全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140810
收稿日期: 2013 － 10 － 11; 修回日期: 2014 － 02 － 24。
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(31070603) ; 国家自然科学基金项目(31100497) ; 湖南省科技计划项目(2012NK3065)。
* 谭晓风为通讯作者。
基于 ＲNA-Seq的油茶种子 α －亚麻酸代谢
途径及相关基因分析*
江 南1，2 谭晓风1 张 琳1 曾艳玲1
(1．中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 410004;
2． 湖南工业大学 株洲 412008)
摘 要: 以油茶果实膨大期和油脂合成高峰期的种子为材料，进行转录组测序和表达谱数据库构建，并对油茶种
子 α －亚麻酸代谢途径相关基因进行分析。转录组测序获得油茶种子 α －亚麻酸代谢非冗余基因 Unigenes 序列共
112 条，与 α － 亚麻酸代谢密切相关的不饱和脂肪酸合成途径非冗余基因 Unigenes 序列 94 条，包含 12 种调控
α －亚麻酸代谢主要酶基因。表达谱数据分析显示，果实膨大期和油脂合成高峰期的 α － 亚麻酸合成代谢途径相
关基因具有不同的表达模式，参与油茶种子 α －亚麻酸的合成及形成多种不饱和脂肪酸的物质转化。采用实时荧
光定量 PCＲ 方法验证油茶种子 LOX，AOS，ACOX，AOC，OPＲ，AACT，PLA2，HPL，DOX，MFP，FAD2，FAD3 等关键基因
在油茶种子油脂合成不同时期的相对表达量，结果表明各基因表达规律与表达谱数据分析结果一致。克隆、调控
这些相关基因将会为提高 α －亚麻酸含量的油茶育种提供依据。
关键词: 油茶; 转录组; 表达谱; α －亚麻酸代谢; 基因表达
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0068 － 08
Gene Analysis of α-Linolenic Acid Metabolism of Camellia oleifera
Seeds Based on ＲNA-Seq
Jiang Nan1，2 Tan Xiaofeng1 Zhang Lin1 Zeng Yanling1
(1 ． Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Ministry of Education Key Laboratory of Non-Wood
Forest Products of State Forestry Administration Central South University of Forestry and Technology Changsha 410004;
2 ． Hunan University of Technology Zhuzhou 412008)
Abstract: In an effort to better understand the factors that regulate α-linolenic acid metabolism in Camellia oleifera
seeds，the transcriptome library and expression profile of C． oleifera seeds both in the fruit expanding period and at the
peak stage of lipid biosynthesis have been constructed and the functional genes related to α-linolenic acid metabolism have
been analyzed in detail． Study on transcriptome showed that there were one hundred and twelve non-redundant gene
unigenes related to α-linolenic acid metabolism and ninety-four unigenes related to biosynthesis of unsaturated fatty acids
of C． oleifera seeds，including twelve kinds of key enzyme genes regulating α-linolenic acid metabolism． The results of
