全 文 ：第 49 卷 第 12 期
2 0 1 3 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 12
Dec．，2 0 1 3
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20131214
收稿日期: 2012 － 11 － 01; 修回日期: 2013 － 10 － 05。
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2010B012) ; 农业部公益性行业科研专项(201203030)。
钾胁迫条件下 Ca2 + 信号抑制剂对外生
菌根真菌分泌 H + 的影响
郭 涛1，2 戴景程1 朱 敏1
(1. 西南大学资源环境学院 重庆 400716; 2. 国家紫色土土壤肥力与肥料效益监测基地 重庆 400716)
摘 要: 为了研究钾胁迫条件下外生菌根真菌分泌 H + 的调控机制，以从强酸性森林土壤中分离获得的菌株褐
环乳牛肝菌(Sl01)、牛肝菌(Bo08)以及土生空团菌(CgSIV)为材料，采用液体培养方法，研究低钾胁迫下外生菌根
真菌的生长与 H +分泌的关系，以及 Ca2 +信号抑制剂对 H +分泌的影响。结果表明:在正常供钾条件下，3 种菌株的
生长与 H +的分泌未受到 Ca2 +信号抑制剂的显著影响; 而在低钾条件下，Ca2 + 信号抑制剂三氟拉嗪( TFP)和钙离
子螯合剂 EGTA 都显著减少菌株 Bo08 和 Sl01 的 H +分泌，即在此试验条件下，Bo15 和 Sl08 的 H +分泌均受到 Ca2 +
信号转导的调控，说明在低钾胁迫条件下，Ca2 +信号是介导外生菌根真菌分泌 H +的信号因子。
关键词: 钾; 钙调蛋白抑制剂; 外生菌根真菌
中图分类号: S718. 81 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)12 － 0097 － 04
Effects of Ca2 + Signal Inhibitors on H + Effluxes by
Ectomycorrhizal Fungi under Potassium Stress
Guo Tao1，2 Dai Jingcheng1 Zhu Min1
(1. College of Resources and Environment，Southwest University Chongqing 400716;
2. National Monitoring Base for Purple Soil Fertility and Fertilizer Efficiency Chongqing 400716)
Abstract: In this study，Suillus luteus ( Sl01 ) and Boletus sp． ( Bo08 )，isolated from the acidic forest soil，and
Cenococcum geophilum ( CgSIV) were cultured in liquid media with various potassium concentrations and Ca2 + signal
inhibitors to investigate mechanism of H + effluxes by ectomycorrhizal fungi ( ECMF) under low potassium stress． The
results showed that in normal potassium concentration，H + effluxes by ectomycorrhizal fungi of the three isolates were not
inhibited by trifluoperazine (TFP) and ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) ． In low potassium concentration，the H +
efflux by Bo08 and Sl01 was decreased significantly in the presence of TFP and EGTA． The results suggested that Ca2 +
would be a signal factor that could regulate H + efflux by Bo08 and Sl01 in this experiment conditions of low potassium
