全 文 ：第 !" 卷 第 ## 期
$ % # % 年 ## 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1##
*/23!$ % # %
毛白杨木材形成功能基因内 &&A标记的开发及评价!
杜庆章#!$4王博文#!$4王保垒#!$4 张4曼54李百炼#!$4张志毅#!$4张德强#!$
"#1北京林业大学林木育种国家工程实验室4北京 #%%%75# $1北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室4北京 #%%%75#
51西北农林科技大学4杨凌 :#$#%%$
摘4要!4利用直接测序法开发木材形成功能基因内一套新的核基因组 &&A标记& 通过对参与木材形成的 #" 个
基因在 !% 个毛白杨基因型个体中的序列比较分析!共检测到 $% 个 &&A多态性位点& 在毛白杨自然群体中!&&A多
态性位点的碱基重复呈现出二碱基%三碱基%五碱基%六碱基与七碱基形式!基元重复次数变异范围为 $ 95! 次!其
中以二碱基重复的位点较多!占总数的 881%a& 在此基础上!依据 &&A位点两侧的保守序列!设计 $% 对 &&A位点
k’A扩增引物对& 利用设计的引物检测开发的 &&A位点在杨属内 #8 个基因型个体中 k’A扩增的有效性及 &&A
位点的保守性& k’A扩增结果显示!6%1%a的 &&A位点能够在杨属至少 $ 个派内有效扩增!每对引物组合可检测
到 &&A多样性位点数为 5 96 个!平均 815 个& 开发的这些 &&A位点在功能基因内不同区域的分布频率不同&
关键词’4毛白杨# 木材形成# 基于基因的 &&A标记
中图分类号! &:#71!"" ?6!51$444文献标识码!,444文章编号!#%%# >:!77#$%#%$## >%%%7 >%7
收稿日期’ $%#% >%: >%7# 修回日期’ $%#% >%7 >%5&
基金项目’ 中央高校基本科研业务费专项资金"C-\’$%%6%"$ # 国家自然科学基金"5%"%%!:6! 5%7:$%!$$ # 教育部科学技术研究重大项目
"5%:%%"$ # 全国百篇优秀博士论文专项基金 "$%%::%$ # 教育部新世纪优秀人才支持计划专项基金 "*’)+^%: %^%7!$ # 国家林业局 6!7 项目
"$%%6 !^ $^$$ &
!张德强为通讯作者&
E.A.%"#F.)’&)L.)./M)A"%A.<()1""KE ?DIJ‘=GIJ#! $4LGIJC/YMI#! $4LGIJCG/0MD#! $4H=GIJ]GI5
-DCGD0DGI#! $4H=GIJH=DND#! $4 H=GIJKMQDGIJ#! $
"#IO/+4$0/%<0640))(406 ./;$(/+$(,&$(F())A())1406! A)4B406 ’$()*+(,7048)(*4+,4A)4B406 #%%%75# $I:),./;$(/+$(,$&E)0)+4"*
/01 A())1406 40 ’$()*+F())*/01 P(0/=)0+/%?%/0+*$&H404*+(,$&<15"/+4$0! A)4B406 ’$()*+(,7048)(*4+,4A)4B406 #%%%75#
51O$(+#Q)*+3-’7048)(*4+,4R/06%406 :#$#%%$
78/’,&-’’4&SMRDMW^WSMRDXDRWD;S0MWMQEMIRMVMSMGT" &&A$ ;GVdMVWGVMUMWDVGZ0MX/VJMIMTDRWTEUDMWGIU T/=GVIMWWT=M
S/TMITDG0/X],& Z^GWMU ZVMMUDIJX/VJMIMTDRD;SV/2M;MIT/XY//U XDZMVTVGDTWDI TVMMW3(I T=DWWTEUN! YMVMS/VTT=GTGWMT/X
IMYS/0N;/VS=DRIER0MGV&&A ;GVdMVWYMVMUM2M0/SMU GIU R=GVGRTMVD‘MU DI ?$25%5*+$=)0+$*/ ZN;MGIW/XUDVMRT
WMQEMIRDIJ/XXEIRTD/IG0JMIMWDI2/02MU DI Y//U X/V;GTD/I3,T/TG0/X$% S/0N;/VS=DR&&A0/RDYMVMDUMITDXDMU YDT=DI #"