expression profile analysis showed that these genes had different expression patterns． These genes regulate the synthesis of
α-linolenic acid and its conversion process to other unsaturated fatty acid at different developmental stage． The real-time
quantitative ＲT-PCＲ analysis revealed relative expression regularity of the key enzyme genes such as LOX，AOS，ACOX，
AOC，OPＲ，AACT，PLA2，HPL，DOX，MFP，FAD2，FAD3 in α-linolenic acid metabolism in fruit expanding period and
the oil synthesis peak stage，which agreed with the results of expression profile analysis． The findings would provide a
scientific basic for Camellia breeding of good quality with increasing content of α-linolenic acid．
Key words: Camellia oleifera; transcriptome; expression profile; α-linolenic acid metabolism; gene expression
油茶(Camellia oleifera)原产我国，是最重要的
木本食用油料树种，在南方 14 个省(市、自治区)均
有栽培分布(何方等，2002; 谭晓风等，2012)，栽培
面积接近 400 万 hm2。茶油是优质保健食用植物
第 8 期 江 南等: 基于 ＲNA-Seq 的油茶种子 α －亚麻酸代谢途径及相关基因分析
油，含有 90% 左右的不饱和脂肪酸 (吴小娟等，
2006)，其中以油酸(80% 以上)和亚油酸(约 8% )
居多，且不含有难以消化的芥酸和山嵛酸。α － 亚
麻酸(α-linolenic aicd，ALA，C18: △9，12，15)是只
能在植物体内合成的三价不饱和脂肪酸，是 ω － 3
多不饱和脂肪酸中唯一的人体必需脂肪酸(Simon et
al．，2009)。α －亚麻酸在人体内可转化为二十二碳
六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸
( eicosapentaenoic acid，EPA ) 和二十二碳五烯酸
( docosapentaenoic acid，DPA)等(Stark et al．，2008)，
是构成细胞膜和生物酶的基础物质，具有降血脂、降
血压、预防心脑血管疾病、抵抗炎症、增强智力等多
方面的作用(SanGiovanni et al．，2005)。近年来 α －
亚麻酸的研究越来越被重视，但与油酸、亚油酸等不
饱和脂肪酸相比，现有 α － 亚麻酸的研究主要集中
在人体 α －亚麻酸的生理功能研究及富含 α －亚麻
酸植物的开发利用等方面 (杨静等，2011; 李丽萍
等，2007; 徐爱遐等，2004)。Schilmiller 等(2007)
和 Truman 等(2007)在茉莉酸的生物合成及茉莉酸
调节拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)的生长发育和应
激反应研究中涉及 α －亚麻酸的合成及在植物体内
的变化过程; KEGG PATHWAY 数据库茉莉酸生物
合成数据模块中包含有 α －亚麻酸代谢通路。不饱
和脂肪酸的合成研究表明，植物中 α － 亚麻酸合成
是以磷脂酰胆碱为最初底物，经磷脂酶(PLA)和脂
肪酸脱饱和酶( FAD)作用形成亚麻酸 (王镜岩等，
2002)。这些研究为植物 α － 亚麻酸代谢途径基因
调控研究提供重要参考。本实验室在油茶种子转录
组研究中发现，油茶种子油脂合成过程存在 α － 亚
麻酸代谢途径。同时，对不同油茶品种所产油脂样
品分析发现，α －亚麻酸在茶油中的含量不高，仅为
0. 3% ～ 0. 4% (胡芳名等，2006)。若能通过分子设
计育种，调控油茶种子 α － 亚麻酸代谢途径，促进
α －亚麻酸合成代谢相关基因的超量表达，有可能
在一定范围内提高 α － 亚麻酸在茶油中的含量，对
于进一步提高茶油的食用和保健品质具有科学意义
和产业开发价值。本文在油茶种子转录组和表达谱
数据分析的基础上开展了油茶种子 α －亚麻酸代谢
