全 文 ：收稿日期:2008-02-13
基金项目:国家自然科学基金(30300222);西北农林科技大学优秀人才基金(042R009)
作者简介:张小梅(1979-),女 ,陕西大荔人 ,硕士 ,主要从事生物化学与分子生物学研究。
通讯作者:范三红(1971-),男 ,陕西合阳人 ,副教授 ,主要从事植物分子生物学研究。
拟南芥 Alpha-dioxygenase 1的原核表达 、纯化
及活性的检测
张小梅1 , 2 ,韩念法1 ,张美祥1 ,李广录2 ,范三红1 , 3 ,郭蔼光1 , 3
(1.西北农林科技大学 生命科学学院 ,陕西 杨凌　712100;2.河南科技大学农学院 ,河南洛阳　471003;
3.陕西省农业分子生物学重点实验室 ,陕西杨凌　712100)
　　摘要:从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得 cDNA ,扩增得到 Alpha-dioxygenase 1(DOX1)基因 , 进行原核表
达 、纯化和生物活性检测。利用原核表达载体 pMAL-c4x在 T7 Express Competent E.coli 和 BL21(DE3)-RIPL codon+菌株
中表达 DOX1 ,经 Amylose Resin 亲和层析柱纯化。 SDS-PAGE 结果表明 , 重组融合蛋白在 BL21(DE3)-RIPL codon+中的
表达通过灰度值比较分析以可溶性为主 ,表达率约 3.7%,纯化的 DOX1 纯度可达 45%。愈创木酚法表明 ,可溶性重
组蛋白不具有过氧化物酶活性;2 , 4-DNP 法测试表明可溶性重组蛋白具有脂肪酸双加氧酶活性。
关键词:Alpha-dioxygenase 1;重组表达;2 , 4-DNP;亲和纯化;活性
中图分类号:Q786　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2008)03-0009-04
Expression ,Purification and Activity Analysis of Arabidopsis-dioxygenase 1
ZHANG Xiao-mei1 , 2 ,HAN Nian-fa1 ,ZHANG Mei-xiang1 ,
LI Guang-lu2 ,FAN San-hong1 , 3 ,GUO Ai-guang1 ,3
(1.College of Lifesciences ,Northwest Agriculture and Forestry University ,Yangling　712100 ,China;
2.College of Agronomy ,Henan University of Science and Technology ,Luoyang　471003 ,China;
3.Key Laboratory for Molecular Biology of Agriculture of Shaanxi Province ,Yangling　712100 ,China)
Abstract:Recombinant DOX1 was cloned into pMAL-c4x expression vector and expressed in E .coli T7 Express
Competent E.coli and BL21(DE3)RIPL codon+.Purified using amylose resin column , a fusion protein about 114 kD was
detected by SDS-PAGE in the IPTG induced recombinant BL21(DE3)RIPL codon+ strain , and it′s yield accounts for
3.7% of the total bacterial proteins , the purity of recombinant protein was about 45%.The soluble fusion protein had un-
detectable peroxidase activity by the guaiacol method;The alpha dioxygenase activity of the purified protein was tested us-
ing 2 ,4-DNP , result showed that the soluble fusion protein had detectable alpha-dioxygenase activity.
Key words:Alpha-dioxygenase 1;Recombinant expression;2 ,4-DNP;Affinity purification;Activity
　　生物在长期的进化过程中 ,形成了独特的一套
响应外界环境胁迫的生理及生化过程。这个适应性
包括了一系列复杂的过程:如胁迫信号的受体感应 、
细胞间的信号传递 、细胞内信号级联放大效应 、基因
的表达调控模式改变 、胁迫后恢复正常状态的调节
等。特别是在信号传递及基因表达调控方面 ,多不
饱和脂肪酸氧化物具有重要的作用 。而合成脂氧化