JMIMWXV/;!% EIVM0GTMU DIUD2DUEG0WDI ?3+$=)0+$*/3+=M&&ATNSMW/XUD^! TVD^! SMITG^! =M_G^! GIU =MSTG^ IER0M/TDUM
VMSMGTWGIU ;/TDXWVMSMGTW2GVDMU XV/;$ T/5! YMVMUDWS0GNMU! YDT= UDIER0M/TDUM&&AWZMDIJT=M;/WTXVMQEMIT! GRR/EITDIJ
X/V881%a /XT=MT/TG00/RDDI T=MIGTEVG0S/SE0GTD/I /X?3+$=)0+$*/3+YMITNSVD;MVSGDVWX/Vk’AG;S0DXDRGTD/I &&A0/RD
YMVMUMWDJIMU ZGWMU /I T=MR/IWMV2GTD2MX0GIdDIJWMQEMIRMW/X&&A0/RD3+=MMXDRDMIRNGIU R/IWMV2GTD/I /X&&A0/RDYMVM
TMWTMU G;/IJ#8 DIUD2DUEG0WEIUMVJMIEW?$25%5*3+=Mk’AG;S0DXDRGTD/I M_=DZDTMU GI G2MVGJM/X6%1%a R/IWMV2GTD/I DI
GT0MGWTTY/JV/ESWEIUMVJMIEW?$25%5*! GIU T=MIE;ZMV/XG0M0MWSV/UERMU VGIJMU XV/;5 T/6! YDT= GI G2MVGJM/X815
G0M0MWSMV0/REW3@EVT=MV;/VM! T=M&&A0/RDYMVMI/I V^GIU/;0NUDWTVDZETMU YDT=DI UDXMVMITVMJD/IW/XXEIRTD/IG0JMIMW3
+=MJMIM^ZGWMU &&A;GVdMVWUM2M0/SMU =MVMY/E0U SV/2DUMGS/YMVXE0T//0X/V],& ZVMMUDIJ/XIMYJMV;S0GW;WYDT=
UMWDVGZ0MY//U XDZMVTVGDTWDI ?3+$=)0+$*/! GIU =G2MT=M/VMTDRG0GIU SVGRTDRG0WDJIDXDRGIRMDI TVMMZVMMUDIJ3
9.: ;",44为应对人类面临的全球性能源危机和温室效应
的日益加剧!新能源的研发已成为世界各国优先发
展的战略!纤维质生物量是最丰富的可再生资源!通
过生物转化成乙醇可替代石油作液体燃料!有望解
4第 ## 期 杜庆章等’ 毛白杨木材形成功能基因内 &&A标记的开发及评价
决出现的能源短缺问题"KM;DVZGW! $%%8$& 而森林
作为最重要的陆地生态系统!为人类生存提供了约
7%a的纤维质生物量 "KM;DVZGW! $%%8$& 其中!由
于杨树"?$25%5*$有生长迅速%轮伐期短%种间杂交
与无性繁殖比较容易和便于遗传操作等优点!在北
半球被认为是最具前途的纤维质能源树种 "-D)+
/%3! $%%7$& 因此!深入研究木材生物合成途径!阐
明木材纤维性状形成的分子机制是加速木材品质遗
传改良的基础&
而目前在分子遗传学方面的主要进展是通过分
子标记辅助选择";GVdMVGWWDWTMU WM0MRTD/I!],&$策
略将影响木材纤维性状的多个基因剖分开来!可以
像研究质量性状基因位点一样!对这些数量性状基
因位点进行研究!研究这些基因在染色体上的位置!
并寻找与其紧密连锁的分子标记!以此来对林木进
行遗 传 改 良 "CV/YI )+/%3! $%%5# H=GIJ)+/%3!
$%%"$& 在常见的分子标记技术中!简单序列重复
"WD;S0MWMQEMIRMVMSMGTW!&&AW$也称微卫星 K*,!由
于具有多态性高%共显性遗传%检测容易且结果稳
定%重复性强等优点!被认为是一种理想的分子标记
"+EWdGI )+/%3! $%%!$& 但!先前开发的 &&A位点多
来自基因组的随机区域!而这些 &&A多呈中性进
化!与物种表型性状的形成连锁不太紧密"+EWdGI )+
/%3! $%%!$& 与此不同!基因内的 &&A由于其功能重
要性!在进化过程中!一般会受到较强烈的选择压!
造成与物种的表型性状紧密连锁"-D)+/%3! $%%!$&
因此!开发木材形成功能基因内 &&A位点!是利用
该标记技术进行重要纤维品质性状分子标记辅助育
种的前提&
为此! 本 研 究 以 最 大 程 度 地 反 映 毛 白 杨
"?$25%5*+$=)0+$*/$自然分布区域的 !% 个基因型个
体为材料!在测定木材形成相关基因序列的基础上!
