全 文 ：第 50 卷 第 9 期
2 0 1 4 年 9 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 9
Sep．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140923
收稿日期: 2013 － 12 － 04; 修回日期: 2014 － 03 － 28。
基金项目: 国家自然科学基金项目“刺槐杂交结实率低的机理研究”(31170629) ; 国家科技支撑项目“抗逆生态树种刺槐新品种选育技术
研究”(2012BAD01B0601) ; 北京市科委项目“首都平原百万亩造林科技支撑工程”(Z121100008512002)。
* 李云为通讯作者。
刺槐实时定量 PCＲ分析中内参基因的选择*
王金星1 张利军2 廖资亿3 张运根4 邱乾栋1 孙 鹏1，5
孙宇涵1 胡瑞阳1 卢 楠1 李 云1
(1． 林木育种国家工程实验室 林木、花卉遗传育种教育部重点实验室 北京林业大学生物科学与技术学院 北京 100083;
2． 北京风沙源育苗中心 北京 102115; 3． 福建省三明市国有林场管理处 三明 365000; 4． 福建省宁化国有林场 宁化 365413;
5．中国林业科学研究院经济林研究开发中心 郑州 450003)
关键词: 刺槐; 内参基因; 实时荧光定量 PCＲ; GeNorm; NormFinder
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)09 － 0000 － 00
The Selection of Ｒeference Genes for Ｒeal-Time Quantitative PCＲ Normalization in
Black Locust(Ｒobinia pseudoacacia)
Wang Jinxing1 Zhang Lijun2 Liao Ziyi3 Zhang Yungen4 Qiu Qiandong1 Sun Peng1，5
Sun Yuhan1 Hu Ｒuiyang1 Lu Nan1 Li Yun1
(1 ． National Engineering Laboratory for Tree Breeding Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants of Ministry of Education College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University Beijing 100083;
2 ． Beijing Sandstorm Source Nursery Center Beijing 102115; 3 ． Administrative Department of State-Owned Forest Farm of Sanming City
in Fujian Province Sanming 365000; 4 ． The State-Owned Forest Farm of Ninghua County in Fujian Province Ninghua 365413;
5 ． Non-Timber Forestry Ｒesearch and Development Center，Chinese Academy of Forestry Zhengzhou 450003)
Abstract: The real-time PCＲ is an important method for analyzing gene expression levels． Selection of reference genes
suitable for calibration of the expression of objective gene according to specific experimental materials and conditions is a
prerequisite for obtaining reliable ＲT-PCＲ results． In this study，we used different individuals and different organs of
black locust(Ｒobinia pseudoacacia) to test the stability of six internal genes such as Actin gene ( ACT)，18S ribosomal
ＲNA (18S rＲNA)，adenosylmethionine decarboxylase gene (SAMDC)，helicase gene (Helicase)，elongation factor gene
(EF1-α)，glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase gene (GAPDH) in the real-time PCＲ． After being analyzed with