途径及其相关基因分析，以期为相关基因的克隆与
鉴定，进而为提高 α － 亚麻酸含量的油茶分子育种
奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料采集
分别于 2009 年 6 月下旬(油茶果实膨大期)和
10 月中旬(油脂合成高峰期)从湖南省株洲市马家
河镇中南林业科技大学油茶种质资源圃采集国家审
定油茶品种‘华硕’的果实，果实采摘后立即剥取种
子放入液氮中保存，带回实验室将种子置 － 80 ℃超
低温冰箱中保存。
1. 2 油茶种仁总 ＲNA 提取及 ＲNA 浓度和质量
检测
分别取果实膨大期和油脂合成高峰期的‘华
硕’种仁放入不同的研钵中，加入液氮研磨至匀质
粉末状，分别装入预冷的 1. 5 mL 离心管中，用
Invitrogen 公司总 ＲNA 提取试剂盒分别提取不同时
期种仁样品的总 ＲNA。电泳检测提取 ＲNA 的完整
性，核酸 /蛋白定量分光光度计测定 ＲNA 浓度。
－ 80 ℃保存完整性好 ( 28S ∶ 18S 大致为 2 ∶ 1 )、
OD260 /280值在 1. 9 ～ 2. 2 之间、样品浓度≥200 ng·
μL － 1的 ＲNA 样品备用测序。
1. 3 油茶种子转录组数据库构建
将上述 2 个不同时期的 ＲNA 样品等比例混
合成总量为 1 mg 左右的混合样品，用干冰保存
送至深圳华大基因公司采用 Illumina 技术进行转
录组测序。组装软件 SOAP denovo 完成对转录组
数据组 装、拼 接和 去冗 余 处 理 后 获 得 非 冗 余
Unigene 序列，构建了油茶种子油脂合成调控过
程中的转录组数据库。将 Unigene 序列比对到
Nr，SwissProt，KEGG 和 COG 等数据库，完成油茶
种子油脂合成调控过程转录组数据库基因注释，
取 e-value ＜ 0. 000 01 的 Unigene 视为已知基因
(邵奉公，2011)。
1. 4 油茶种子表达谱数据库构建
将上述 2 个不同时期的 ＲNA 样品各 1 mg 左右
分别用干冰保存，送至深圳华大基因公司采用
Solexa 技术进行数字化表达谱测序。对 2 个表达谱
数据库进行整理和去杂后，根据已有的转录组数据
库进行基因注释。
1. 5 油茶种子转录组和表达谱数据库数据分析
从华大基因公司下载油茶种子转录组数据和表
达谱测序数据，按基因功能对转录组数据中 Pathway
显著富集的 Unigenes 进行分类，综合分析油茶种子
油脂形成过程中涉及的相关基因，关键基因参与调
控代谢途径中的关键节点，以及关键基因的功能、不
同时期的表达差异及与油脂形成的关系，在 Nr，
SwissProt，KEGG 和 COG 等数据库中注释信息不一
致的 Unigenes 序列，选取其中 200 bp 以上的序列在
GenBank 中重新进行 Blastx 同源性比对获取准确基
因信息。
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林 业 科 学 50 卷
1. 6 qPCＲ 验证油茶种子油脂合成关键基因在不
同时期的表达差异
对表达谱数据分析获得的油茶种子关键基因在
油茶种子不同时期的表达模式采用 qPCＲ 进行验
证。根据油茶种子转录组数据库中各基因已知序列
信息采用软件 Primer Primer5. 0 设计用于 qPCＲ 的
引物(表 1)，由北京六合华大基因公司合成，各引物
均进行 PCＲ 检测，并对扩增产物回收测序以验证引
物的特异性。按 QuantiFast SYBＲ Green PCＲ 试剂
盒 ( QIAGEN) 推荐方法在实时荧光定量 PCＲ 仪
(BIO-ＲAD)上完成 qPCＲ 过程，采用 Bio-Ｒad CFX
Manager 软件进行分析。
表 1 调控 α －亚麻酸代谢的关键酶基因 qPCＲ 所用的特异性引物
Tab． 1 Special primers for qPCＲ of genes regulating α-linolenic acid metabolism
基因名称
Gene name
正向引物
Forward primer(5’→3’)
反向引物
Ｒeverse primer(5’→3’)
PCＲ 产物大小
Length of PCＲ product / bp
GAPDH CTACTGGAGTTTTCACCGA TAAGACCCTCAACAATGCC 231
PLA2 CCTTCATTGCCCTCAACTTC CAGGCATCATGCTTCATACAAC 232
DOX GTTCGGCGACATCTTCACCAG GTGGGCATTGATTTGCTACTTC 385
LOX ACGTCATCAAAACATGCACCA CAGAGGTTGGGTATCCGCAGT 318
