全 文 ：团花树(Anthocephaluschinensis)又名黄梁木,是茜草科
(Rubiaceae)团花属(Anthocephalus)植物,常绿大乔木,生长
非常迅速,有“奇迹树”之称。团花树不仅速生,而且材质良
好,适用于制作包装箱,建筑上的门窗、檀条、天花板、室内
装修等,还是人造纤维、纤维板、胶合板和浆粕等工业的理
想原料[1]。
由于团花树具有坚硬的细胞壁,细胞内有较大的液泡,
富含多糖、多酚类化合物和一些次生代谢产物,并且 RNase
含量丰富,RNA易被分化降解,给其提取分离带来了许多
困难[2]。以往植物RNA提取多见于草本植物,但关于木本植
物 RNA的提取报道较少,而团花树韧皮部总 RNA的提取
尚未见报道。为此,笔者通过比较几种较常用 RNA提取方
法,并利用所得 RNA进行 RT!PCR分析,旨在为将来从基
因水平上研究团花树快速生长机理以及开展团花树木质部
分化和生长过程中相关基因的调控研究提供理论支持,也
为将来进行转基因研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 团花树韧皮部取自于广州华南农业大学校园
内。取样过程中戴一次性手套,截取团花树枝干,于低温下
快速剥下外部树皮,用洁净的小刀迅速刮取枝干的韧皮部
于袋内封存,并迅速放到液氮罐中。材料保存于-80℃冰箱
中待用。
ReverseTranscriptaseXL(AMV),RibonucleaseInhibitor,
TaqTM,DNaseⅠ,均购自于 TAKARA公司;Oligo(dT)15和
RNAplantReagent植物总RNA提取试剂购于天根生物技术
有限公司;特异引物由上海生工生物技术有限公司合成;其
他药品、试剂购于鼎国生物技术有限公司。
玻璃器皿及试剂(含 Tris的除外)用 0.1%焦碳酸二乙
酯(DEPC)水溶液在37℃下处理12h,然后在120℃下高温
灭菌30min,彻底分解残留的DEPC,耗材使用AXYGEN公
司的产品。
1.2 RNA提取方法
1.2.1 冷酚法。取韧皮部组织约 0.5g在液氮中迅速研磨,
转入 3ml提取缓冲液中[1mol/LTris!HCl,50mmol/LEDTA
(pH值 9.0),1.4%SDS],混匀;再加入等体积的酚∶氯仿∶异
戊醇(25∶24∶1),混匀置于冰上1h,每10min混匀1次;4℃、
12000r/min离心 10min;取上清液,加入等体积的酚∶氯仿∶
异戊醇(25∶24∶1),混匀置于冰上5min;重复以上操作 2次;
取上清液,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),混匀置于冰
上 5min;4℃、12000r/min离心 10min;取上清液,加入 1/2
体积的高盐液(0.8mol/L柠檬酸钠,1.2mol/LNaCl)和 1/2
体积的异丙醇,混匀后于-70℃放置至少 30min;4℃、
12000r/min离心10min,弃上清液后溶于无RNase的水中,
除去不溶物;加入1/3体积的 8mol/L的 LiCl,-20℃放置过
夜,沉淀RNA;4℃、12000r/min离心10min,用1ml75%乙
醇洗涤RNA2次;4℃、7500r/min低温离心5min,弃去酒
精,晾干后用适量DEPC水溶解[3]。
1.2.2 1步提取法。在离心管中加入 2.5ml提取缓冲液[10
mmol/LEDTA,0.14mol/LNaCl,0.2mol/L硼酸 !Tris(pH值
团花树韧皮部总RNA提取方法的比较研究
李娜 1,张东方 1,骈瑞琪 1,李 伟 1,陈晓阳 2*
(1.北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京 100083;2.华南农业大学林学院,广东广州 510642)
摘要 [目的]为了从团花树韧皮部中获取高质量的总RNA。[方法]研究采用冷酚法、一步提取法、改进CTAB法、杨树提取法、
RNAplantReagent法5种方法从团花树韧皮部组织中提取总RNA,并利用电泳拍照、测OD值和RT!PCR3种方法对提取的RNA的
质量进行检测。[结果]由冷酚法、一步提取法、改进CTAB法3种方法提取的RNA纯度较低,存在降解和弥散现象,或有DNA和蛋白
质的污染,得到的RNA的量较少;而用杨树提取法和RNAplantReagent法提取的RNA很少有降解,28SrRNA和18SrRNA条带很清
晰,得到的RNA虽然有DNA的污染,但是经过DNaseⅠ处理后,OD260/OD280的值在1.8~2.0。[结论]杨树提取法和RNAplantReagent法
得到的RNA可以满足RT!PCR反应和RACE试验的要求,为成功克隆团花树相关基因奠定了基础。
关键词 团花树;RNA提取;XET基因
中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)11-04415-04
ComparativeStudyonMethodsofRNAIsolationfromPhloemofAnthocephaluschinensis
