全 文 ：第 51 卷 第 2 期
2 0 1 5 年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 2
Feb．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150218
收稿日期: 2014 － 04 － 21; 修回日期: 2014 － 07 － 19。
基金项目: 河南省基础与前沿技术研究计划项目(092300410244) ; 河南省教育厅科学技术研究重点项目(12B180032)。
茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因 CsＲIP1 和 CsＲIP2 的
克隆与表达分析
袁红雨1 马 宁1 杨会敏2 庞秋芬1 谢素霞1 程 琳1
(1．信阳师范学院生命科学学院 信阳 464000; 2．红河学院生物科学与技术学院 蒙自 661100)
摘 要: 【目的】克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因 CsＲIP1 和 CsＲIP2，探讨 CsＲIPs 基因的组织表达特异性以及
假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对其表达的影响。【方法】Cs-Ev2(GenBank 登录号: GH618807)为一受假眼小绿叶
蝉取食诱导的茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的 cDNA 片段，利用 ＲACE 技术克隆该基因的全长 cDNA，命名为
CsＲIP1(GenBank 登录号: FJ648831)。利用 ＲT-PCＲ 技术从茶树子叶中分离出一个新的Ⅱ型核糖体失活蛋白基因
的 cDNA 序列，命名为 CsＲIP2(GenBank 登录号: GU951535)。利用 PCＲ 技术克隆 CsＲIPs 的基因组序列。设计基
因特异性引物，利用 Ｒeal-time qＲT-PCＲ 技术检测 CsＲIPs 的组织表达特异性，以及在叶片中假眼小绿叶蝉和机械伤
害处理对其表达的影响。【结果】CsＲIP1 和 CsＲIP2 的序列一致性为 98%，都含有一个 1 713 bp 的开放阅读框，编
码 570 个氨基酸残基，但是它们具有不同的 3 非翻译区。CsＲIP1 和 CsＲIP2 由信号肽序列、1 个 ＲIP 结构域、链接
肽和 2 个 ＲBL 结构域组成。CsＲIPs 与其他Ⅱ型 ＲIPs 具有较高的序列一致性，Ⅱ型 ＲIPs 保守的氨基酸残基，包括
构成 A 链 N －糖苷酶活性位点的氨基酸残基、B 链中形成寡糖链结合位点的氨基酸残基、形成链间和链内二硫键
的半胱氨酸残基以及 ＲBL 结构域中的 QxW 基序，均出现在 CsＲIPs 相应的位置上。系统进化树分析结果显示，同
一物种的Ⅱ型 ＲIPs 首先聚类合并，2 个 CsＲIP 与樟的Ⅱ型 ＲIPs 聚为一支。比较 CsＲIPs 的 cDNA 序列和基因组序
列，发现它们的基因组序列不含内含子。CsＲIPs 基因的表达具有组织特异性，CsＲIP1 在叶片中的表达水平最高，在
子叶中的表达水平最低，而 CsＲIP2 在子叶中的表达水平最高，在叶片中的表达水平最低。在叶片中，CsＲIP1 和
CsＲIP2 的表达均受假眼小绿叶蝉取食的强烈诱导，并且其表达水平随着取食时间的增加而逐渐增加，取食 48 h
后，它们的表达水平大约分别是对照的 120 和 100 倍。在叶片中，CsＲIPs 基因的表达也受机械伤害处理的诱导，
CsＲIP1 的转录水平在处理后 6 h 达到最大值，CsＲIP2 在处理后 6 h 表达水平显著升高，12 h 达到最大值。【结论】
克隆茶树的 2 个Ⅱ型核糖体失活蛋白基因，它们可能参与茶树的防卫反应，且已发生亚功能化。进一步分析这 2
个基因的启动子，可以加深对 CsＲIPs 基因转录调控以及 ＲIPs 的生物学功能的理解。
关键词: 茶树; 假眼小绿叶蝉; Ⅱ型核糖体失活蛋白; CsＲIP1; CsＲIP2
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)02 － 0147 － 07
Cloning and Expression of Type Ⅱ Ｒibosome Inactivating
Protein Genes CsＲIP1 and CsＲIP2 from Camellia sinensis
Yuan Hongyu1 Ma Ning1 Yang Huimin2 Pang Qiufen1 Xie Suxia1 Cheng Lin1
(1 ． College of Life Sciences，Xinyang Normal University Xinyang 464000;