HPL CGATGAGCATATCACCAGGCA CAGCGCCACTACGTTAGCGTT 272
AOS GTTCCAAACCAGCTTCACAGT GAGACGGAAGGTGTGGATCA 265
ACOX2 CCGATGCTTCCTGTGCTCTAT CGGCACTCTTCAATACCATCA 319
AOC CGTATCTCGCTGTGACTGGTG GAAATAGTGGACCCAGCCTC 217
OPＲ GGAGGTGGTGGAACATTATCG GCCTTGAGCCTAAGACAACCTG 338
AACT GCTCTTGCCAATCAAAGGTTAC GGCACCTTCACATTTGACGTG 227
MFP GAGGTCGGAATAGATGGCGTT CCTTCTATGGCAGCAACCG 296
FAD2 CCCAGCAACCAAACATGAAC GAATGAGCGGAGGAGAGAAC 130
FAD3 TGTGGCTGGACTTGGTGACTT CCAGATTTCTTAGGCTCACGA 265
2 结果与分析
2. 1 油茶种子油脂合成调控过程转录组基本信息
油茶果实膨大期和油脂合成高峰期 ＲNA 等比
例混合样品进行 Illumina 双末端测序 ( paired-end
sequencing，PE)后，共获得了 13 333 334 个 reads 片
段，包含 1 200 000 060 nt，其中片段长度大于 20 个
碱基的百分比为 96. 05%，N 值为 0，GC% 值为
46. 75%，说明此次转录组测序结果较好，为后续的
数据组装提供了很好的原始数据。用组装软件
SOAP denovo 对转录组数据组装、拼接和去冗余处
理后最终获得了 69 798 个非冗余 Unigene 片段，序
列信息达到 24 154 817 nt，片段大小从 159 ～ 3 859
nt 不等，各 Unigene 片段长度、数量及其在转录组中
所占比例见表 2。对 Unigene 进行覆盖度分析发现
69 798 条 Unigene 都能够与测序的原始数据 reads
相对应，同时将 Unigene 数据库与 Scaffold 数据库进
行比对后，也得到了 Unigene 序列与 Scaffold 序列的
很好的对应关系，说明 Unigene 序列确实由 Scaffold
序列进行拼接获得的去冗余序列。对油茶种子转录
组 Unigene 序列进行蛋白功能注释、Pathway 注释、
COG 功能注释和 Gene Ontology(GO)功能注释，共
有 18 714 条 Unigene 获得基因注释，归并为 124 个
代谢途径，其中涉及 α －亚麻酸合成代谢的 Unigene
序列共 112 条，与 α － 亚麻酸代谢密切相关的不饱
和脂肪酸合成途径 Unigene 序列 94 条，分别占全部
注释基因的 0. 6%和 0. 5%。
表 2 油茶种子发育过程转录组的 Unigene 组装质量统计
Tab． 2 Statistics of data assembly for unigene in
digital transcriptome of Camellia oleifera developing seeds
长度范围
Length range / nt 数量
Counts 百分比
Percent(% )
100 ～ 500 58 651 84. 03
500 ～ 1 000 8 833 12. 66
1 000 ～ 1 500 1 746 2. 50
1 500 ～ 2 000 422 0. 60
≥2 000 146 0. 21
合计 Total 69 798 100
2. 2 油茶种子膨大期和油脂合成高峰期表达谱数
据信息
分别对油茶果实膨大期和油脂合成高峰期
ＲNA 进行 Solexa 单端测序 ( single-end sequencing，
SE)，获得油茶种子 2 个不同时期的表达谱数据库，
对数据库进行整理和去杂后，得到油茶果实膨大期
高质量测序标签( clean tags) 117 123 条，油脂合成
高峰期 clean tags 106 069 条; 大部分数据能够通过
前期构建的转录组数据库得到注释。为了进一步分
析 2 个时期基因表达差异，将基因的表达量标准化，
取标准化基因表达量 TPM ( transcript per million
clean tags)值直接用于比较不同样品间的基因表达
差异(聂志扬等，2009)，并对差异检验的 P 值进行
07
第 8 期 江 南等: 基于 ＲNA-Seq 的油茶种子 α －亚麻酸代谢途径及相关基因分析
多重假设检验校正，通过控制 FDＲ ( false discovery
rate)≤0. 001 来最终决定 P 值的域值。本研究中，
