls , 一in Ce llu la , In ju ry a n d R e sista n c e in
H o kka id
o 刀 n iv e r s itr , Sa p 卫o r o , Ja p a n , 1 96 7 . 9 7 ~ 11 7 .
in r e sp o n se to li g ht a n d te m
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19 7 7
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.
C y e lo h e x im id e
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.
D u r in g e o ld a e e li m a tio n
, if e y e lo h e x i m id e w a s a d d e d a t d iffe
-
r e n t 七i m e , th e in h ib i tio n e ffe e t s o n d e v e lo p m e n t o f fr e e z in g t o le r a n e e w e r e
d iffe r e n t
.
T h e s e r e su lt s in d ie a te d th a t d e v e lo Pm e n t o f fr e e z in g t o le r a n e e w a s
n e a r in g e o m p le t io n a t a b o u t th e t e n th d a y o f a e e lim a 七io n p e r io d . E x o g e n o u s
s u g a r a e e e le r a t e d t h e t im e e o u r s e o f in e r e a s e o f S o lu b le p r o 七e in , h o w e v e r it
w a s in e ffe e t iv e o n t h e in e r e a s e o f f in a l to ta l e o n te n 七 o f s o lu b le p r o te in . S u g a r
w a s n , 它 a fa e 七o r fo r th e in d u e 七io n o f fr e e z in g 七o le r a n e e in e o ld a e e li m a tio n o f
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Ke y w o r d s A e a e‘a , 。e a r n s‘￡, s u s p e n s io n e e ll, e o l注 a e e li m a t io n , s o lu b le
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