物等信号分子的主要代谢途径为脂肪酸的加氧反
应。Alpha氧化是高等植物体内脂肪酸氧化降解的
辅助途径 。催化脂肪酸 Alpha 氧化的酶是一种双加
氧酶 ,1998年在病原入侵的烟草叶片中首次克隆到
该基因 , 命名 为 PIOX (Pathogen induced oxyge-
nase)[ 1] 。根据在重组烟草 PIOX及拟南芥中同源的
加氧酶分析表明 ,该酶为 alpha 双加氧酶(α-dioxyge-
nase)[ 2] 。在拟南芥中α-dioxygenase 有 2个同源基
因 ,分别命名为α-dioxygenase 1(DOX1)[ 2] 和α-dioxy-
genase 2(DOX2)[ 3] 。拟南芥 DOX1 参与病原微生物
入侵时的防御反应[ 4 ,5] ,能够催化脂肪酸Alpha氧化
的第一步反应 ,将脂肪酸氧化生成 Cn-1烷醛。本研
华北农学报·2008 , 23(3):9-12
究利用 pMAL 表达系统 ,研究了 DOX1 在大肠杆菌
中的可溶性表达 ,并对重组蛋白进行了初步的活性
鉴定 ,为后续工作的开展奠定了基础。
1　材料和方法
1.1　材料
pMAL-c4x载体和 Amylose Resin 亲和层析柱为
NEB公司产品(美国);pPCR-script Amp SK(+)载体
为本实验室保存;Ligation Kit Version 2.0 Taq DNA
Polymerase , primeSTAR HS DNA Polymerase , Protein
Marker及内切酶购自 Takara 公司(大连);Trizol购自
上海英骏公司;T7 Express Competent E.coli , BL21
(DE3)-RIPL codon+、 JM109 等菌株为本实验室保
存;DNA MakerⅢ ,琼脂糖凝胶回收试剂盒 ,质粒提取
试剂盒均购自天根公司(北京);引物由上海英骏公
司合成 ,测序由北京博尚公司完成 。
1.2　方法
1.2.1　DOX1 基因的克隆及原核表达载体的构建
　开花期拟南芥经 0.1%水杨酸[ 4 ,6]处理后第 3天 ,
取1 g 植株 ,加液氮研磨 ,加 1 mL Trizol试剂提取总
RNA ,按照说明书操作 。以拟南芥花期整株总 RNA
为模板 ,以 oligo dT 为引物反转录合成 cDNA 第一
链。以合成的 cDNA 第一链作为模板 ,根据 DOX1
全长 cDNA序列设计引物进行 PCR扩增 ,上下游引
物分别引入 Xba Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切位点。
上游引物:5′-TGCTCTAGAATGAAAGTAATTACTT
CCCTAATC-3′
下游引物:5′-AACTGCAGTTAAGAGGGAATTCG
GAG-3′
扩增条件为:94℃预变性 5 min;94℃变性 45 s ,
55℃退火 45 s ,72℃延伸 2.5 min , 30个循环 , 72℃延
伸5 min。用 1%的琼脂糖电泳检测并回收目的片
段 ,PCR扩增产物与经过 EcoRV 单酶切的 pPCR-
script Amp SK(+)载体连接后测序 ,并命名为 pPCR-
DOX1 。用 Xba I和 Pst I双酶切pPCR-DOX1 ,割胶回
收目的片段 ,再将其与相同酶消化回收的 pMAL-c4x
载体连接 ,最后获得重组载体 pMAL-DOX1 。
1.2.2　DOX1 基因的诱导表达　将 pMAL-DOX1 分
别导入 T7 Express Competent E .coli 和 BL21(DE3)-
RIPL codon+感受态细胞 。挑取单菌落接种于含 50
mg/mL氨苄青霉素和 34 mg/mL 氯霉素的 LB培养
基中 ,37℃,200 r/min过夜培养;以 1∶500的接种量
接到 2YT 培养基中 ,扩大培养 6 h左右 ,加入终浓度
为0.3 mmol/L 的 IPTG ,20℃,诱导表达 25 h。8 000
r/min离心 1 min收集菌体 ,加入上样缓冲液 ,煮沸 8
min ,进行 SDS-PAGE 分析 ,考马斯亮蓝染色 ,观察
照相 。
1.2.3　重组蛋白的可溶性分析及 DOX1 亲和纯化
　大量诱导表达后的菌体经超声波裂解菌体 , 4℃
12 000 r/min离心 20 min ,分别保留上清和沉淀。上
清部分按照 pMAL 蛋白纯化系统进行纯化 ,先上低
盐缓冲液平衡柱材 ,然后上清液上柱 ,重悬柱材 ,冰
浴 30 min ,弃去流出液 ,15 倍柱体积低盐缓冲液洗
脱 ,10倍柱体积高盐缓冲液洗脱 ,5倍柱体积低盐缓
冲液洗脱 , 2 倍柱体积洗脱液洗脱 , 收集样品液。
SDS-PAGE检测对比上清 、沉淀及纯化结果。
1.2.4　DOX1 过氧化物酶活性分析　根据上述反
应体系加样 ,用分光光度计测定 470 nm处光吸收值
变化[ 7](表1)。
表 1　DOX1 过氧化物酶活性分析
Tab.1　Peroxidase activity analysis of DOX1
对照/mL
Control
样品/mL
Sample
0.1%Guaiacol 0.2 0.2
0.18%H2O2 0.2 0.2
Glacialaceticacid-sodium acetate 2.6 2.5