Genorm and NormFinder，the results showed that the ACT and 18S rＲNA gene were the most stable genes by using
different plant individuals as experimental material，while the ACT and GAPDH were the most stable genes with using
different tissues and organs． Since some controversies existed with the 18S rＲNA as reference gene，the both ACT and
GAPDH used for reference gene in various test conditions obtained more accurate results． This study has important
implications in obtaining a more accurate result of quantitative expression of black locust．
Key words: Ｒobinia pseudoacacia; reference gene; real-time quantitative PCＲ; GeNorm; NormFinder
实 时 荧 光 定 量 PCＲ 是 由 美 国 Applied
Biosystems 公司于 1996 年在传统的 PCＲ 技术基础
上发展起来的一种新的核酸定量技术 (Mackay，
2004)，具有定量准确、灵敏度高、特异性强、重复性
好及高通量等优点(Huggett et al．，2005)，已成为医
学、农学、林学、微生物学等众多领域中进行基因表
达和转录组分析的常用技术之一 ( Postollec et al．，
2011; 袁亚男等，2008)。然而，在其分析过程中，
ＲNA 的产量和质量、反转录效率的差异以及其他因
素都可能会对目的基因的表达分析结果的准确性产
生影响(Paolacci et al．，2009)，因此，需要合适的内
参基因进行校正和标准化，从而减少试验结果的误
差(Nolan et al．，2006)。理想的内参基因应该在不
同的器官、植物发育的不同阶段及不同的试验条件
林 业 科 学 50 卷
下表达均保持一致，常用的内参基因是构成细胞骨
架的主要组分或是参与生物体基本代谢过程的一些
基因(如 ACT，TUB，UBQ 等基因)，这些基因基本上
可以在植物不同器官中稳定地表达(Gutierrez et al．，
2008)。近来的研究表明，没有任何一种内参基因
的表达是始终稳定的，在不同的植物、同一种植物不
同器官及不同生长发育阶段、生物及非生物胁迫下
都会引起内参基因的特异性表达，因此每种特定条
件 下 都 有 特 定 的 稳 定 表 达 的 内 参 基 因
(Vandesompele et al．，2002; Bustin et al．，2009)，如
不加筛选盲目地以一种内参基因作为所有试验条件
下的 内 参，很 难 得 到 准 确 的 定 量 结 果。如
Vandesompele 等(2002)证实一种内参基因在 10%
的样品中可导致 6. 4 倍的表达误差。因此，在 qPCＲ
试验中，根据特定的试验材料选择合适的内参基因
极其重要(王彦杰等，2012)
刺槐(Ｒobinia pseudoacacia )原生于北美洲，后
被广泛引种到欧洲、亚洲等地。刺槐生长速度快、材
质坚硬、抗腐能力强，是重要的速生用材树种(习洋
等，2012)。其叶片含有大量粗蛋白，可作饲料，根
部有根瘤，可通过生物固氮增加土壤肥力; 刺槐的
花属于蝶形花，开花时香气四溢，并且可供食用
(Keeler，1900)。此外，刺槐还是一种重要的蜜源植
物(孙鹏等，2012)。综上所述，刺槐具有很好的生
态和经济价值。但目前刺槐的分子生物学研究基础
比较薄弱，内参基因的稳定性验证还未见报道，该方
面的空缺极大地限制了刺槐分子生物学的研究。
本研究以 4 株不同遗传背景的刺槐单株上的叶
片以及同一植株刺槐的不同器官(叶、花、根、茎、豆
荚)为材料，通过分析这些材料的刺槐荧光定量数
据，对 6 个候选内参基因( ACT，Helicase，18S rＲNA，
SAMDC，GAPDH，EF1-α)在不同单株以及不同器官
的 稳 定 性 进 行 鉴 定。通 过 使 用 GeNorm 和
Bestkeeper 2 个内参基因稳定性分析软件，在一系列
不同功能的候选内参基因中筛选出最为稳定的内参
基因用于目标基因的校正和标准化，从而达到准确
定量的试验目的，为刺槐的分子生物学研究打下
基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料 于 2013 年 5 月份在北京市延庆县
米家堡林场的刺槐成年实生林中，随机选择相距 50
m 以上的 4 株单株(以确保单株的遗传背景不同，