2 ． College of Life Science and Technology，Honghe University Mengzi 661100)
Abstract: 【Objective】To clone ribosome inactivating protein (ＲIP) genes from Camellia sinensis，and to study tissue-
specific expression of CsＲIPs and effects of Empoasca vitis feeding and mechanical damage on the expression of CsＲIPs．
【Method】Cs-Ev2 (GenBank accession number: GH618807) is the cDNA fragment of a type Ⅱ ＲIP gene of tea plants，
which was up-regulated by mild infestation of green leafhopper． Its full length cDNA sequence was cloned by ＲACE
method，and designated as CsＲIP1 (GenBank accession number: FJ648831) ． The cDNA sequence of a new type Ⅱ ＲIP
gene was cloned by ＲT-PCＲ method from developing cotyledons of tea plants，and designated as CsＲIP2 ( GenBank
accession number: GU951535 ) ． The genomic sequence of CsＲIP1 and CsＲIP2 was obtained by PCＲ method． Their
tissue-specific expression pattern and expression characteristics induced by E． vitis feeding and mechanical damage were
detected by Ｒeal-time qＲT-PCＲ，using gene-specific primers． 【Ｒesult】Both of CsＲIP1 and CsＲIP2 contained an open
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reading frame of 1 713 bp，encoding a predicted protein of 570 amino acid residues，but their 3 UTＲs were different．
Analysis of the amino acid sequence showed that the predicted precursors of CsＲIP1 and CsＲIP2 consisted of a signal
peptide sequence，a ＲIP domain，and two ＲBL domains． CsＲIPs had a high identity to other type Ⅱ ＲIPs at the overall
amino acid level． The conserved amino acid residues，including all residues that form active-site of ＲNA N-glycosidase of
A chain，residues that form two sugar-binding sites of B chain，cystein residues that form one interchain and four
intrachain disulfide bonds，and QxW motif of ＲBL domains，are strongly conserved in CsＲIP1 and CsＲIP2． Phylogenetic
analysis showed that different type Ⅱ ＲIPs from one species form a subgroup first，and two CsＲIPs are closely related to
type Ⅱ ＲIPs from Cinnamomum camphora． The comparison of the CsＲIP cDNA sequences and their corresponding