Sample - 0.1
1.2.5　初步进行 DOX1 的α-dioxygenase活性分析　
DOX1 的α-dioxygenase 活性通过间接测定其与脂肪
酸孵育得到的醛来分析[ 7] ,以月桂酸为底物。反应
混合物包括 10 mmol/L 月桂酸/1 mol/L Tris-HCl ,
pH7.5 ,100μL蛋白纯化产物 ,补水至总体积500μL ,
30℃孵育 30 min , 加入 500 μL 2 , 4-DNP 醇酸溶液 ,
50℃30 min ,冰浴 ,加 2.5 mL 10%NaOH/80%乙醇 ,
20℃,1 300×g 20 min ,420 ～ 500 nm下进行吸光值扫
描[ 8] 。
2　结果与分析
2.1　pMAL-DOX1 融合表达载体的构建
根据拟南芥 DOX1 cDNA 编码区设计上下游引
物 ,上下游引物中分别包含 Xba Ⅰ和 Pst Ⅰ位点。用
高保真酶 primeSTARHS DNA Polymerase PCR扩增获
得 2 kb左右的平末端目的片段(图 1-A),割胶回收
后直接克隆入 pPCR-script Amp SK(+)载体 ,获得
pPCR-DOX1 。将 DOX1 编码区从 pPCR-DOX1 中切
出并与 pMAL-c4x 载体连接 , 获得表达载体 pMAL-
DOX1 。图 1-B 为 pMAL-DOX1 XbaI 和 Pst I 双酶切
鉴定结果 ,大片段为载体对应条带 ,小片段为目的基
因对应条带。
2.2　DOX1 基因的诱导表达
重组质粒 pMAL-DOX1 分别导入 T7 Express
10　 华　北　农　学　报 23卷
Competent E.coli和 BL21(DE3)-RIPL codon+中进行
诱导表达。SDS-PAGE分析表明(图 2),与对照组比
较 ,重组质粒在 T7 Express Competent E.coli 诱导后
没有特异蛋白条带 ,而在 BL21(DE3)-RIPL codon+中
观测到约 114 kD的特异蛋白条带 ,与预期的大小相
符 ,如 1 ,2泳道 。在空质粒对照组中约 43 kD 处有
特异蛋白的表达 ,这与MBP 的大小42.5 kD相符 ,说
明重组蛋白在 BL21(DE3)-RIPL codon+中得到表达。
A.DOX1 的 PCR扩增;M.DNA MakerⅢ分子量;1.DOX1 扩增结果;
B.pMAL-DOX1酶切鉴定;M.DNA MakerⅢ分子量对照;1.pMAL-DOX1
的Xba Ⅰ和 Pst Ⅰ酶切结果
A.Amplificat ion of DOX1 by PCR;M.DNA MakerⅢ;1.DOX1;B.Restric-
tion analysis of the recombinant plasmid pMAL-DOX1;M.DNA MakerⅢ;1.
pMAL-DOX1/ XbaⅠ +Pst Ⅰ
图 1　DOX1 的 PCR扩增和 pMAL-DOX1 酶切鉴定结果
Fig.1　Amplification of DOX1 by PCR
and restriction analysis of the recombinant
plasmid pMAL-DOX1
1 ,2.pMAL-DOX1 转化 BL21(DE3)-RIPL codon+诱导表达;3.pMAL-
c4x 转化 BL21(DE3)-RIPL codon+对照组;4.pMAL-c4x 转化T7 Express
对照组;5 , 6.pMAL-DOX1 转化T7 Express诱导表达;M.标准蛋白
1 , 2.Expressed protein of pMAL-DOX1 in BL21(DE3)-RIPL codon+;3.
BL21(DE3)-RIPL codon+with pMAL-c4x as a control;4.T7 Express with
pMAL-c4x as a control;5 , 6.expressed protein of pMAL-DOX1 in T7 Ex-
press;M.marker
图 2　重组 DOX1 的 SDS-PAGE分析
Fig.2　SDS-PAGE analysis for recombinant DOX1
2.3　重组蛋白的可溶性分析和 DOX1 亲和纯化
诱导后的菌体经超声波破菌后 ,分别收集沉淀
和上清 ,沉淀用与上清等体积的低盐缓冲液重悬 。
上清部分经 Amylose Resin亲和层析柱纯化 ,收集最
终纯化产物 。沉淀重悬液 、上清和纯化产物分别经
SDS-PAGE分析 ,如图 3所示 ,沉淀样品及上清样品
所在泳道均出现重组蛋白的特异条带 ,通过灰度值
比较分析可知 ,上清样品中的重组蛋白量大于沉淀
样品 。因此 ,可以确认重组蛋白主要以可溶性形式
存在 。纯化重组蛋白样品泳道除了检测到目的条带
外 ,还在约43 kD处检测到了MBP条带 。这可能是
在诱导表达的过程中 ,重组蛋白分子量太大而导致
DOX1蛋白与 MBP 断裂分开的结果。经 Bandscan
5.0软件分析 ,表达的重组蛋白约占大肠杆菌总蛋
白的 3.7%,纯化的DOX1纯度达45%。分子量与理
论值一致 ,约为114 kD。
M.标准蛋白;1.pMAL-c4x 转化 BL21(DE3)-RIPL codon+对照组;2.