发现基因内不同区域 &&A位点!并依据 &&A位点两
侧的保守区域设计 &&A扩增引物& 在此基础上!以
杨属内白杨派 " .)5")$%黑杨派 "346)4($*$%青杨派
"F/"/=/#/"/$%胡杨派"F5(/06/$#8 个基因型个体
为试验材料!对开发的 $% 对 &&A引物进行了多态
性评价!证明了其在杨属内的有效性& 研究结果为
利用功能基因内 &&A位点进行 ?+-分析及连锁不
平衡"0DIdGJMUDWMQED0DZVDE;!-K$作图提供了重要的
科学理论依据!具有重要的应用价值&
#4材料与方法
=C=>植物材料
用于毛白杨木材形成相关基因内 &&A发现的
材料取自全国毛白杨基因库中能够最大程度地反映
毛白杨天然分布范围的 !% 株基因型个体 "徐煲铧
等!$%%6$# 而用于 &&A引物有效性评价的材料为表
# 中杨属内 #8 个基因型个体&
表 =>用于 @@I引物有效性评价材料
2&8?=>2+.F&’.,(&%/$/.<0",.A&%$&’(")
"0@@I#,(F.,#&(,/
派别
&MRTD/I
树种
&SMRDMW
来源4
&/EVRM4
标本号
./ER=MV*/3
白杨派 毛白杨 ?1+$=)0+$*/ 北京 CMDPDIJ HK?^%#5
.)5") 欧洲山杨 ?3+()=5%/ 瑞典 &YMUMI HK?^%#8
山杨 ?31/8414/0/ 北京 CMDPDIJ ]FB^%#7
银白杨 ?I/%;/ 北京 CMDPDIJ LHH^%#8
新疆杨 ?3;$%)/0/ 新疆 [DIPDGIJ LHH^%#:
河北杨 ?3#$2)4)0*4* 北京 CMDPDIJ LHH^%#"
黑杨派 美洲黑杨 ?31)%+$41)* 美国 ,;MVDRG HK?^%%7
346)4($*
4
箭杆杨
?3046(/ 2GV3+#)8)*+40/
河北 FMZMD HK?^%#%
钻天杨
?3046(/ 2GV34+/%4"/
河北 FMZMD HK?^%##
青杨派 小叶杨 ?I*4=$04 内蒙古
(IIMV]/IJ/0DG
LHH^%%$
F/"/=/#/"/ 大青杨 ?35**5(4)0*4* 吉林 \D0DI \[C^%$5
香杨 ?3*5/8)$%)0* 韩国 l/VMG LHH^%%!
滇杨 ?3,500/0)0*4* 云南 BEIIGI HK?^%$7
胡杨派 胡杨 ?I)52#(/+4"/ $ 新疆 [DIPDGIJ H&-^%$"
F5(/06/
4
胡杨 ?I)52#(/+4"/%
内蒙古
(IIMV]/IJ/0DG
H&-^%$:
外类群
oETJV/ES
馒头柳
!/%4G=/+*51/0/
北京 CMDPDIJ HK?^%5%
=CB>总 EN7的提取
总 K*,提取按 K*MGWNk0GIT]DIDlDTW"?DGJMI!
(IR3!.G0MIRDG! ’,! p&,$描述的方法进行&
=CD>@@I位点发现及引物开发
作者所在课题组在进行杨树主干维管组织如韧
皮部%形成层%未成熟木质部及成熟木质部基因表达
谱芯片分析时发现许多高丰度差异表达的基因!本
研究从中选取了在形成层及成熟木质部表达量超过
其他组织 8 倍以上的 #" 个基因作为候选序列!并设
计了基因特异的 k’A扩增引物& 在此基础上!以
#1# 中描述的 !% 株毛白杨基因型个体为材料进行
k’A扩增& 将 k’A扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
分离!回收%纯化目的片段后与 kO)]+^载体连接!
转化后挑取阳性单克隆进行序列测定!然后将每一
基因片段的核苷酸序列拼接成完整的基因序列& 利
用 ])O,!18%1! 软件对每一基因的 !% 个序列进行
比对分析!从而发现基因内 "启动子%8hp+A%外显
子%内含子%5hp+A$不同区域 &&A位点!并依据
&&A位点两侧的保守区域设计 &&A扩增引物&
6
林 业 科 学 !" 卷4
=CO>@@I位点扩增及电泳检测
根据设计的核苷酸引物对应用 $8 --K*,聚
合酶链式反应"k’A$体系! 以杨属不同种及毛白杨
种内不同个体提取的 K*,为模板!加入 $18 --
#% mZEXMV! #17 --$8 ;;/0(-># ]J’0$! # --
#% ;;/0(-># U*+k!F/DK*,聚合酶 #1% p"以上试
剂购自 kV/;MJG公司$! #%% I;/0(->#正向和反向引
物各 # --! 加适量双蒸水至 $8 --& 于 6! j !
5 ;DI&"65j! 5% W&8" j! 5% W& :$j! !% W$!
58 个循环&:$ j! 8 ;DI 热循环条件下!扩增出预
期长度的目的片段& 扩增产物加入 #% ---/GUDIJ
ZEXMV"67a甲酰胺!#% ;;/0(-># )K+,!%1$8a二甲
苯青!%1$8a溴芬蓝$!经变性后在 "a的变性聚丙
烯酰胺胶上电泳分离!条件是 68 L!$ %%% .!恒功
率电泳约 :% ;DI& 电泳后采用 +D_DMV等"#66:$的银
染检测方法进行显色观察!记录扩增结果&
=CP>@@I引物的有效性评价
利用开发的 &&A引物!检测其在杨属内不同个
体间的有效性扩增!并分析其多态性# 根据电泳结
果!统计扩增谱带!建立 %!# 矩阵# 在 *+&BSR$1#%
软件中计算种间个体的遗传相似系数 "JMIMTDR
WD;D0GVDTN! O&$及遗传距离"JMIMTDRUDWTGIRM! OK$!