genomic sequences illustrated that the CsＲIP genes have no intron． CsＲIPs were expressed with tissue specificity． The
transcript level of CsＲIP1 was the highest in leaves and lowest in cotyledons; while the transcript level of CsＲIP2 was the
highest in cotyledons，and lowest in leaves． The expression of CsＲIPs was induced by Empoasca vitis feeding dramatically
in leaf，and their expression level increased continuously，with approximately 120-fold and 100-fold higher after 48 h of
feeding，respectively． Mechanical damage enhanced the expression level of CsＲIPs in leaf． The expression level of CsＲIP1
reached maximal value after 6 h treatment． The expression level of CsＲIP2 increased remarkably after 6 h treatment，but
reached the maximal value after 12 h． 【Conclusion】Two type II ribosome inactivating protein genes from C． sinensis were
cloned，which presumably play a defense-related role． Further analysis of the promoters will deepen our understanding of
the transcriptional regulation of CsＲIP genes and our insight into the functions of ＲIPs in vivo．
Key words: Camellia sinensis; Empoasca vitis; Type Ⅱ ribosome inactivating protein; CsＲIP1; CsＲIP2
植物核糖体失活蛋白 ( ribosome inactivating
proteins，ＲIPs)是一种 rＲNA N － 糖苷酶，作用于真
核生物核糖体大亚基 28S rＲNA 上的一个高度保守
的茎环结构( ricin / sarcin)，切除其上的一个特定的
腺嘌呤残基，使延伸因子 EF-2 不再与核糖体结合，
从而抑制蛋白质的生 物合成 ( Lapadula et al．，
2012)。除了 rＲNA N －糖苷酶活性外，ＲIPs 还表现
出一系列其他酶学活性，例如超氧化物歧化酶和核
酸酶活性。一些 ＲIPs 的 N － 糖苷酶活性还能将腺
嘌呤从 rＲNA 的其他位点上释放出来，或者作用于
病毒的 ＲNA 和基因组 DNA 释放腺嘌呤(Peumans et
al．，2001)。ＲIPs 可分为 2 种主要类型: Ⅰ型 ＲIPs
为单链结构，具有 rＲNA N －糖苷酶活性; Ⅱ型 ＲIPs
为一异二聚体，由 1 条相当于Ⅰ型 ＲIP 的 A 链和 1
条具有凝集素性质的 B 链通过 1 个二硫键连接而
成，这 2 条多肽链均来自一个前体蛋白。
尽管目前对 ＲIPs 确切的生理活性尚未形成一
致的看法，但是越来越多的研究表明，ＲIPs 在植物
应答各种环境胁迫中发挥重要作用，是植物防御体
系的组成部分。ＲIP 基因的表达受多种环境胁迫的
诱导，其中非生物胁迫包括干旱、聚乙二醇、盐胁迫、
H2O2、热激和渗透压等，生物胁迫包括伤害、病毒、
真菌和昆虫等(Kawade et al．，2009)。在体外，几乎
所有被检测过的 ＲIPs 都具有广谱抗病毒活性，转基
因植物研究又为 ＲIPs 的抗病毒活性提供了新的证
据(Chen et al．，2002)。ＲIPs 还对昆虫表现出一定
的毒性，Bertholdo-Vargas 等(2009)发现 2 种鳞翅目
(Lepidoptera)昆虫摄食添加 5 种Ⅰ型核糖体失活蛋
白的叶片后，生长速度和存活率显著降低，细胞的
DNA 损伤增加; 表达西洋接骨木( Sambucus nigra)
Ⅱ 型 核 糖 体 失 活 蛋 白 SNA-I 的 转 基 因 烟 草
(Nicotiana tabacum cv． Samsun NN)对烟蚜 (Myzus