防止根萌植株)。采集这 4 株单株上的叶片用以比
较不同株系间内参基因的稳定性，同时采集其中 1
单株的根、茎、叶、花、豆荚器官，用以比较不同器官
间内参基因的稳定性。样品采集后液氮速冻，－ 80
℃贮藏备用。
1. 2 ＲNA 提取及 cDNA 第 1 链合成 利用 Aidlab
公司的植物总 ＲNA 提取试剂盒提取各个样品的总
ＲNA，步骤按照说明书进行，用 Nanodrop ND-1000
测定 ＲNA 浓度，ＲNA 的完整性通过 1. 2%的琼脂糖
凝胶电泳检测。反转录按照 Aidlab 反转录 cDNA 第
1 链试剂盒的操作方法，以各个样品中 1 000 ng 总
ＲNA 为模板将各个样品反转录合成 cDNA 第 1 链，
获得的产物直接用于 PCＲ 或 － 20 ℃储藏备用。
1. 3 内参基因的选择及荧光定量 PCＲ 引物的设计
选取刺槐肌动蛋白基因 ( actin，ACT)、18S 核糖体
ＲNA ( 18S rＲNA )、腺 苷 甲 硫 氨 酸 脱 羧 酶 基 因
(SAMDC)、甘油醛 － 3 －磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、
解 旋 酶 基 因 ( Helicase )、转 录 延 伸 因 子 基 因
(EF1-α)，所有基因片段均为本实验室自行克隆，登
录 号 分 别 为 KJ587742，KJ587743，KJ587744，
KJ587745， KJ587746， KJ587747。 利 用 Primer
Premier5. 0 软件，根据荧光定量 PCＲ 引物的设计原
则，分 别 设 计 ACT，GAPDH，18S rＲNA，SAMDC，
GAPDH，Helicase 6 个内参基因的 PCＲ 引物。引物序
列见表 1，引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。
1. 4 内参基因的 PCＲ 扩增 6 种内参基因的 PCＲ
扩增在 ABI PCＲ 扩增仪上进行，以各个样品的
cDNA 为模板进行 PCＲ 反应。反应体系为 cDNA 模
板 2 μL，正反引物 1 μL，MIX12. 5 μL，加 ddH2O 补
齐至 25 μL。反应条件: 95 ℃预变性 3 min; 95 ℃
变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循
环; 72 ℃延伸 5 min。最后用 1. 5% 的琼脂糖凝胶
电泳检测扩增引物的特异性。
1. 5 实时定量 PCＲ 用 TAKAＲA 公司的 SYBＲ
Green I 荧光定量 PCＲ 试剂和 ABI 公司的 7500Fast
荧光定量 PCＲ 仪进行 ＲT-PCＲ 试验。反应体系
20 μL: 2 × SYBＲ Premix Ex Taq 10 μL; ＲOX 0. 5
μL; ddH2O 7. 5 μL; cDNA template 1 μL; 正反引物
各 0. 5 μL。采用两步法进行 PCＲ 扩增，扩增条件如
下: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性 3 s，60℃退火30 s，
共 40 个循环; 之后进行 55 ～ 95 ℃溶解曲线分析。
每个样品 3 次生物学重复。
1. 6 数据处理和分析 用 GeNorm 和 NormFinder
软件，根据 6 个常用内参基因在刺槐不同器官中的
相对表达量(Q)对各个内参基因的表达稳定性进行
统计学分析，从而筛选出表达相对稳定的内参基因。
根据公式 Q = E△Ct，式中: E 为基因扩增效率，E 一
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第 9 期 王金星等: 刺槐实时定量 PCＲ 分析中内参基因的选择
般默认为 2 即扩增效率为 100% ; △Ct = Ctmi n －
Ct样品，Ct样品为每个样品的 Ct 值，Ctmin为不同样品中
内参基因的最小 Ct 值。
表 1 qPCＲ 中 6 种内参基因的引物序列
Tab． 1 The primers of reference genes used in quantitative real-time PCＲ
基因名称
Gene name
正向引物序列
Forward primer sequence(5—3)
反向引物序列
Ｒeverse primer sequence(5—3)
扩增产物大小
Amplicon length / bp
ACT TTGCCTTGGATTATGAACA GATGGCTGGAACAGAACTT 139
GAPDH TCAACAATGCCAAACCTG GTGTCAACGAGCACGAAT 115
18S rＲNA ATAAACGATGCCGACCAG CCTTGCGACCATACTCCC 105
EF1-α CTGCCAACTTCACATCCC CTTTACCGAACGCCTATC 146
SAMDC CAGCAGAGGCAGAGTAGACA ATTGAAGTTGGCGGAGGG 221