并进行个体之间的 pkO],聚类分析!最终在分子
水平上确定杨属内各派间亲缘关系&
$4结果与分析
BC=>毛白杨木材形成相关基因内 @@I位点发现
为了检测杨树木材形成相关基因内的 &&A位
点!选取了在杨树主干维管组织差异表达的 #" 个候
选基因作为目标!对这些基因的 8hp+A%外显子%内
含子%5hp+A及部分基因的启动子区域进行克隆
"表 $$& 由表 $ 可见!分析的这 #" 个基因长度为
"6$ 9 7 !5! ZS! 共 覆 盖 杨 树 基 因 组 长 度 为
:6 58! ZS&通过对在木材主干维管组织差异表达的
#" 个基因在 !% 个毛白杨基因型个体中的序列比较
分析!共检测到 $% 个 &&A位点 "表 5$& 由表 5 可
见!开发的这 $% 个 &&A位点!均源于基因的非编码
区!即基因的启动子%8hp+A%内含子及 5hp+A区
域& 其中!有 #% 个位点源于内含子区域!占总位点
数的 8%1%a# 而有 " 个则位于启动子区域"表 5$&
在这 $% 个 &&A位点中!碱基重复呈现出二碱基%三
碱基%五碱基%六碱基与七碱基形式!其中以二碱基
重复的位点较多!占总数的 88a!且尤以 ",+$ I!
"’+$ I!"+’$ I 较普遍"表 5$&
表 B>用于 @@I检测的候选基因
2&8?B>*&)<(<&’.6.)./$/.<0",@@I<.’.-’(")
基因名称
OMIMIG;M
推测的基因功能
kETGTD2MXEIRTD/I
分析的基因
长度
OMIM0MIJT=
GIG0N‘MUiZS
?+@)*3S 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW 7 !5!
?+@)*3ST 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW " "65
?+@)*3U 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW " $7"
?+@)*3V 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW 7 #"%
?+@)*3W 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW " 76"
?+@)*3XY 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW 8 :"$
?+@)*3XX 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW : %%7
?+@)*3XZ 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW 7 !%8
:O3F
维管形成层发育
.GWRE0GVRG;ZDE;UM2M0/S;MIT
" %$!
:PKA 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW ! $$7
!5!,Z 蔗糖生物合成 &ERV/WMZD/WNIT=MWDW 8 5!#
[5*"#)%
维管形成层发育
.GWRE0GVRG;ZDE;UM2M0/S;MIT
$ $#6
@!9
木质素单体生物合成
]/I/0DJI/0ZD/WNIT=MWDW
"6$
@PA.XY 纤维素生物合成 ’M0E0/WMZD/WNIT=MWDW $ !##
3"+40
细胞骨架维持
]GDITMIGIRM/XRNT/WdM0MT/I
$ #8"
!5!,U 蔗糖生物合成 &ERV/WMZD/WNIT=MWDW 8 "!#
总和 +/TG0 :6 58!
表 D>基因内开发的 @@I位点
2&8?D>@@I%"-(<.A.%"#.<;(’+()6.)./
&&A位点名称
&&A0/RDIG;M
重复基元
&&A;/TDX
&&A位点来源
&&A0/RDW/EVRM
HK?&&A$ "’+$ "!: ?+@)*3S 8hp+A
HK?&&A8 ",+$ I ?+@)*3T SV/;/TMV
HK?&&A" "’+$ $ ?+@)*3S DITV/I5
HK?&&A#% "++’+’’$ $ ?+@)*3U DITV/I"
HK?&&A#$ ",O$ I ?+@)*3V SV/;/TMV
HK?&&A#5 "+OO$ $ ?+@)*3V DITV/I!
HK?&&A#" "’+$ $ /V! ?+@)*3W DITV/I5
HK?&&A#6 "’,,,’,$ 5 98 ?+@)*3XY SV/;/TMV
HK?&&A$# "+,$ ! 9: ?+@)*3XY DITV/I5
HK?&&A$! "+’$ I ?+@)*3XX DITV/I"
HK?&&A$8 "++,$ : 9## ?+@)*3XZ SV/;/TMV
HK?&&A$7 "+’$ : 9#5 ?+@)*3XZ DITV/I"
HK?&&A!! "OO’+,$ #!$ ?+:O3FX DITV/I5
HK?&&A!: "+’’$ $! 5 ?+:$(ADITV/I5
HK?&&A8% "’+’+’++$ #! $ ?+!5!,A8hp+A
HK?&&A8! ",+$ " 97 ?+[5ASV/;/TMV
HK?&&A87 "’++$ ! 9" ?+@T95hp+A
HK?&&A"! "’+$ 8 ?+@$;%XY DITV/I!