nicotianae)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)产生抗性
(Shahidi-Noghabi et al．，2009); 辛纳毒蛋白对棉铃
虫(Helicoverpa armigera)和淡色库蚊 ( Culex pipiens
pallens)的幼虫具有毒性(Zhou et al．，2000)。
Yang 等(2011)在研究茶树 ( Camellia sinensis)
对刺吸式口器昆虫的应答反应时，从茶树‘凫早 2
号’(C． sinensis‘Fuzao 2’)叶片中分离出一种受假
眼小绿叶蝉(Empoasca vitis)取食诱导的Ⅱ型核糖体
失活 蛋 白 基 因 的 cDNA 片 段，命 名 为 Cs-Ev2
(GenBank 登录号: GH618807)。了解茶树Ⅱ型核
糖体失活蛋白基因在植物抗虫中的作用，对林木抗
虫基因工程具有重要意义。本研究以假眼小绿叶蝉
取食的茶树幼叶 SMAＲT cDNA 文库为模板，采用
ＲACE 技术克隆了该基因的全长 cDNA ( CsＲIP1)，
并利用 PCＲ 技术分离出另一个在茶树种子中表达
的Ⅱ型 ＲIP 基因(CsＲIP2)。同时还分析了这 2 个
茶树Ⅱ型 ＲIP 基因在假眼小绿叶蝉和机械伤害处理
不同时间的表达情况。试验结果将为进一步分析
CsＲIP1 和 CsＲIP2 的亚功能化以及其在茶树抗虫中
的作用创造条件。
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第 2 期 袁红雨等: 茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因 CsＲIP1 和 CsＲIP2 的克隆与表达分析
1 材料与方法
1. 1 材料与处理 以在营养钵生长 2 年的茶树栽
培品种‘凫早 2 号’的幼苗为试验材料进行假眼小
绿叶蝉和机械伤害处理。处理前将茶树幼苗置于温
度 25 ～ 28 ℃、光照强度 160 μmol·m － 2 s － 1、光照时间
12 h·d － 1的条件下生长 7 天。
假眼小绿叶蝉处理: 每一茶树幼苗接种 50 头
左右的假眼小绿叶蝉成虫，用通风良好的塑料网罩
将茶树幼苗罩上，接虫 3，6，12，24，48 h 后剪取充分
伸展的茶树叶片。机械伤害: 用剪刀将茶树叶片的
边缘剪去，分别在处理 3，6，12，24，48 h 后剪取叶
片。每种处理 3 次重复，每次取 6 株，以培养在相同
条件下未进行处理的茶树幼苗作为对照。对照和各
种处理的叶片采集后迅速用液氮处理，并置于
－ 80 ℃冰箱中保存。
1. 2 CsＲIP1 基因全长 cDNA 的克隆 根据 Cs-Ev2
cDNA 片段的核苷酸序列设计 1 对特异性引物
CsＲIP-F1 ( 5-ATACAGTTGTGGCCGTGTGA-3) 和
CsＲIP-Ｒ1(5-TGACTCTGCGCTGAGGACTA-3)用于
5ＲACE 和 3 ＲACE。以 5-ready ＲACE cDNA 文库
为模板 (谢素霞等，2013 )，利用 5 通用引物和
CsＲIP-Ｒ1 扩增该基因 cDNA 的 5 末端，反应程序
为: 96 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃
2 min，30 个循环。以 3-ready ＲACE cDNA 文库为
模板，利用 3通用引物和 CsＲIP-F1 扩增该基因
cDNA 的 3 末端，反应程序为: 96 ℃ 2 min; 94 ℃
30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环。
拼接 5ＲACE 产物和 3 ＲACE 产物，得到 CsＲIP1
的全长 cDNA，并利用 NCBI 网站预测其 OＲF，根据 5
和 3 非 编 码 区 序 列 设 计 引 物 CsＲIP-F2 ( 5-
CTGCTACTGAAACGAAATATGAAAG-3)和 CsＲIP-Ｒ2
( 5-TAGGGAATGACAAACAACCAAGTAGGC-3)，扩
增该基因完整的 OＲF，反应程序为: 96 ℃ 2 min;
94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30 个循环。
1. 3 CsＲIP2 基因 cDNA 的克隆 利用 ＲNeasy plant
mini kit(Qiagen，德国)从茶树子叶中提取总 ＲNA，
用 DNase I(Promega，美国)处理总 ＲNA 以去除其中
残余的 DNA。用 First Strand cDNA Synthesis 试剂盒
(Fermentas)合成第 1 链 cDNA，以第 1 链 cDNA 为
模板，利用特异引物 CsＲIP-F2 和 CsＲIP-Ｒ2 扩增
CsＲIP2 基因的 cDNA 序列。