LINaetal(KeyLaboratoryforGeneticsandBreedingofForestTreesandOrnamentalPlants,MininstryofEducation,BeijingForestry
University,Beijing100083)
Abstract [Objective]TheresearchaimedtoisolatehighqualityRNAfromthephloemofAnthocephaluschinensis.[Method]Severalmethods
suchascoldphenolmethod,one!stepextractionmethod,improvementCTABmethod,poplarextractionmethodandRNAplantReagentmethod
wereused.ThequalityoftotalRNAwasanalyzedthroughgelelectrophoresis,UVspectrometer,andRT!PCR.[Result]Theresultindicatedthat
thepurityofRNAisolatedfromthe3methodsofcoldphenolmethod,one!stepextractionmethodandimprovementCTABmethodwerelow,the
RNAweredegraded,dispersedinsomedegrees,orwerepolutedbyDNAandprotein,andlessRNAwereobtained.ButtheRNAobtainedfrom
thepoplarextractionmethodandRNAplantReagentmethodwererarelydegenerated,andshowedclearbandsof28SrRNAand18SrRNA.
AlthoughtheRNAwerepolutedbyDNA,afterdealingwiththeDNaseI,thevalueofOD260/OD280reachedbetween1.8~2.0.[Conclusion]The
RNAextractedfromthepoplarextractionmethodandRNAplantReagentmethodcouldmeettherequestofRT!PCRreactionandRACE
experiment,layingthefoundationforthesuccessfulcloninggenesofAnthocephaluschinensis.
Keywords Anthocephaluschinensis;RNAextraction;XETgene
基金项目 北京林业大学研究生自选课题基金(06j058);科学技术研
究重点项目——高效集碳林木定向培育与能源化关键问题
的基础研究(104243)。
作者简介 李娜(1982-),女,河北邢台人,硕士研究生,研究方向:植物
生物技术。*通讯作者,教授,博士生导师。
收稿日期 2008!01!24
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(11):4415-4418 责任编辑 姜 丽 责任校对 卢 瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.11.104
7.6)],取1g韧皮部组织,液氮中研磨成粉末,迅速转入离心
管中混匀,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)反复抽
提2~3次;上清液中加入异丙醇,混匀,冰浴5~10min,4℃、
12000r/min离心 10min,弃去上清液;用 75%的乙醇洗涤
两次,自然风干,用 300μlDEPC水溶解,转入 1.5ml离心
管中,加入 1/25体积的 NaAc,使 Na+浓度为 80mmol/L,混
匀,加入总体积 0.4倍的 2BE,冰浴 30min;4℃、12000
r/min离心10min,取上清液,加入2BE至原体积的1倍,混
匀,冰浴30min;4℃、12000r/min离心10min,75%的乙醇
洗涤沉淀2次,适量DEPC水溶解[4]。
1.2.3 改进CTAB法。在65℃水浴锅中温浴 15ml提取液
[2%CTAB,2%PVP,100mmol/LTrisHCl(pH值 8.0),25
mmol/LEDTA,2mol/LNaCl,0.05%亚精胺,2%β巯基乙醇];
液氮中研磨 0.5g韧皮部组织至粉末,立即转移到预热的
提取液中并混匀;65℃温浴 10min,每隔 2min振荡1次。
加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)并振荡混匀;4℃、12000
r/min离心 10min,将上清液转移到另一离心管中,如上再
抽提 1次;小心转移上清液至另一离心管中,4℃、12000
r/min离心 15min,弃去不溶物;加入 1/4体积 10mol/L