以 FDＲ≤0. 001 且存在 2 倍以上表达差异作为判断
基因表达差异显著的阈值。将果实膨大期的表达谱
数据库与高峰期的数据库进行比较，发现种类相同
且表达上存在差异的基因共有 2 716 条，其中 α －
亚麻酸代谢差异表达基因 12 条，占全部差异表达基
因的 1. 25%。
2. 3 油茶种子 α －亚麻酸代谢途径及其相关基因
综合分析油茶种子转录组数据中 α －亚麻酸代
谢途径的 112 条 Unigenes 序列和不饱和脂肪酸合成
途径 94 条 Unigenes 序列的基因注释信息，可确定调
控 α －亚麻酸代谢过程的主要酶基因有 12 种，分别
为磷脂酶 A2 基因(PLA2)、脂肪氧合酶基因( LOX)、
α －双加氧酶基因(DOX)、12 － 氧代植物二烯酸还
原酶基 因 ( OPＲ )、丙 二 烯 氧 化 物 环 化 酶 基 因
(AOC)、脂肪酸 β － 氧化作用多功能蛋白基因
(MFPA)、乙酰 － CoA 酰基转移酶基因 ( AACT)、脂
酰 － CoA －氧化酶基因(ACOX)、氢过氧化物裂解酶
基因(HPL)、丙二烯氧化物合酶基因 ( AOS)、△ －
(12) －脂肪酸脱饱和酶基因(FAD2)、△ － (15) －
脂肪酸脱饱和酶基因(FAD3)，它们编码参与油茶种
子 α － 亚麻酸代谢过程的 12 种关键酶。转录组
α －亚麻酸代谢 Pathway 分析显示 12 种酶功能基因
分别参与调节 α －亚麻酸代谢过程中关键节点的生
化反应，是调控 α － 亚麻酸代谢途径的关键酶功能
基因。
为进一步确认 12 种 α － 亚麻酸代谢关键酶基
因注释的可靠性，将 12 种基因中 200 bp 以上的
Unigene 编码序列在 GenBank 中重新进行 Blastx 同
源性比对。各基因 Unigene 序列与其他植物相关已
知基因序列的比对信息显示，编码 12 种关键酶的
Unigenes 基因序列分别与油橄榄 ( Olea europaea)、
茶 树 ( Camellia sinensis )、欧 洲 榛 子 ( Corylus
avellana )、大 豆 ( Glycine max )、花 生 ( Arachis
hypogaea)、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)、陆地棉
(Gossypium hirsutum)、烟草(Nicotiana tabacum)等植
物相关基因序列比对的基因注释达到较高的期望
值，相似性达 85% ～ 95% 不等。Blastx 同源性比对
结果可以确认这 12 种酶基因注释的准确性和可
靠性。
2. 4 不同时期油茶种子 α － 亚麻酸代谢关键酶功
能基因的表达
分析油茶种子果实膨大期和油脂合成高峰期的
表达谱数据，发现油茶种子 α －亚麻酸代谢中 12 种
关键酶功能基因在油茶种子不同发育时期的表达存
在差异，各基因不同时期表达分析详见表 3。本研
究中，以 TPM 1 ～ 5 为低丰度表达，TPM 5 ～ 10 为中
丰度表达，TPM ＞ 10 为高丰度表达。
表 3 数据显示，在油茶种子发育过程中 α － 亚
麻酸代谢的 12 种关键酶基因存在 4 种表达模式。
脂肪氧合酶基因 ( LOX)、丙二烯氧化物合酶基因
(AOS)和脂酰 － CoA － 氧化酶基因 ( ACOX)膨大期
没有表达，油脂合成高峰期有表达; 丙二烯氧化物
环化酶基因(AOC)、12 － 氧代植物二烯酸还原酶基
因(OPＲ)、乙酰 － CoA 脂肪酰转移酶基因(AACT)在
油茶种子成熟过程不同时期都有表达但表达量差异
不大，3 种基因在不同时期均表达丰度较低; 磷脂
酶 A2 基因(PLA2)、氢过氧化物裂解酶基因(HPL)、
△ － 12 脂肪酸脱饱和酶基因(FAD2)和△ － 15 脂肪
酸脱饱和酶基因(FAD3)在油茶油脂形成过程的果
实膨大期和油脂合成高峰期都有表达，且油脂合成
高峰期表达相对于膨大期表达为上调; 而 α －双加
氧酶 (DOX)基因和脂肪酸 β － 氧化作用多功能蛋
白基因(MFP)在油茶油脂形成过程的果实膨大期
和油脂合成高峰期也都有表达，但油脂合成高峰期
表达为下调，如 MFP 在油脂合成高峰期相对于果实
膨大期基因表达下调近 4 倍。
2. 5 qPCＲ 对不同时期油茶种子 α － 亚麻酸代谢
关键酶功能基因表达差异验证
对 α －亚麻酸代谢 12 个关键酶基因采用 qPCＲ
验证其在油茶果实膨大期和油茶种子油脂合成高峰
期的表达情况。利用 Primer Premier 5. 0 设计的 α －
亚麻酸代谢关键酶功能基因的 qPCＲ 引物退火温度
为 57 ℃，PCＲ 产物 130 ～ 385 bp，经琼脂糖凝胶电泳
检测和测序，确认各基因引物能有效单一条带扩增，
表明设计的引物具有特异性，可用于荧光定量 PCＲ
分析。