将 PCＲ 产物凝胶电泳后，回收目的片段，将目
的片段与 pMD19-T 载体 (大连宝生物工程有限公
司)连接并转化 DH5α，重组质粒鉴定后测序。
1. 4 CsＲIP 基因组 DNA 的克隆 按照 Plant DNA
Isolation Ｒeagent 试剂盒 (大连宝生物工程有限公
司)说明书，以茶树叶片为材料提取茶树的基因组
DNA。以基因组 DNA 为模板，利用特异引物 CsＲIP-
F2 和 CsＲIP-Ｒ2 扩增 CsＲIP 基因的 gDNA 序列。
1. 5 Ｒeal-time qＲT-PCＲ 分析 CsＲIP 基因的表达
分别选取茶树的幼根、茎、叶 片 和 子 叶，用 Trizol
Ｒeagent( Invitrogen)提取总 ＲNA，通过琼脂糖凝胶电
泳和紫外分光光度计检测 ＲNA 的完整性和浓度。
用 First Strand cDNA Synthesis 试剂盒(Fermentas)合
成第 1 链 cDNA，用于检测 CsＲIP1 和 CsＲIP2 在不同
组织中的表达水平。选取不同处理的茶树幼苗完全
伸展的叶片，分别提取总 ＲNA，以检测 CsＲIP 基因
的表达水平。
根据 2 个 CsＲIP 基因 3 UTＲ 的差异性区域，分
别设计 CsＲIP1 基因特异性的实时荧光定量 ＲT-PCＲ
分 析 引 物 CsＲIP1-F ( 5-CCAATCCAATCCTCC
AGCAA-3) 和 CsＲIP1-Ｒ ( 5-GGGCCTTCTTTGG
ATTCAGCG-3)，以及 CsＲIP2 基因特异性的实时荧
光 定 量 ＲT-PCＲ 引 物 CsＲIP2-F ( 5-CCAATCC
AATCCTCCAGCAA-3)和 CsＲIP2-Ｒ(5-ACAAACGA
CGATTGAGCGCA-3)。采用茶树的 α-tubulin 基因
(上游引物: 5-CCACTCATTCCCTCCTTGAA-3; 下
游引物: 5-ATGGCTCCATCAAACCTCAG-3)作为内
参对不同样品 cDNA 的模板量进行校准。
按照 TaKaＲa 公司 SYBＲ Premix Ex TaqTM(Tli
ＲNaseH Plus) 试剂盒说明书进行实时荧光定量
PCＲ 反应，反应体系为: cDNA 模板 2 μL，2 × SYBＲ
Premix Ex TaqTM 10 μL，上、下游引物 ( 10 μmol ·
L － 1)各 0. 4 μL，50 × ＲOX Ｒeference Dye 0. 4 μL，
ddH2O 6. 8 μL。每个样品设 3 次重复。PCＲ 反应
在 ABI PＲISM 7300 Ｒeal-Time PCＲ 仪 ( Applied
Biosystems)上进行，程序为: 95 ℃ 1 min; 95 ℃
15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 个循环; 设定程序，
使扩增结束后 PCＲ 仪自动运行绘制熔解曲线
(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s)。数据分析按
2 － ΔΔCT方法 (Livak et al．，2001) 进行。在组织表达
分析中，用表达量最低的组织作为对照，在胁迫处理
的表达分析中，以未处理的材料作为对照，计算试验
组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。
2 结果与分析
2. 1 CsＲIP 基因克隆与序列分析 以 SMAＲT
cDNA 为模板，5 ＲACE 和 3 ＲACE 扩增后，1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到 1 条特异的条带。
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克隆测序后发现，5ＲACE 产物长 1 330 bp(图 1A)，
其 3 端序列与 Cs-Ev2 的 5 端序列完全重叠;
3 ＲACE产物长936 bp(图 1B)，其 5端与 Cs-Ev2 的
3端完全重叠; 拼接后得到 2 032 bp 的全长 cDNA，
命名为 CsＲIP1(GenBank 登录号: FJ648831)。该序
列包含 5 非翻译区 73 bp、3 非翻译区 224 bp、阅读
框 1 713 bp，编码 570 个氨基酸残基，其预测分子质
量为 63. 55 kDa，等电点为 4. 75。根据 CsＲIP1 基因
的5 UTＲ和 3 UTＲ 分别设计引物 CsＲIP-F2 和
CsＲIP-Ｒ2，以上述 SMAＲT cDNA 为模板扩增得到
1 893 bp长的 cDNA 序列，含有一个与拼接序列相同
的阅读框(图 1C)。
图 1 CsＲIP1 基因的 cDNA 扩增