LiCl到上清液中,充分混合,4℃过夜;4℃、12000r/min离心
15min,回收RNA;弃去上清液,75%的乙醇洗涤沉淀2~3
次,适量DEPC水溶解[5-6]。
1.2.4 杨树提取法。加入液氮预冷研钵,取0.1g韧皮部组织
迅速用液氮充分研磨粉碎;加入700μl裂解缓冲液(4mol/L
异硫氢酸胍,1mol/L醋酸钾,0.05mol/L硼砂,1%十二烷基肌
酸钠,2%β巯基乙醇,10mmol/LEDTA),然后加入 500μl
抽提缓冲液A(苯酚∶氯仿∶异戊醇以25∶24∶1比例混合,加入
2%CTAB),振荡器上剧烈振荡5~10s至充分混匀,冰浴15
min,4℃、12000r/min离心10min;取上清液加入500μl抽
提缓冲液B(氯仿∶异戊醇以49∶1比例混合,加入2%CTAB),
振荡器上剧烈振荡 5~10s,至充分混匀,冰浴 15min,4℃、
12000r/min离心 10min;取上清液(大约 500μl),加入 1/4
体积(125μl)10mol/LLiCl,-80℃沉淀 20min,4℃、10000
r/min离心10min,弃去上清液;用1ml70%乙醇洗沉淀,4℃、
13000r/min离心 5min,弃去上清液;重复上述操作 1次;
挥发乙醇2~4min;50μlDEPC水溶解沉淀[7]。
1.2.5 RNAplantReagent法。取 0.1g冷冻的研磨过的韧皮
部组织,加入 0.5ml提取试剂,振荡至彻底混匀。室温平放
5min;4℃、12000r/min离心 1min,上清液转入新的无
RNase离心管;加入0.1ml5mol/LNaCl,温和混匀;加入0.3
ml氯仿,上下颠倒混匀;4℃、12000r/min离心 10min,取
上层水相转入新的无RNase离心管;重复以上步骤 1次;
加入与所得水相等体积的异丙醇,混匀,室温放置 10min;
4℃、12000r/min离心 10min,弃去上清液,注意不要倒出
沉淀;加入 1ml75%乙醇,4℃、5000r/min离心 3min;倒
出液体,剩余的少量液体短暂离心,用枪头吸出,室温晾干
2~3min;加入50μlDEPC水溶液,反复吹打、混匀,充分溶解
RNA。
1.3 RNA的纯化 根据DNaseⅠ说明书的反应体系,采用
改良的 RNA抽提方法,具体步骤为:37℃反应 20~30min。
加入 50μl的 DEPC水溶液,100μl氯仿,充分混匀;4℃、
12000r/min离心 10min;取上清液,用 2倍体积无水乙醇
沉淀,-20℃过夜;4℃、12000r/min离心 10min;弃去上清
液,75%乙醇洗涤1次;4℃、12000r/min离心5min;20~30μl
DEPC水溶解。
1.4 电泳分析 取5μlRNA,点样于1%琼脂糖凝胶上,120V
恒压电泳 15min,EB染色 5min,在紫外灯下观测RNA条
带,并照相记录。
1.5 RNA质量与浓度的检测 取 5μlRNA,加入 495μl
DEPC水溶液,测定230、260和280nm波长下的OD值。RNA
含量用公式 OD260×40计算,OD260/OD230、OD260/OD280用于纯
度分析。
1.6 RNA逆转录检测
1.6.1 cDNA第一链的合成。参照 ReverseTranscriptaseXL
(AMV)使用说明书,以 5种方法提出的 RNA为模板,用
ReverseTranscriptaseXL(AMV)分别进行反转录。合成第一
链的反转录所用的引物为Oligo(dT)15。
1.6.2 XET基因保守序列的 PCR扩增。根据双子叶植物
XET基因保守序列应用 Primer5.0设计引物,Forwardprimer
5′GAGTTCTTGGGAAAC3′,Reverseprimer5′CCTCTTGTT
GCCCAA3′。反应体系为每管 50μl,依次加入模板 2μl,特
异引物各 1μl(10mmol/L),10×Bufer5μl,dNTP4μl(2.5
mmol/L),Taq酶0.5μl(5U/μl),重蒸水补足体积。
反应扩增程序为:94℃5min;94℃30s,45℃30s,72
℃45s,30个循环;72℃10min;4℃保存。扩增产物于1%琼
脂糖凝胶上电泳检测。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法对 RNA完整性的影响 分别用 5种方
法提取和纯化了团花树韧皮部总 RNA,并进行了电泳检
测,结果见图1、2。由图1可知,冷酚法提取的 RNA,经电泳
检测后条带不十分清晰,无 5S条带,且稍有拖尾现象,有
少量DNA或蛋白污染;1步提取法提取的 RNA,经电泳检
测后可看到 3条较清晰的条带,其中第 1条为 DNA污染,
可能还有少量蛋白污染,28S与18S条带相比带亮度不够;
28S
18S
5S
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
注:Ⅰ为冷酚法;Ⅱ为1步提取法;Ⅲ为改进CTAB法。
Note:Ⅰ.Coldphenolmethod;Ⅱ.Onestepextractionmethod;Ⅲ.
ImprovedCTABmethod.