Helicase CTGACAAGATGCGAAGCC TCAATACCACGAGCCAAA 145
2 结果与分析
2. 1 ＲNA 样品的质量检测 所提取刺槐根、茎、
叶、花、豆荚样品的 ＲNA 经 Nanodrop ND-1000 紫光
分光光度计检测浓度和纯度，所测样品的 A260 /
A280 比值均为 2. 0 左右，且浓度均较高。琼脂糖凝
胶电泳(图 1)显示，刺槐每个器官 ＲNA 电泳图谱清
晰，28S rＲNA 的亮度约为 18S rＲNA 的 2 倍。表明
所提取的 ＲNA 质量好，可用于后续的分子生物学
试验。
图 1 刺槐各试验样品总 ＲNA 电泳图谱
Fig． 1 Agarose gel analysis of total ＲNA extracted from
different samples of Ｒobinia pseudoacacia
1 － 4: 单株 1 － 4; 5: 茎; 6: 根; 7: 花; 8: 豆荚。
1 － 4: Individual tree 1 － 4; 5: Stem; 6: Ｒoot; 7: Flower; 8: Pod．
2. 2 内参基因的 PCＲ 扩增 以刺槐单株 1 的叶的
cDNA 为模板，通过普通 PCＲ 扩增出与各内参基因
预期大小一致的基因片段，且没有见明显的引物二
聚体及非特异条带(图 2)，表明各内参基因引物均
能特异地扩增出相应的目的片段，可用于后续的
qPCＲ 试验。
2. 3 内参基因的荧光定量 PCＲ 分析 以刺槐不同
器官的 cDNA 为模板，进行荧光定量 PCＲ 分析。结
果(图 3)表明，6 个内参基因的引物在各个材料的
溶解曲线只有明显的单一峰，反映出具有较高的专
一性，且每个待测样品的扩增曲线重复性也很好，说
图 2 6 种内参基因的 PCＲ 扩增产物
Fig． 2 PCＲ products of six reference genes
M: DNA marker; 1: ACT; 2: EF1-α; 3: Helicase;
4: SAMDC; 5: 18S rＲNA; 6: GAPDH
明试验结果的可靠性很高。
2. 4 内参基因的稳定性分析 为筛选合适的内
参基因，用 GeNorm 软件对 6 个内参基因在不同单
株、不同器官中的表达稳定性进行统计，GeNorm
软件通过计算内参基因的表达稳定性的 M 值来分
析内参基因的表达稳定性，M 值越大则稳定性越
差，M 值越小则稳定性越高。结果如图 4 所示。
当以不同单株为试验材料时，各内参基因的表达
稳定性各异，ACT 和 18S rＲNA 的 M 值 ( 0. 67 )最
小，表明二者表达最为稳定，其次是 GAPDH 和
Helicase，表达最不稳定的是 SAMDC 和 EF1-α。当
以同 一 单 株 不 同 器 官 为 试 验 材 料 时，ACT 与
GAPDH 的 M 值(0. 89)最小，表示二者表达最为稳
定，其次是 18S rＲNA 和 Helicase，表达最不稳定的
是 SAMDC 和 EF1-α。
NormFinder 软件经运算后产生表达稳定值，表
达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。结果(表
2)显示，在不同单株、不同器官间 ACT 表达最为稳
定，为最优的内参基因，其次分别为 GAPDH 和 18S
rＲNA。其结果与 GeNorm 程序分析结果基本相符，
这在一定程度上验证了结果的可靠性。
961
林 业 科 学 50 卷
图 3 刺槐不同单株和器官中 6 个内参基因的 real-time PCＲ 溶解曲线( a)和扩增曲线(b)
Fig． 3 The real-time PCＲ amplification curve( b) and melting curves( a) of 6 reference genes in
different individuals and tissues of Ｒobinia pseudoacacia
A． 18S rＲNA; B． Helicase; C． SAMDC; D． GAPDH; E． ACT; F． EF1-α
071
第 9 期 王金星等: 刺槐实时定量 PCＲ 分析中内参基因的选择
图 4 用 GeNorm 软件分析不同植株和不同
器官中 6 种内参基因的表达稳定值
Fig． 4 Average expression stability value of six reference
genes in different plant and organs calculated by GeNorm
3 讨论
实时定量 PCＲ 技术实现了从定性到定量的飞
跃，已成为分子生物学中研究基因表达量的常用技
术之一，但是使用稳定的内参基因是定量结果可靠
的先决条件(Chang et al．，2012)。不同物种间内参
基因表达存在差异，在某种植物中表达稳定性高的
内参基因在另一种植物中不一定会有较好的表达稳
定性，因此根据具体的试验样品筛选适当的内参基
因对目的基因的表达进行校正是 ＲT-PCＲ 分析中至
关重要的一步。随着生物信息学和基因组学的发