以表 达 稳 定 的 油 茶 GAPDH 基 因 ( rzots0 _
001325． y1． scf)为内参对照基因(谭晓风等，2008)
扩增目的基因，采用 Bio-Ｒad CFX Manager 软件，拟
定相对表达丰度最高值为 1. 0，计算 α －亚麻酸代谢
各关键酶基因在油茶果实膨大期和油茶种子油脂合
成高峰期的相对表达量并作柱状图(图 1)。由图 1
可知: PLA2，HPL，FAD2 和 FAD3 基因表达规律一
致，在油茶种子果实膨大期都有一定表达量，PLA2，
HPL，FAD2 油脂合成高峰期相对于膨大期表达上调
幅度较大，FAD3 果实膨大期表达量低，油脂合成高
峰期表达上调幅度不如 FAD2; AOC，OPＲ，AACT 等
基因在油茶种子果实膨大期和油脂合成高峰期表达
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量较低且差异不大; LOX，AOS 和 ACOX 在果实膨大
期表达量极低，在油脂合成高峰期有一定量表达;
DOX，MFP 果实膨大期表达量较大但在油脂合成高
峰期基因表达骤然下降。试验结果显示，α － 亚麻
酸代谢关键酶基因在油茶果实膨大期和油茶种子油
脂合成高峰期的表达模式与油茶种子不同时期表达
谱数据分析结果一致。
表 3 油茶种子 α －亚麻酸代谢关键酶基因不同时期表达差异分析①
Tab． 3 Analysis of expression difference of α-linolenic acid metabolism key enzyme genes in
Camellia oleifera seeds at different stages
关键酶基因
Key enzyme gene
果实膨大期
标准化表达量
TPM in fruit
expanding
period(A)
油脂合成高峰期
标准化表达量
TPM at peak stage
of lipid
biosynthesis (B)
log2 (差异
表达倍数)
log2
ratio(B /A)
差异检验的 P 值
P-value
FＲD 值
FＲD value
脂肪氧合酶基因
Lipoxygenase gene( LOX)
0. 01 4. 7 8. 876 517 1. 82E － 05 0. 000 146
丙二烯氧化物合酶基因
Allene oxide synthase gene(AOS)
0. 01 3. 82 8. 577 429 0. 000 141 0. 000 915
脂酰 － CoA －氧化酶基因
Acyl-CoA oxidase gene(ACOX)
0. 01 5. 29 9. 047 124 4. 65E － 06 4. 27E － 05
丙二烯氧化物环化酶基因
Allene oxide cyclase gene(AOC)
0. 9 0. 59 － 0. 609 210 0. 667 852 0. 760 405
12 －氧代植物二烯酸还原酶基因
12-oxophytodienoate reductase gene(OPＲ)
0. 6 0. 59 － 0. 024 248 0. 980 210 0. 996 999
乙酰 － CoA 酰基转移酶基因
Acetyl-CoA acyltransferase gene(AACT)
0. 6 0. 88 0. 552 541 0. 707 394 0. 784 662
磷脂酶 A2 基因
Phospholipase A2 gene (PLA2)
11. 1 25. 26 1. 186 295 1. 41E － 05 0. 000 117
氢过氧化物裂解酶基因
Hydroperoxide lyase gene(HPL)
122. 37 302. 22 1. 304 349 6. 14E － 13 1. 51E － 11
α －双加氧酶基因
Alpha-dioxygenase gene (DOX)
9. 6 2. 06 － 2. 220 390 3. 20E － 05 0. 000 241
脂肪酸 β －氧化作用多功能蛋白基因
Fatty acid beta-oxidation multifunctional
protein gene(MFP)
35. 99 2. 94 － 3. 613 708 7. 13E － 26 5. 22E － 24
ω － 6 脂肪酸脱饱和酶基因
Omega-6 fatty acid ( delta-12 ) desaturase
(FAD2)
7. 2 72. 54 3. 332 708 1. 92E － 10 3. 49E － 09
ω － 3 脂肪酸脱饱和酶基因
Omega-3 fatty acid ( delta-15 ) desaturase
(FAD3)