图1 冷酚法、1步提取法和改进CTAB法提取的总RNA电泳图
Fig.1ElectrophoretogramoftotalDNAextractionbycoldphenol
method,one!stepextractionmethodandimprovedCTABmethod
安徽农业科学 2008年4416
改进 CTAB法提取的 RNA,经电泳检测后可见清晰的 28S
和 18S条带,无其他污染,但 5S条带不明显,说明该方法
不能得到团花树的全部RNA。
由图2可知,杨树RNA提取法电泳图谱,可看到 28S、
18S带且很亮,有 5S条带,这说明该方法质量较好,但是
有少量DNA和蛋白污染。RNAplantReagent法电泳图谱,得
到亮度很高的28S、18S和5S条带,且28S/18S大于2,但
是点样孔中有亮斑,说明样品中有多糖或蛋白质的污染;28
S上方有 1条比较整齐的条带存在,可能是有 DNA污染。
杨树 RNA提取法和 RNAplantReagent法提取的 RNA经过
DNAaseⅠ处理后的电泳图谱表明,经过再次的抽提,排除
了蛋白质、多糖等杂质的干扰,泳道中无背景;28S、18S和
5SRNA条带清晰,得到质量较好的团花树韧皮部总RNA。
2.2 不同提取方法对RNA样品的纯度和产量的影响 从
表 1可以看出,冷酚法、1步提取法、改进 CTAB法提取的
RNAOD260/OD280值都接近于2,说明这3种方法得到的RNA
纯度较好,但是产量都较低。用杨树 RNA提取法、RNAplant
Reagent法提取的 RNA有少量 DNA的污染,但是经过
DNase的处理及氯仿抽提后,OD260/OD280值都在 1.8~2.0,且
OD260/OD230大于2,产量可以达到39.40μg/100mg,说明这2
种方法都能得到质量较好的 RNA,无蛋白质和酚类物质的
干扰,其纯度较高,浓度也较高,完全满足逆转录的要求,可
以用来进行下一步的分子试验。
2.3 不同提取方法提取的RNA的RT!PCR结果 用5种
方法(其中杨树提取法、RNAplantReagent法得到的RNA经
过DNaseⅠ处理)提取的 RNA分别作 RT#PCR,扩增团花树
韧皮部 XET基因保守序列片段,结果如图 3所示。由图
3可知,冷酚法、1步提取法无法扩增出DNA片段,改进CTAB
法扩增出的 DNA片段电泳条带微弱。杨树提取法和
RNAplantReagent法都能扩增出大约 300bp的 DNA片
段,且条带亮度较好。二者相比,RNAplantReagent法得到
的 RAN反转录后 RT#PCR得到的条带质量较好。
3 结论与讨论
(1)由于取材时,用小刀刮取团花树含水分较多的韧皮
部,快速放入液氮中速冻,这样就使材料迅速结成硬度很大
的块状物,给研磨工作带来很大的不便。而且木本植物的组
成成分和结构特点都不同于草本植物,木本植物具有更为
坚硬的细胞壁[2],所以研磨的程度对RNA的得率影响很大。
首先要使材料始终处于液氮环境中,然后快速充分研磨并
振荡,使细胞充分裂解以获得最大得率;为防止RNA降解,
用于 RNA提取的所有试剂及用品都经严格高压灭菌灭活
RNase,整个试验尽可能在低温下操作。
(2)用传统的总RNA的提取方法如冷酚法、1步提取法
来提取团花树韧皮部的总RNA都没有达到很好的效果。主
要原因是团花树除了含有草本植物也具有的蛋白质、多糖
等杂质外,还含有更多的多酚化合物、木质素、纤维等物质[2],
这些因素决定了团花树韧皮部总 RNA提取技术上的特殊
性。CTAB是一种强变性剂,能够有效除去蛋白(含复合蛋
白)等杂质[8];而且在提取液中加入较高质量浓度的 PVP和
β#巯基乙醇,不仅能有效地去除组织中的多酚、多糖,还能
抑制酚类物质氧化后与RNA的不可逆结合。但是,CTAB提
取法需要在 65℃温浴中进行,RNAase的活性得不到很好
的抑制,导致RNA产量较低。
(3)杨树提取法中用异硫氢酸胍这种强变性剂作裂解
28S
18S
5S
28S
18S
5S
28S
18S
5S
28S
18S
5S
M Ⅰ M Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
杨树提取法
Poplarextractionmethod
杨树提取法(DNaseⅠ处理后)
Poplarextractionmethod(AfterDnase
Ⅰtreatment)
RNAplantReagent法
RNAplantReagentmethod
RNAplantReagent法(DNaseⅠ处理后)
RNAplantReagentmethod(AfterDnaseⅠ
treatment)
图2 杨树提取法、RNAplantReagent法提取的总RNA电泳图