Fig． 1 The amplification of CsＲIP1 cDNA with PCＲ method
M: DNA Marker; A: CsＲIP1 的 5 ＲACE 产物; B: CsＲIP1 的3ＲACE
产物; C: CsＲIP-F2 和 CsＲIP-Ｒ2 的扩增结果。
M: DNA Marker; A: Product of 5 ＲACE; B: Product of 3ＲACE; C:
Product of amplification with CsＲIP-F2 and CsＲIP-Ｒ2．
植物的Ⅱ型 ＲIPs 常常在植物的种子中积累，本
研究以茶树子叶( ～ 210 DAF)的 mＲNA 为模板，采
用 CsＲIP-F2 和 CsＲIP-Ｒ2 进行 ＲT-PCＲ 扩增。对扩
增产物克隆测序后，发现了 1 个新的茶树Ⅱ型核糖
体失活蛋白基因，命名为 CsＲIP2(GenBank 登录号:
GU951535)。CsＲIP2 与 CsＲIP1 有 98%的序列一致
性，也含有一个 1 713 bp 的 OＲF，编码产物与
CsＲIP1 具有 96% 的相似性。与 CsＲIP1 相比，已克
隆的 CsＲIP2 的 3 UTＲ 缺失了一段 15 bp 的序列。
利用 CsＲIP-F2 和 CsＲIP-Ｒ2，以来自叶片的基
因组 DNA 为模板进行 PCＲ 扩增，克隆 CsＲIP1 和
CsＲIP2 的基因组序列。测序后发现，CsＲIP1 和
CsＲIP2 基因的 gDNA 都不含内含子。
2. 2 CsＲIP 基因编码产物的结构域分析和同源性
比较 通过 Signal 4. 1 软件分析发现，CsＲIP 含有 1
个由 22 个氨基酸残基组成的信号肽，其切割位点在
第 22 位的缬氨酸和第 23 位的半胱氨酸之间。
SMAＲT 在线预测软件分析表明，CsＲIPs 含有 1 个
ＲIP 结构域 (氨基酸残基 36—289 ) 和 2 个 ricin
B-like(ＲBL)结构域 (氨基酸残基 316—442，446—
569)。ＲIP 结构域相当于Ⅱ型 ＲIP 的 A 链，而 B 链
由 2 个 ＲBL 结构域组成。
BLASTP 搜索 GenBank 数据库，发现 CsＲIPs 与
樟(Cinnamomum camphora)的辛纳毒蛋白Ⅲ前体、
蓖麻 ( Ｒicinus communis)毒素前体、相思子 ( Abrus
precatorius)毒素 － a、美丽相思子 ( Abrus pulchellus)
的 prepropulchellin Ⅳ 具 有 较 高 的 序 列 相 似 性
(61% ～ 54% )。序列比对表明相思子毒素 － a 和
蓖麻毒素 A 链的 N － 糖苷酶活性中心裂隙中所有
的氨基酸残基均出现在 CsＲIPs 的相应位置上
(图 2)。
白果槲寄生(Viscum album)的凝集素 I、蓖麻毒
素和相思子毒素 － a 的 B － 链含有 2 个同源的 ＲBL
结构域，每个 ＲBL 结构域具有 3 个谷氨酰胺 －任意
氨基酸 －色氨酸(QxW)重复基序。序列比对显示，
CsＲIPs 的每个 ＲBL 结构域在对应位置上均含有 3
个保守的 QxW 基序。蓖麻毒素的 2 个碳水化合物
结合位点各由 5 个保守的氨基酸残基组成，这 2 组
氨基酸残基在 CsＲIPs 的 B 链中也高度保守(图 2)。
与其他Ⅱ型 ＲIPs 一样，CsＲIPs 的 A 链靠近 C 末端
的位置上有 1 个半胱氨酸残基，B 链上有 9 个保守
的半胱氨酸残基。
2. 3 CsＲIP 基因编码产物的系统进化树分析 核
糖体失活蛋白以多基因家族的形式存在于植物的基
因组中。分别从 8 种植物中选取序列差别最大的 2
种Ⅱ型 ＲIPs，同茶树的 2 种Ⅱ型 ＲIPs 一起，采用
DNAMAN 软件中的邻接法( neighbor-joining)构建进
化树。结果表明，同一物种的 ＲIPs 首先聚类合并，
茶树的 2 种 ＲIPs 与樟的 ＲIPs 聚为一支，蓖麻、荷兰
鸢尾( Iris × hollandica)、西洋接骨木和白果槲寄生
的 ＲIPs 聚为一支，美丽相思子和相思子的 ＲIPs 聚
为一支(图 3)。
2. 4 CsＲIP 基因在不同组织中的表达分析 利用
Ｒeal-time qＲT-PCＲ 技术检测 CsＲIP1 和 CsＲIP2 在
茶树 4 种不同组织中的表达模式，结果(图 4)显示，
CsＲIP1 和 CsＲIP2 在幼根、茎、叶和子叶中均有表
达。CsＲIP1 在叶中的表达水平最高，约为子叶的
5. 5 倍、幼根的 4. 4 倍、茎的 2. 4 倍; CsＲIP2 在子叶
中的表达水平最高，约为叶的 6 倍、幼根的 3 倍、茎
的 1. 6 倍。
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第 2 期 袁红雨等: 茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因 CsＲIP1 和 CsＲIP2 的克隆与表达分析