HK?&&A:# "+’$ 7 ?+3@F\ 8hp+A
HK?&&A75 ",+++++$ ! ?+!5!,U SV/;/TMV
BCB>@@I位点 !*I扩增引物的设计及有效性
检测
在 &&A位点发现的基础上!依据其两端的保守
序列!设计了 $% 对 &&A位点 k’A扩增引物"表 !$&
为了检测所设计的这 $% 对引物组合在杨属内 k’A
%#
4第 ## 期 杜庆章等’ 毛白杨木材形成功能基因内 &&A标记的开发及评价
扩增的有效性!以表 # 所列的杨属白杨派%黑杨派%
青杨派及胡杨派内 #8 个基因型个体为材料进行
k’A扩增及等位位点多样性检测!结果列于表 ! 与
表 8& 可见!除引物对 HK?&&A$! 与 HK?&&A$! 仅
能在白杨派树种中进行有效扩增外!其他 #7 对引物
组合都至少能在 $ 个派内个体中进行有效扩增!因
此!在开发的 &&A标记引物中!#%%a能够在同一派
内不同树种中得到有效扩增!6%a的标记可在同一
属内不同种间进行有效扩增!而 :8a以上的标记能
够延伸到同一科的柳属树种中得到扩增"表 8$& 每
对引物组合可检测到 &&A多样性位点数为 5 96
个!共检测到 #%" 个多样性位点!平均 815 个&
表 O>设计的 @@I扩增位点引物
2&8?O>@@I%"-(&F#%(0(-&’(")#,(F.,#&(,/<./(6).<
&&A位点名称
&&A0/RDIG;M
引物序列"8h)5h$
kVD;MVWMQEMIRMW
预期片段长度
)_SMRTMU SV/UERT0MIJT=iZS
检测到的等位位点数目
*E;ZMV/XG0M0MW/ZWMV2MU
HK?&&A$ @’ O,+O+O’+’+O’’+,,’,O,’, #5! 9#!% !
A’ OO++O,OO,O++OO+OO’,
HK?&&A8 @’ ’O’+O’+,O+,O+,’’,’+, 5$6 95!# :
A’ ’,’O’,,’+++,’’’,’’’
HK?&&A" @’ O+,O’O+++’’,’,O+OO,+ $!# 9$!: !
A’ ’OO’OO,,’++O,O’+OO+
HK?&&A#% @’ OO+O,++,OO’++’,O’’,, #:! 9#6$ !
A’ ’++,+O,O’’++OO’,,’’,,
HK?&&A#$ @’ O+O+O+’O+’O’+++’O++ $5% 9$!7 :
A’ +’’,,O,+’O,’’O,+O’+
HK?&&A#5 @’ O’,+’+O,+O+’’,’’,,+’, #85 9#8: 5
A’ ’’’,O+’’BOO+O,,’’,,
HK?&&A#" @’ ’+O+’+’,+’,,+’+,’++O++O+ 5"# 95"6 8
A’ ’O+,’,O,++O,++O+’,OO+O+
HK?&&A#6 @’ OO++,,’’,+,O’O,,’O’,, $#6 9$!5 8
A’ O,’O,’’,,’+’OO+O+’,
HK?&&A$# @’ OO++’’,,++’,,+OO,+++O+ #:8 9#7# !
A’ OO++’,O,,,’+OO,+,+OOO+
HK?&&A$! @’ OO+++O’’O’,+’++OO,+ #5: 9#88 :
A’ +O+O+++O+O+O’++O+++O+
HK?&&A$8 @’ ’+O’++O+O+,++,+,,’+’,+O #%7 9#$" :
A’ ’,’,O’,,,,,+,,O++,’,O,
HK?&&A$7 @’ ,’O,+O’’+,+OO,++O+OO #7! 9$%" 7
A’ ’O+O,+O+O+O+O+O+O+
HK?&&A!! @’ ’+,O+O++’,,O++’’+’+O #8# 9#"# 5
A’ ’+++’’OO,+O’,,+’,+O+O
HK?&&A!: @’ O+O,+’+’O++’+O,OO++ #76 9#67 !
A’ O+’,,’,O’,O++’,+’,OO++
HK?&&A8% @’ OO+O’+O,’,,,,’+’+O’+ $55 9$!: 5
A’ +,+,O’,O,,,O’+’+’,+O’
HK?&&A8! @’ O,’,+O,+O,,’,’+,’’+’+O #5! 9#8" 6
A’ ’,+O+’+,O+O,’,’+,+’,+OO
HK?&&A87 @’ O++O’,,,O’’,,OO+’’+++ #%: 9#$! :
A’ ’,+’’,O,,’’,+’’’O’++
HK?&&A"! @’ ’,O,O,+O’,O,’’O,,O+ $$6 9$58 5
A’ O’,++O’,’+,+O+’+O’O+
HK?&&A:# @’ O,,,OO’+O+’,O,’,OO+ #66 9$#: 5
A’ O,’++O’+,O’+OO+OO++
HK?&&A75 @’ OO’+O’,O+’’’+O,’,,, #6$ 9$!" 6
A’ ,O,+’+’O+O’,+’O+O’,
总和 +/TG0 #%"
##
林 业 科 学 !" 卷4
表 P>@@I引物在杨属内个体扩增的有效性评价!