0. 6 1. 17 0. 963 474 0. 470 638 0. 577 666
①FＲD: 错误发现率 False discovery rate; TMP: 每 100 万 clean tag 中包含该种转录本的拷贝数 Transcript per million clean tags．
2. 6 油茶种子 α －亚麻酸代谢的基因调控过程
油茶种子转录组数据分析显示 Pathway 显著性
富集分析可以确定 α － 亚麻酸代谢过程中 FAD2，
FAD3，LOX，AOS，ACOX，AOC，OPＲ，AACT，PLA2，
HPL，DOX，MFP2 具差异表达的 12 种关键酶功能基
因调控 α －亚麻酸代谢过程的关键节点的反应，结
合油茶种子调控 α －亚麻酸代谢的关键酶基因不同
时期基因表达差异分析，绘制油茶种子 α － 亚麻酸
代谢过程关键酶功能基因调控途径(图 2)。从图 2
中可以看出，油茶种子 α － 亚麻酸代谢存在 α － 亚
麻酸的合成和形成多种不饱和脂肪酸的物质转化的
过程。PLA2，FAD2，FAD3 是调控 α －亚麻酸合成过
程的关键基因，各基因分别调控油茶种子 α － 亚麻
酸合成途径中 1 个节点的反应。DOX，LOX 及 FAD
是平行调控 α －亚麻酸转化为其他不饱和脂肪酸物
质的第 1 步反应中的关键基因，在油茶 α － 亚麻酸
代谢途径中 DOX 基因调节 1 个代谢节点的生化反
应，LOX 参与调控 2 个代谢节点的生化反应，调控
α － 亚麻酸生成脂肪酸氢过氧化物过程。HPL 和
AOS 基因在油茶 α －亚麻酸代谢过程分别调节 2 个
代谢节点的代谢流量，调控脂肪酸氢过氧化物转化
形成多种不饱和脂肪酸。AOC 和 OPＲ 各调控 1 个
α － 亚麻酸代谢节点的生化反应，ACOX，MFP 和
AACT 各调控 3 个代谢节点的反应，图 2 显示这 5 个
基因共同参与调控油茶种子发育过程中 α －亚麻酸
形成茉莉酸类物质。
27
第 8 期 江 南等: 基于 ＲNA-Seq 的油茶种子 α －亚麻酸代谢途径及相关基因分析
图 1 实时荧光定量 PCＲ 检测不同时期
关键酶基因相对表达量
Fig． 1 The relative expression abundance of key enzyme
genes in different developmental period by qPCＲ
3 结论与讨论
油茶种子发育过程中能合成大量不饱和脂肪
酸，其中 α －亚麻酸是 ω － 3 不饱和脂肪酸中人体必
需的不饱和脂肪酸。为开发油茶的优质基因资源，
培育提高 α －亚麻酸含量的油茶新品种，本研究以
油茶果实膨大期和油脂合成高峰期种子为材料构建
了油茶种子转录组数据库和不同时期表达谱数据
库，并在转录组和表达谱数据分析的基础上对油茶
种子 α －亚麻酸代谢途径及其相关基因在种子不同
时期的表达进行了分析，同时对各关键酶基因参与
调控 α －亚麻酸代谢过程关键节点的生化反应进行
了分析研究。
转录组基因注释过程中 KEGG 是有关 Pathway
主要公共数据库 ( Kanehisa et al．，2008 )，通过
Pathway 显著性富集可以确定差异表达基因参与的
最主要的生化代谢途径以及信号转导途径(聂志扬
等，2009)。油茶种子转录组研究发现基因注释中
Pathway 显著性富集可以确定 α －亚麻酸代谢 12 种
关键酶功能基因，各基因在 α － 亚麻酸代谢过程中
分别调控不同节点的反应进程(图 2)。12 种关键
酶功能基因中 PLA2，FAD2，FAD3 等基因是调控油
茶种子 α －亚麻酸合成的关键酶基因，其他基因调
控 α －亚麻酸进行物质转化形成多种不饱和脂肪酸
的关键步骤。王镜岩等(2002)研究表明植物中的
脂肪酸脱饱和酶 (FAD)不能直接作用于游离脂肪
酸，但可直接对磷脂类的脂肪酸链去饱和。PLA2 可
调控磷脂酰胆碱形成 1 － 酰基甘油磷酸胆碱
(1-Acylglycerophosphocholine)，FAD2 调控磷脂酰胆
碱分子中 sn2 位上油酸链 12 和 13 碳原子之间形成
双键生成亚油酸，亚油酸受 FAD3 调控在 15 和 16
碳原子之间进一步形成双键生成 α － 亚麻酸(王镜
岩等，2002)，实现油茶种子成熟过程中 α －亚麻酸
的积累。所以磷脂酰胆碱是 α －亚麻酸合成的最初
底物，FAD2 调控着油茶油脂中油酸和亚油酸的比
例，FAD3 调控油茶种子 α －亚麻酸含量。油茶种子
不同时期表达谱数据分析显示 PLA2，FAD2 在油茶
果实膨大期有高丰度表达到油脂合成高峰期表达上
调幅度很大，说明油茶种子发育过程中始终有油酸
和亚油酸的积累，而 FAD3 在油茶果实膨大期表达
量较低，到油脂合成高峰期表达虽有上调但上调倍
数不到 2(表 3)，这可能是油茶种子 α －亚麻酸含量