pMAL-DOX1 转化BL21(DE3)-RIPL codon+诱导表达;3.裂解液沉淀部
分;4.裂解液上清部分;5.纯化的重组蛋白
M.Marker;1.BL21(DE3)-RIPL codon+with pMAL-c4x as a cont rol;2.Ex-
pressed protein of pMAL-DOX1 in BL21(DE3)-RIPL codon+;3.Precipitate
of the lysate;4.Supernatant of the lysate;5.Purified recombinant protein
图 3　重组蛋白的可溶性分析及 Amylose Resin亲
和层析柱纯化结果
Fig.3　Solubilty analysis of recombinant protein and
purification of recombinant protein by Amylose column
图 4　DOX1 的α-dioxygenase活性分析
Fig.4　α-dioxygenase activity analysis of DOX1
2.4　DOX1 过氧化物酶活性分析
将重组蛋白纯化产物加入到含有愈创木酚和
H2O2的反应液中 ,用分光光度计测定 470 nm 处光
吸收值 ,结果显示 470 nm 处光吸收值为 0.004 ,该数
值趋近于零 ,且随时间的变化 ,吸光值无变化 ,表明
3期 张小梅等:拟南芥Alpha-dioxygenase 1的原核表达 、 纯化及活性的检测 11　
纯化的重组蛋白没有过氧化物酶活性.
2.5　DOX1 的α-dioxygenase活性分析
DOX1 与脂肪酸一起孵育 ,反应生成少一个碳
原子的醛[ 8] ,生成的醛与 2 ,4-DNP醇酸溶液反应 ,在
碱性条件下生成红色的物质 Quinoidalion[ 9] ,以月桂
酸的 2 ,4-DNPH 衍生物为基准调零 ,在 420 ～ 500 nm
下进行吸光值扫描(图4)。结果显示在456 nm处有
吸收峰 ,表明重组蛋白有α-dioxygenase活性。
3　讨论
为了得到更多的可溶性重组蛋白 ,对 DOX1 做
更深入的分析 ,本研究试图利用 pMAL 融合表达系
统表达 DOX1 ,该系统具有表达标签 MBP ,有利于重
组蛋白正确折叠 ,因此表达的融合蛋白产物大多为
可溶蛋白 。在本研究中选用了 T7 Express Competent
E .coli及 BL21(DE3)-RIPL codon+2种表达菌 ,研究
结果表明 , DOX1 在 T7 Express Competent E.coli 中
检测不到表达 ,这可能与密码子偏爱性有关[ 10] ,而
在BL21(DE3)-RIPL codon+中 ,能够检测到目的蛋白
特异表达 , 表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的
3.7%,且多以可溶性形式存在 。
植物 DOX 均存在类血红素过氧化物酶结构域 ,
而原核表达的水稻脂肪酸 DOX 及拟南芥DOX2 均
不具备过氧化物酶活性[ 6 ,11] ,本研究分析结果显示 ,
融合表达的 DOX1 检测不到过氧化物酶活性 ,这与
已有的结果并不冲突 。这可能有多种原因 ,尽管融
合蛋白为可溶性并能与亲和柱结合 ,但是原核表达
系统使蛋白构象折叠依然达不到真核表达系统水
平 ,推论其需要与其他蛋白形成复合体才能具有过
氧化物酶活性 ,如豌豆脂肪酸 Alpha-dioxygenase与醛
脱氢酶形成复合体[ 6] ,而本研究中实现 DOX1 的可
溶性表达也为后续对醛脱氢酶进行共同表达的探讨
提供了条件。
拟南芥 DOX1 主要受病原侵染诱导表达 ,对外
界逆境如创伤等起应答反应 ,前人研究发现该酶参
与脂肪酸的代谢 ,能够对脂肪酸的 Alpha 位进行氧
化 ,生成少一个碳原子的烷醛 。本研究通过化学方
法检测到重组 DOX1 的双加氧酶活性 ,但是由于化
学方法只是定性而非定量 ,因此 ,后续研究中需要进
行更精确的活性测定 ,进一步阐明其生物学功能以
及参与植物抗病机理。
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