2&8?P>GA&%$&’(")"0’+.$’(%(’: "0@@I#,(F.,#&(,/
()()<(A(<$&%/0,"F*+,$#$%
&&A位点名称
&&A0/RDIG;M
青杨派
F/"/=/#/"/
白杨派
.)5")
黑杨派
346)4($*
胡杨派
F5(/06/
HK?&&A$ > q q >
HK?&&A8 q q q q
HK?&&A" q q q >
HK?&&A#% q q q r
HK?&&A#$ q q q >
HK?&&A#5 > q > >
HK?&&A#" q q q >
HK?&&A#6 q q r r
HK?&&A$# q q q >
HK?&&A$! r q r r
HK?&&A$8 r q r r
HK?&&A$7 q q q >
HK?&&A!! q q q >
HK?&&A!: q q q >
HK?&&A8% q q > r
HK?&&A8! q q q >
HK?&&A87 q q > >
HK?&&A"! q > q >
HK?&&A:# > q q >
HK?&&A75 q q q >
44. * q+ ’ 具有多态性位点 k/0N;/VS=DR0/RD# * >+ ’ 无多态性
*/I S^/0N;/VS=DR0/RD# * r+ ’ 无扩增 */G;S0DXDRGTD/I3
BCD>基因内 @@I位点在毛白杨及杨属内不同个体
间的等位变异
为了检测木材形成相关基因内开发的 &&A位
点在毛白杨及杨属内不同种间的等位变异!比较了
来源于基因内不同区域 &&A位点的多样性变异&
结果表明!源于基因启动子区域的 &&A位点无论在
毛白杨种内不同个体间还是在杨属内不同派间均显
示出较高的多样性等位变异& 图 # 显示了在毛白杨
纤维素合酶 ?+@)*3T 与 ?+@)*3V 基因启动子区域检
测到的 ,+与 ,O作为重复单元的 &&A位点多样
性& 在这 $ 个基因的启动子区域!,+与 ,O单元的
重复次数分别为 7 95! 次及 7 9#" 次!显示了启动
子区域 &&A位点在毛白杨种内具有广泛的遗传变
异# 而在杨属内不同种间也展示了较为广泛的等位
位点多样性!变异范围为 8 96 个!平均为 :15 个"表
!$& 与源于启动子区域的 &&A相比!位于 8hp+A的
位点则较为保守!变异幅度较低!如源于 ?+@)*3S 基
因 8hp+A以 ’+为重复单元的 &&A位点等位变异
程度较低!重复单元次数仅为 8 9: 次 "图 $$& 同
样!位于 8hp+A的 &&A位点在种间检测到的等位
变异多样性也较低!变异范围为 5 9! 个!平均为
515 个"表 !$&
BCO>基因内 @@I位点在杨属系统分类中的应用
基因内的 &&A由于其功能重要性!在进化过程
中!一般会受到较强烈的选择压!造成与物种的表型
性状紧密连锁& 因此!很有必要尝试开发这些基因
内 &&A位点在杨属不同派间分类中的应用& 为此!
随机选取了其中的 #% 个 &&A位点来检测杨属内不
同种间的遗传进化关系& 通过对 &&A电泳结果显
示!#8 份供试材料在 &&A水平上表现出明显的多态
性差异!且可很容易区分出不同派间的杨树个体&
如选用 HK?&&A#6 引物组合对供试材料进行的谱带
检测可明显区分出这 #8 个杨树个体!可将其分出 !
类!即青杨派"编号 # 9!$%白杨派"编号 8 9#%$%
黑杨派"编号 ## 9#5$及胡杨派树种"编号 #! 9
#8$"图 5$& 在此基础上!计算了个体间的遗传距离
及遗传相似系数& 杨属各派间遗传指数变化范围较
大!遗传相似系数为 %1"%" 5 9 %16"% 7!平均为
%1:75 !# 遗传距离为 %1#%% : 9%166$ 8!平均为
%188% :& 根据遗传距离矩阵!利用 *+&BSR$1#% 软
件进行 #8 个基因型个体的 pkO],聚类分析 "图
!$!聚类结果与电泳谱带显示的结果及常规分类一
致!即各派在杨属中是明显独立的!黑杨派%青杨派
及胡杨派亲缘关系较近!与白杨派亲缘关系较远&
54讨论
&&A作为一种分子标记技术!与其他标记如
A@-k%A,kK及 ,@-k等相比!具有多态性高%共显
性%K*,用量少%试验重复性好%结果可靠等优点!
现已被广泛应用于林木树种的遗传研究及分子标记
辅助早期选择育种"+EWdGI )+/%3! $%%!$& 因此!开
发树种特异的 &&A标记是进行该物种分子遗传学
及功能基因组学研究的基础!如利用 &&A标记进行
重要树种遗传多样性评价与核心种质构建%绘制指
纹图谱与种质鉴定%重要经济性状的基因定位与分
子标记辅助选择& 先前虽利用基因组插入文库筛选
法%微卫星富集法及数据库生物信息学搜索法开发
了一批 &&A标记 "BGW/U=G)+/%3! $%%7# BDI )+/%3!