不高的主要原因。目前 FAD2 和 FAD3 基因已经分
别在油茶、拟南芥、花生、麻疯树 ( Jatropha curcas)、
大豆、油菜(Brassica napus)等植物中发现并克隆出
来(谭晓风等，2008; 谢金喜等，2007; 张皙等，
2007; 石东乔等，1999; 付瑜华等，2012; 李晓丹，
2007)。α － 亚麻酸在茶油成分中含量不高也与
α －亚麻酸合成后进行物质转化形成多种不饱和脂
肪酸有关。DOX 和 LOX 是调控 α － 亚麻酸向其他
不饱和酸物质转化的关键酶基因，DOX 在拟南芥和
烟草中研究较多，现已分别克隆得到基因序列 (马
龙等，2007)，可调控 α －亚麻酸进行 α －氧化形成
2(Ｒ) －氢过氧化物 － 十八碳三烯酸［(2Ｒ)-(9Z，
12Z， 15Z )-2-hydroxyoct-adecatri-9， 12， 15-enoic
acid］，继而进一步形成 2(Ｒ) － 羟基 － 十八碳三烯
酸［(2Ｒ)-(9Z，12Z，15Z)-2-hydroxyoctadecatri-9，12，
15-enoic acid］或十七碳三烯酸等不饱和脂肪酸(马
龙等，2007)，图 2 清楚显示了这一过程。表达谱数
据分析 DOX 基因在油茶果实膨大期中丰度表达且
油脂合成高峰期表达下调，并未随 α － 亚麻酸的积
累表达加强，这有利于油脂合成高峰期 α － 亚麻酸
的积累。LOX 广泛存在于需氧生物中(Hartmut et
al．，2002)，调控α －亚麻酸氧化生成脂肪酸氢过氧
化物(Alexander，1998)，LOX 表达贯穿于植物生活
史的整个过程( Porta et al．，2002)。图 2 显示 LOX
作用形成的脂肪酸氢过氧化物一方面经 AOS 调控
进一步氧化形成环氧 －十八碳三烯酸等多种不饱和
脂肪酸，这些氧化物的形成不利于油茶优良品质形
成，另一方面经 HPL 调控分解形成断链的醛(C6 －
或者 C9 － ) 和相应的 C12 － 或者 C9 － 脂肪酸，
Feussner 等(2002 )的研究证明了这一反应过程。
HPL 在油茶种子发育过程各个时期表达量都较大，
37
林 业 科 学 50 卷
图 2 油茶种子 α －亚麻酸代谢调控途径
Fig． 2 The α-linolenic acid metabolism regulational pathway in Camellia oleifera seeds
这一方面与 α －亚麻酸在油脂合成高峰期增加累积
代谢加强有关，另一方面也说明脂肪酸氢过氧化物
通过其他代谢途径在各个时期均有积累。ACOX 和
MFP 在 α －亚麻酸代谢过程中参与调控 12 － 氧代
植物二烯酸 (12-OPDA)形成茉莉酸和茉莉酸甲酯
过程中的三轮 β － 氧化。有研究资料表明，LOX，
AOS，ACOX 和 MPF 是植物体内茉莉酸类物质
( jasmonates，JAs)合成途径的关键酶，JAs 的合成是
以亚麻酸为最初底物开始的一连串酶反应(蒋科技
等，2010)。LOX，AOS 和 ACOX 等基因在油茶果实
膨大期表达量极低甚至无表达而在油脂合成高峰期
有表达，这种前后表达差异表明油茶种子发育初期
α －亚麻酸合成量很少或者没有合成，3 种基因的表
达与 α －亚麻酸随种子成熟不断积累呈正相关。现
有研究表明 ACO，OPＲ 和 AACT 3 种基因参与调控
的反应均为 JAs 合成过程的后期反应 (蒋科技等，
2010)，在油茶果实膨大期和油脂合成高峰期都有
表达，但表达量及表达差异都不大，很明显 3 个基因
的表达都不利于油茶油脂 α －亚麻酸的积累。综合
以上分析，油茶种子发育过程中 α －亚麻酸的合成，
主要受 PLA2，FAD2 及 FAD3 的调控。LOX 是调控 α
－亚麻酸转化为其他物质的第 1 步反应中的关键酶
47
第 8 期 江 南等: 基于 ＲNA-Seq 的油茶种子 α －亚麻酸代谢途径及相关基因分析
基因，在油茶种子成熟期表达高丰度，不利于茶油 α
－亚麻酸的积累和茶油优良品质的形成。鉴于
PLA2，FAD2，FAD3 及 LOX 等基因在油茶种子不同
时期的表达模式及其对 α －亚麻酸代谢过程的调控
功能，通过促进 FAD3 在油茶种子成熟过程中超量
表达和在某时期适当抑制 LOX 的表达有利于提高
茶油中 α －亚麻酸含量。目前本实验室已着手进行
油茶种子 α －亚麻酸代谢过程中关键基因的克隆和
功能分析，已克隆 LOX，FAD2，AACT (张党权等，
2008; 张琳等，2011; 胡姣等，2010; 谭晓风等，
2008)等基因并获得基因全长。这些研究将为分子
育种培育高 α －亚麻酸含量的优质油茶新品种提供
理论基础和科学依据。
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