图 2 不同物种Ⅱ型核糖体失活蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 2 Amino acid multiple alignment of type Ⅱ ＲIPs from different species
黑色表示在所有 6 种蛋白质氨基酸序列中都相同的氨基酸残基; 灰色表示在 5 种蛋白质氨基酸序列中都相同的氨基酸残
基; “* ”表示构成 A 链 N －糖苷酶活性位点的氨基酸残基; “▲”和“:”分别表示 B 链中形成碳水化合物结合位点的氨基酸
残基; “ +”表示形成链间和链内二硫键的半胱氨酸残基; “QxW”表示 QxW 基序。CsＲIP1: 茶树核糖体失活蛋白 1
(ACV60361) ; CsＲIP2: 茶树核糖体失活蛋白 2(ADF45510) ; ricin: 蓖麻毒素前体(XP_002534649) ; abrin-a: 相思子毒素 － a
(AAA32624) ; Lectin Ⅰ: 白果槲寄生凝集素Ⅰ(AAＲ25545) ; cinna Ⅲ: 樟辛纳毒蛋白Ⅲ前体(AAK82460)。
Amino acids identical in all six proteins are shaded black，while amino acid residues that are conserved in at least five of the six
sequences are shaded grey． The amino acids that form the ＲNA N-glycosidase active site in A-chain are indicated with ( * )，whereas
amino acids that form two separate carbohydrate-binding sites in B-chain are marked by (▲) and ( :) ． Ten cysteines that form one
interchain and four intrachain disulfide bonds in six ＲIPs are marked by ( + ) ． QxW motifs in B chain are indicated with (QxW) ．
CsＲIP1: Camellia sinensis ribosome inactivating protein 1 ( ACV60361 ) ; CsＲIP2: C． sinensis ribosome inactivating protein 2
(ADF45510) ; ricin: Ｒicinus communis preproricin (XP_002534649) ; abrin-a: Abrus precatorius abrin-a (AAA32624) ; Lectin Ⅰ:
Viscum album lectin Ⅰ(AAＲ25545) ; cinna Ⅲ: Cinnamomum camphora cinnamomin Ⅲ precursor (AAK82460) ．
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图 3 基于不同物种Ⅱ型 ＲIP 氨基酸序列构建的系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree derived from the alignment of the amino acid sequences of type Ⅱ ＲIPs from different plant species
图 4 CsＲIP 基因组织特异性表达分析
Fig． 4 Expression of two CsＲIP genes in different tissues of C． sinensis
2. 5 假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对 CsＲIP 基因
表达的影响 荧光定量 ＲT-PCＲ 分析表明，2 个
CsＲIP 基因的表达均受假眼小绿叶蝉取食的强烈诱
导，并且具有类似的表达谱。从图 5 可知，假眼小绿
叶蝉取食 3 h 后，CsＲIP1 和 CsＲIP2 表达开始升高，
并且取食时间越长表达量越高，取食 48 h 后，
CsＲIP1 和 CsＲIP2 转录本水平大约分别是对照的
120 和 100 倍(图 5)。机械伤害处理后，CsＲIP1 表
达升高，处理后 6 h 达到最大值，随后逐渐下降，处
理后 48 h 再度增强(图 6); CsＲIP2 在机械伤害处