$%%6$!但由于开发的这些 &&A位点多来自基因组
的随机区域!在应用 &&A标记辅助选择育种实践中
则经常会出现两方面的问题’ 一是随机区域特别是
基因间隔区虽可检测到较多的 &&A位点!但由于这
些区域的保守性较低!造成在一个物种中开发的
&&A标记很难延伸应用到近缘物种的遗传学研究
中# 另一问题是这些 &&A多呈中性进化!与物种表
型性状的形成连锁不太紧密!很难检测到与表型性
状显著连锁的 &&A位点".GWM;sJD)+/%3! $%%8$& 而
功能基因在进化过程中!一般会受到强烈的自然选
择!由于源于基因内的 &&A座位与基因一样也受到
$#
4第 ## 期 杜庆章等’ 毛白杨木材形成功能基因内 &&A标记的开发及评价
图 #4毛白杨不同个体间纤维素合酶基因启动子区域 &&A位点多样性
@DJ3#4&&AUD2MVWDTNYDT=DI SV/;/TMVVMJD/I /X?+@)*3JMIMWXV/;UDXMVMITDIUD2DUEG0WDI ?I+$=)0+$*/
,’ 毛白杨 ?+@)*3T4@)*3T /X?3+$=)0+$*/# C’ 毛白杨 ?+@)*3V4@)*3V /X?3+$=)0+$*/3
了强烈的选择压!结果造成基因内的 &&A多态性位
点经常会与物种的表型性状的形成紧密连锁"-D)+
/%3! $%%!$& 若 &&AW发生在基因的编码区!就可能
导致产生新的蛋白质和 ;A*,的结构折叠!造成质
量上的不同# 若位于调控区或内含子区!就可能影
响基因表达水平%A*,的稳定性而导致数量上的变
化"-D)+/%3! $%%!$& 因此!开发功能基因内 &&A位
点并分析其多态性!是利用该标记技术进行重要经
济性状分子标记辅助育种的前提& 为此!检测木材
形成功能基因内的 &&A多态性位点!开发与木材纤
维性状显著连锁的 &&A标记是加速杨树生物质能
源树种改良及纸浆材林建设的分子遗传学基础&
围绕上述目的!本文首次将在杨树主干维管组
织差异表达的 #" 个 )&+W作为候选基因!直接分析
这些基因的启动子% 8hp+A%外显子%内含子及
5hp+A区域在毛白杨自然群体中的多态性来开发
5#
林 业 科 学 !" 卷4
图 $4毛白杨不同个体间 ?+@)*3S 基因 8hp+A区域 &&A位点多样性
@DJ3$4&&AUD2MVWDTNYDT=DI 8hp+AVMJD/I /X?+@)*3S XV/;UDXMVMITDIUD2DUEG0WDI ?3+$=)0+$*/
图 54HK?&&A#6 引物组合对 #8 份杨属种间材料的 &&A位点
@DJ354+=MG;S0DXDMU &&A0/RD/X#8 DITMV^WSMRDXDRDIUD2DUEG0WEIUMV?$25%5*ZNHK?&&A#6
]’ 标准 K*,分子量 " Sp’#6iH*2($ &TGIUGVU K*,0GUUMV" Sp’#6iH*2($ # #’ 大青杨 ?I5**5(4)0*4*# $’ 小叶杨 ?I*4=$04# 5’ 香杨 ?I
*5/8)$%)0*# !’ 滇杨 ?I,500/0)0*4*# 8’ 毛白杨 ?I+$=)0+$*/# "’ 欧洲山杨 ?I+()=5%/# :’ 山杨 ?I1/8414/0/# 7’ 银白杨 ?I/%;/# 6’ 新疆杨 ?I
;$%)/0/# #%’ 河北杨 ?I#$2)4)0*4*# ##’ 美洲黑杨 ?I1)%+$41)*# #$’ 箭杆杨 ?I046(/ 2GV3+#)8)*+40/# #5’ 钻天杨 ?I046(/ 2GV34+/%4"/# #!’ 胡杨$
?I)52#(/+4"/ $# #8’ 胡杨%?I)52#(/+4"/%3
图 !4基于 &&A标记的杨属 #8 个不同种间个体的聚类分析
@DJ3!4’0EWTMVGIG0NWDW/X#8 DITMV^WSMRDXDRDIUD2DUEG0WEIUMV?$25%5*EWDIJ&&A;GVdMVW
!#
4第 ## 期 杜庆章等’ 毛白杨木材形成功能基因内 &&A标记的开发及评价
树木功能基因内的 &&A标记& 通过该策略分析了
覆盖杨树基因组长度为:6 58! ZS的基因序列!检测
到了 $% 个多态性 &&A位点"表 5$& 与先前在青杨
派树种毛果杨 "?I+(4"#$"/(2/$中开发的 &&A标记
"+EWdGI )+/%3! $%%!# BDI )+/%3! $%%6$相比!具有明
显的优点’ 一是本文报道的是多态性的 &&A位点!
而在毛果杨中是基于 # 个基因型个体检测到具有简
单序列重复的 &&A位点!在不同基因型个体中不一
定具有多态性 "+EWdGI )+/%3! $%%!# BDI )+/%3!
$%%6$& 二是基因内开发的 &&A标记能够扩展应用
到同一属内不同亚属甚至同一科内& 本文开发的
&&A标记中!#%%a能够在同一派内不同树种中有效
扩增!6%a的标记能够在同一属内不同种间进行有
效扩增!而 :8a以上的标记能够延伸到同一科的柳
属树种中得到扩增# 而在毛果杨中开发的 &&A标记
能够在美洲山杨"?3+()=5%$41)*$中得到扩增的不足
7%a"BDI )+/%3! $%%6$& 由于基因内开发的 &&A标
记能够在同一属内不同种间得到有效扩增!因此应
用基因内的 &&A标记位点可在分子水平上将杨属 !