Fig.2 ElectrophoretogramoftotalDNAextractionbypoplarextractionmethodandRNAplantReagentmethod
提取方法
Extractionmethod
OD260/OD280OD260/OD230
产率Yields
μg/100mg
冷酚法Coldphenolmethod 2.08 2.39 26.6
1步提取法
One#stepextractionmethod 2.12 2.42 25.0
改进CTAB法
ImprovedCTABmethod
1.96 2.50 26.2
杨树提取法
Poplarextractionmethod
2.09 2.54 43.4
RNAplantReagent法
RNAplantReagentmethod
2.12 2.58 42.8
杨树提取法(DNaseⅠ处理后)
Poplarextraction method(After
DnaseⅠtreatment)
1.95 2.21 38.4
RNAplantReagent法(DNaseⅠ处
理后)
RNAplantReagentmethod(After
DnaseⅠtreatment)
1.99 2.23 39.4
表1 不同提取方法提取的总RNA的纯度与产量的比较
Table1ComparisonofthepurityandyieldsoftotalRNAby
diferentextractionmethods
李 娜等 团花树韧皮部总RNA提取方法的比较研究36卷11期 4417
(上接第4368页)
锁、配送、专卖等现代营销手段。加强农产品市场检验、检
测,创建安全、放心、绿色食品工程。加大品牌培育和宣传推
介力度,提高银川大米、瓜菜、清真牛羊肉、乳制品、灵武长
枣、贺兰山葡萄等优势特色产品的市场知名度和竞争力。
(4)加强劳动力培训和转移,增加劳务产业收入。充分
利用职业学校、农技推广中心、农村现代远程教育中心、大
专院校的资源优势,加强对劳动力进行培训,提高他们的科
技和文化素质,为农民增收、农业增效、提升农产品市场竞
争力提供智力支持。以培育新型农民为重点,大力开展农民
科技培训,重点抓好优势产业带农民科技培训、实用技术培
训。大力实施农村劳动力转移的“阳光工程”培训,采取“订
单培训、定向培训”的办法,加大劳务输出组织规模和质量。
建立健全城乡就业公共服务网络,创造有利于农民进城务
工的环境。
参考文献
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注:M为Marker;Ⅰ为冷酚法;Ⅱ为1步提取法;Ⅲ为改进CTAB法;Ⅳ为杨树提取法(DNaseⅠ处理后) ;Ⅴ为RNAplant
Reagent法(DNaseⅠ处理后)。
Note:M.Marker;Ⅰ.Coldphenolmethod;Ⅱ.One&s epextractionmethod;Ⅲ.ImprovedCTABmethod;Ⅳ.Poplarextraction
method(AfterDnaseⅠtreatment);Ⅴ.RNAplantReagentmethod(AfterDNaseⅠtreatment).
图3 RT!PCR扩增团花树XET基因保守区序列图谱
Fig.3 ConservedregionsequencemapofXETgeneamplificationfromAnthocephaluschinensisbyRT!PCR
液,不仅能解聚核蛋白还能溶解蛋白释放核酸,并能解决改
进 CTAB提取法中温浴导致的 RNAase活性升高,产生无
RNAase的环境[7]。RNAplantReagent法也是从多糖多酚含量
较高、木质化程度较高的的植物组织中提取RNA的1种新
方法,能够彻底快速裂解木本植物细胞,分离核酸。
(4)在改进 CTAB提取法和杨树提取法中,沉淀 RNA
时使用的是 LiCl沉淀,LiCl是助沉剂,一定浓度的 LiCl可
选择性地沉淀 RNA而对 DNA不起作用。在高浓度(>1.6
mol/L)的 iCl溶液中,大分子的 RNA是不溶的,而小分子
RNA、DNA、多糖类碳水化合物是可溶的[9]。因此,在抽提
RNA时,使用 LiCl可以方便地去除对 RT&PCR有抑制作用
的 DNA、多糖类碳水化合物。杨树提取法电泳图谱显示的
少量的DNA污染可能是抽提液相时被中间相所污染所致。
所以抽提上清液时要使用小枪头,且速度要快动作又要轻,
不要触碰蛋白膜。而RNAplantReagent法中使用异丙醇沉淀
RNA,无选择的沉淀使 DNA、多糖类碳水化合物和 RNA共
沉淀,会影响后续反应的进行,因此还要进行进一步的处理。
(5)杨树提取法和 RNAplantReagent法得到的 RNA能
够很好地满足下一步的RT&PCR反应,可以用来作下一步的
RACE试验来克隆基因的全长。
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