展，已有很多物种的内参基因的稳定性得到了评价
与鉴定，大豆 ( Glycine max) ( Jian et al．，2008; Hu
et al．，2009)、水稻(Oryza sativa) ( Jain，2009)、小麦
(Triticum aestivum ) ( Long et al．，2010 )、拟 南芥
(Arabidopsis thaliana) (Ｒemans et al．，2008)等植物
都鉴定出了在各自不同发育阶段、不同试验条件下
表达最为稳定的内参基因。
表 2 NormFinder 程序分析不同植株和不同器官 6 种内参基因的表达稳定值
Tab． 2 Average expression stability value of six reference genes in different plants and organs calculated by NormFinder
试验组
Experimental
group
ACT GAPDH 18S rＲNA Helicase SAMDC EF1-α
最优内参基因
The optimal
reference genes
不同单株 Different plant 0. 447 0. 794 0. 883 1. 553 3. 537 1. 528 ACT
不同器官 Different organ 0. 603 1. 124 0. 724 1. 355 1. 345 1. 458 ACT
可用于评价内参基因稳定性的软件有多种，例
如 qBasePlus 软件(Hellemans et al．，2007)、ＲEST 软
件(Pfaffl et al．，2002)、BestKeeper 软件(Pfaffl et al．，
2004)等(赵文静等，2010)。GeNorm 程序是通过计
算内参基因的表达稳定性的 M 值来分析内参基因
的表达稳定性，M 值越大则稳定性越差，M 值越小
则稳定性越高，且 GeNorm 软件可以同时筛选一对
内参基因; NomFinder 软件的运行原理与 GeNorm
软件的原理类似，经运算后产生表达稳定值，然后根
据表达稳定值的大小排序，最后将表达稳定值最小
的基因作为最稳定的基因(Giulietti，2001; 魏永赞
等，2012)。
经 2 种软件计算得出，在不同植株、不同器官间
ACT，GAPDH，18S rＲNA 相对比较稳定，而 SAMDC，
EF1-α，Helicase 基 因 则 相 对 不 稳 定。 Iskandar
(2004)分析了甘蔗 ( Saccharum sinense)不同品种、
不同器官中 4 个常见的内参基因( ACT，25S rＲNA，
GAPDH，TUB)的表达稳定性，结果表明，GAPDH 在
不同器官中表达稳定性最好。Mascia 等 (2010) 分
析了 8 个内参基因 ( ACT，CYP，EF1-α，GAPDH，
TUB，UBI，18S rＲNA，UBQ ) 在 番茄 ( Lycopersicon
esculentum)不同病毒侵染下的表达稳定性，结果表
明 GAPDH 在所有样品中均能稳定表达，这与本试
验结果相似。而 ACT 基因作为一种最常用的内参
基因被广泛使用，且在本试验中经过 GeNorm 和
NormFinder 软件分析在不同单株和单株不同器官间
也显示出了较好的稳定性。在本试验中表达相对不
稳定 的 SAMDC 和 EF1-α 却 分 别 在 短 柄 草
(Brachypodium sylvaticum)逆境条件下和小麦不同
器官以及不同试验条件下表现出较高的表达稳定性
(袁伟等，2012)。说明这些基因在某些试验条件下
缺乏稳定性。另外关于 18S rＲNA 做内参基因使用
存在一些争议，因 18S rＲNA 末端没有 poly (A)尾
巴，当使用 oligo-dT 进行反转录或以 mＲNA 为模板
时 18S rＲNA 不能作为内参 ( Stürzenbaum et al．，
2001)，且 18S rＲNA 表达丰度过高，因此在 qPCＲ 数
据分析时基线值对其影响过大(Vandesompele et al．，
2002)。
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林 业 科 学 50 卷
综上所述，ACT，GAPDH，18S rＲNA 为相对稳定
的 3 个内参基因。为了消除单一内参基因所引起的
偏差，在一组特定的样本和试验条件下，很多试验结
果证实选择 2 个或 2 个以上的内参基因可以增加结
果的可靠性和准确度( Schmid et al．，2003)，但基于
试验成本、工作量等考虑，往往又需要较少的内参基
因。基于以上综合考虑，对刺槐不同品种、不同器官
间进行实时定量 PCＲ 时可以同时使用 ACT 和
GAPDH 基因作为内参对目的基因的表达进行校正。
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(责任编辑 徐 红)
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