理后 6 h，表达水平显著升高，12 h 达到最高水平，
约为对照的 9. 5 倍，以后逐渐下降，处理后 48 h，降
至对照水平的 1 /2。
3 讨论
植物体常常编码一组不同的 ＲIPs，例如对水稻
(Oryza sativa)和蓖麻的基因组进行扫描，发现水稻
的基因组含有 31 个Ⅰ型 ＲIP 基因 ( Jiang et al．，
2008)，蓖麻的基因组含有 7 个 Ⅱ 型 ＲIP 基因
图 5 假眼小绿叶蝉处理对 CsＲIP 基因表达的影响
Fig． 5 Expression of two CsＲIP genes in response to E． vitis feeding
图 6 机械伤害处理对 CsＲIP 基因表达的影响
Fig． 6 Expression of two CsＲIP genes in
response to mechanical damage
(Leshin et al．，2010)，ＲIP 基因家族不同成员的表达
常常表现出组织特异性和发育阶段的特异性，并且
应答不同的环境胁迫。本研究从茶树中分离出 2 个
Ⅱ型核糖体失活蛋白基因，这 2 个 ＲIP 基因均含有
1 个 1 713 bp 的读码框，编码 570 个氨基酸残基。
CsＲIP1 的 5 UTＲ 和 3 UTＲ 的长度分别是 73 bp 和
224 bp，与 CsＲIP1 基因的 3 UTＲ 相比，除了 1 个位
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第 2 期 袁红雨等: 茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因 CsＲIP1 和 CsＲIP2 的克隆与表达分析
置上的碱基不同之外，CsＲIP2 基因已克隆的 3 UTＲ
缺失了一 段 15 bp 的 核 苷 酸 序 列。 CsＲIP1 和
CsＲIP2 编码产物具有 98%的一致性，结构域分析表
明，CsＲIPs 的编码产物由信号肽、A 链、链接肽和 B
链组成。Ⅱ型核糖体失活蛋白前体在成熟的过程
中，信号肽和链接肽被切除，A 链和 B 链通过 1 个二
硫键连接起来。
Ⅱ型 ＲIPs 的 A 链具有 N －糖苷酶活性，氨基酸
序列的多重比对结果表明，其活性中心位点保守的
氨基酸残基均出现在 CsＲIPs A 链的相应位置上。
另外，低水平的赖氨酸残基也是 A 链发挥其酶学活
性的关键因素，蓖麻毒蛋白的 A 链含有 2 个赖氨酸
残基，而 CsＲIPs 的 A 链仅带有 1 个赖氨酸残基。低
水平的赖氨酸残基可能有助于 A 链躲避细胞质中
蛋白酶体的降解(Di et al．，2005)，作用于 rＲNA。
Ⅱ型 ＲIPs 的 B 链能够结合细胞表面寡糖链上
的半乳糖残基，介导毒蛋白的内吞过程。通过对蓖
麻毒蛋白和 abrin-a 的晶体结构分析发现，Ⅱ型 ＲIPs
的 B 链含有 2 个重复的结构域，而每个结构域又进
一步分成 3 个大约由 40 个氨基酸残基组成的亚结
构域。因此，Ⅱ型 ＲIPs 的 B 链可能起源于一个编码
40 个氨基酸残基的基因，该原初基因首先发生 3 次
重复，形成 ＲBL 结构域的编码序列，然后再发生 1
次重复，形成 2 个 ＲBL 结构域。由于每个亚结构域
中存在 1 个 QxW 基序，因此 ＲBL 结构域又称为
(QxW) 3 结构域 (Hazes，1996)。相同的结构模式
和保守的氨基酸残基也存在于 CsＲIPs 的 B 链上。
尽管 2 个 CsＲIP 基因在已检测的 4 种组织中均
有表达，但仍表现出一定的组织特异性。CsＲIP1 在
叶片中的表达水平最高，而 CsＲIP2 在发育的子叶中
高度表达。在本试验中，假眼小绿叶蝉取食快速诱
导 CsＲIPs 基因的表达，并且随着取食时间的延长，
CsＲIPs 基因的表达量逐渐增加。机械伤害显著诱
导 CsＲIPs 基因的表达，但是在伤信号的诱导下，
CsＲIP1 和 CsＲIP2 的表达模式存在较大差别。结果
表明 CsＲIPs 基因可能参与茶树的防卫反应，且已经
发生亚功能化。系统进化树分析显示，一种植物的
Ⅱ型 ＲIPs 首先聚类，说明Ⅱ型核糖体失活蛋白基因
在植物体中发生扩增是一个近期事件。序列分析显
示，CsＲIPs 与樟的 cinnamomin Ⅲ的一致性最高，约
为 63%。cinnamomin 被认为是樟种子的贮藏蛋白
(Liu et al．，2002)，因此可以设想昆虫取食的选择压
力导致 CsＲIPs 演变成一种防卫蛋白，并在进化的过
程中获得了在叶片中表达且受昆虫取食诱导的
特性。
参 考 文 献
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(责任编辑 徐 红)
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