个派内的个体明显区分!分析不同派间及派内个体
的遗传距离 "图 !$& 虽然目前基于表达序列标签
"M_SVMWWMU WMQEMIRMTGJ! )&+$开发的 &&A标记在群
体遗传学及标记辅助选择育种研究中也显示了强有
力的生命力!但也存在明显的不足之处!如真核生物
基因内一般会存在一个至多个内含子!基于 )&+开
发的引物对经常会落在内含子与外显子的剪切位点
而不能得到扩增!在数据分析时被误认为是零等位
"IE0G0M0M$!结果造成错误的结论 ")0DW)+/%I!
$%%:$& 因此!究竟选用具有何种特点的 &&A标记!
则需要依据研究项目的需求!选用合适的 &&A标记
位点& 如若要进行群体遗传结构及父本分析!建议
选用源于基因组随机区域的 &&A位点# 若要进行分
子标记辅助选择育种则选用基于基因内的 &&A标
记较为理想&
参 考 文 献
徐煲铧!杨晓慧!李百炼!等3$%%63毛白杨纤维素合酶基因 ?+@)*3T
的克隆%表达及单核苷酸多态性分析3林业科学!!8 " 8 $ ’ #
>#%3
CV/YI O A! CGWW/IDK -! OD0Ok! )+/%3$%%53(UMITDXDRGTD/I /X
QEGITDTGTD2MTVGDT0/RDDIX0EMIRDIJY//U SV/SMVTNTVGDTWDI 0/Z0/0NSDIM
" ?405*+/)1/ -3$ $3 ?+- 2MVDXDRGTD/I GIU RGIUDUGTMJMIM
;GSSDIJ3OMIMTDRW! #"!"!$ ’ #85: >#8!"3
KM;DVZGW,3$%%83CD/MT=GI/0XV/; RM0E0/WDR;GTMVDG0W’ GVMIMYGZ0M
;/T/VXEM0XV/;ZD/;GWW3)IMVJN&/EVRMW! $:"!$ ’ 5$: >55:3
)0DW\A! CEVdM\]3$%%:3)&+^&&AWGWGVMW/EVRMX/VS/SE0GTD/I
JMIMTDRGIG0NWMW3FMVMUDTN! 66"$$ ’ #$8 >#5$3
-D[! LMIJ\l! ’=GSS0M’0DIT3$%%73(;SV/2M;MIT/XZD/;GWWT=V/EJ=
0DJIDI ;/UDXDRGTD/I3+=Mk0GIT\/EVIG0! 8!"!$ ’ 8"6 >87#3
-DB’! l/V/0,C! @G=D;G+3$%%!3]DRV/WGTM0DTMWYDT=DI JMIMW’
WTVERTEVM! XEIRTD/I! GIU M2/0ETD/I3]/0CD/0)2/0! $# " " $ ’ 66#
>#%%:3
+D_DMV] F! &/EVUD0Mk! -MV/Nk! )+/%3#66:3KMTMRTD/I /XY=MGT
;DRV/WGTM0DTMWEWDIJGI/I V^GUD/GRTD2MWD02MVIDTVGTMWTGDIDIJ;MT=/U3
\OMIMTCVMMU! 8#’ #:8 >#::3
+EWdGI O ,! OEITMV- )! BGIJH l3$%%!3’=GVGRTMVD‘GTD/I /X
;DRV/WGTM0DTMW VM2MG0MU ZN JMI/;DR WMQEMIRDIJ /X ?$25%5*
+(4"#$"/(2/3’GI \@/VAMW! 5!"#$ ’ 78 >653
.GWM;sJD,! *D0WW/I \! kVD;;MV’A3$%%83)_SVMWWMU WMQEMIRMTGJ^
0DIdMU ;DRV/WGTM0DTMWGWGW/EVRM/XJMIM^GWW/RDGTMU S/0N;/VS=DW;W
X/VUMTMRTDIJWDJIGTEVMW/XUD2MVJMITWM0MRTD/I DI GT0GITDRWG0;/I
" !/%=$*/%/(-3$3]/0CD/0)2/0! $$"!$ ’ #%": >#%:"3
BGW/U=GA! &E;GT=DA! ’=M‘=DGI k! )+/%3 $%%73 )ERG0NSTEW
;DRV/WGTM0DTMW;DIMU 40 *4%4"$’ WEV2MNGIU M2G0EGTD/I3\OMIMT! 7:
"#$ ! $# >$83
BDI +/IJ;DIJ! H=GIJ[DINM! OEITMV-)! )+/%3$%%63]DRV/WGTM0DTM
SVD;MVVMW/EVRMX/V?$25%5*UM2M0/SMU XV/; T=M;GSSMU WMQEMIRM
WRGX/0UW/XT=M*DWQEG0N^# JMI/;M3*MYk=NT/0/JDWT! #7#"$$ ’ !67
>8%53
H=GIJKMQDGIJ! H=GIJH=DND! BGIJlGD3$%%"3?+-GIG0NWDW/XJV/YT=
GIU Y//U R=M;DRG0R/ITMITTVGDTWDI GI DITMVWSMRDXDRZGRdRV/WWXG;D0N
/XY=DTMS/S0GV" ?$25%5*+$=)0+$*/ m ?3;$%)/0/ $ m ?3
+$=)0+$*/3’GI \@/VAMW! 5""7$ ’ $%#8 >$%$53
!责任编辑4徐4红"
8#