stress on the fungi．
Key words: potassium; Ca2 + signal inhibitors; ECMF
钾是树木需要量最多的必需营养元素之一。森
林通常不施肥，主要依靠树木的根系吸收土壤环境
中的钾来满足自身营养的生理需要。外生菌根真菌
(ECMF)感染树木根系后形成共生体 － 外生菌根
(ECM)，分泌 H + (Yuan et al．，2005)不仅能够吸收
土壤中的有效钾，也能利用土壤中的无效钾，如非膨
胀性 2 ∶ 1型矿物的层间钾和晶格钾 ( Yuan et al．，
2004)，从而改善宿主植物生长的钾营养状况，促进
林木的生长。
Ca2 + 作为重要的第二信使，调控细胞生命活
动，几乎所有的胞外刺激都能引起细胞内游离 Ca2 +
浓度的改变 ( Reddy et al．，2004 )。小麦 ( Triticum
aestivum)和玉米(Zea mays)等根系通过根尖细胞质
膜上的阴离子通道分泌有机酸，位于质膜的信号转
导串联体参与阴离子通道的激活与抑制(Ma et al．，
2001; Ryan et al．，1997)。唐新莲等(2008)研究表
明: 在黑麦草(Secale cereale)根尖胞质中，游离 Ca2 +
可能是铝诱导根系分泌柠檬酸和苹果酸的胞内信号
林 业 科 学 49 卷
因子。在欧洲强酸性土壤中，在 ECMF 共生的树木
根际土壤中可检测到高达1 000 μmol·L － 1的有机酸
( van Heesa et al．，2003)。在纯培养条件下，缺钾刺
激 ECMF 分泌 H +，分泌量是对照的 13 ～ 28 倍(袁
玲等，2001)。
在低钾胁迫条件下，外生菌根真菌分泌 H + 的
速率提高，从信号转导的角度出发 Ca2 +是否参与了
低钾诱导的 H + 分泌，目前尚无这方面的报道。本
试验设置了不同的钾处理条件，利用 Ca2 +螯合剂和
钙调蛋白抑制剂等研究 ECMF 分泌 H + 的信号转
导，旨在探明低钾胁迫条件下 ECMF 胞内 Ca2 +信号
对 H +分泌的调控作用。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
从重庆市金佛山国家级自然保护区马尾松
(Pinus massoniana)强酸性森林土壤 ( pH≤4. 5)中
分离获得褐环乳牛肝菌(Suillus luteus) ( Sl01)、牛肝
菌( Boletus sp． ) ( Bo08 )，以及采自西班牙火炬松
(Pinus teada)森林土壤的土生空团菌 ( Cenococcum
geophilum)(CgSIV)为供试菌种。
1. 2 试验设计
取上述菌种原始菌株，接种于 Pachlewski 固体
培养基上。培养基的组成为: 0. 5 g·L － 1酒石酸铵、
1. 0 g·L － 1磷酸二氢钾、0. 5 g·L － 1硫酸镁、20 g·L － 1
葡萄糖、0. 1 g·L － 1维生素 B1、20 g·L － 1琼脂和 1
mL·L － 1微量元素混合液［内含 8. 45 mg H3BO3，5 mg
MnSO4，6 mg FeSO4，0. 625 mg CuSO4，2. 77 mg ZnCl2
和 0. 27 mg(NH4 ) 2MoO4］。用 1. 0 g·L
－ 1磷酸二氢
钠代替 Pachlewski 液体培养基中的磷酸二氢钾，分
别加入 0. 13 g·L － 1(低钾)、0. 65 g·L － 1 (高钾)形成
低钾和正常钾 2 种处理(袁玲等，2001)，培养 21 天
后加入 0. 1 mol·L － 1 CaCl2 溶液 1 mL 预处理 24 h。
过滤收集菌丝后重新培养于含有不同类型、不同浓
度 Ca2 +信号抑制剂的 Pachlewski 液体培养基中，其
中，Ca2 +信号抑制剂的种类和浓度选择依据文献
(王明霞等，2012; 唐新莲等，2008)，具体设置如
下: 1)钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪( TFP): 0，25，100
μmol·L － 1; 2)Ca2 +螯合剂乙二醇双(2 －氨基乙基)
四乙酸(EGTA): 0，0. 25，1. 0 mmol·L － 1。培养 48 h
后测定其生物量、氮磷钾含量和草酸分泌量。每个
设置 5 次重复。
1. 3 测定项目与方法
采用 80 ℃烘干称重法测定菌根真菌的生物量;
外生菌根真菌经 H2SO4-H2O2 消化后得到消化液，
并分别采用纳氏试剂比色法、钒钼黄比色法、火焰光
度法测定外生菌根真菌菌丝的氮、磷、钾含量(鲍士
旦，2000 )。用 pH 电位计测定培养液中的 H +
浓度。
2 结果与分析
2. 1 低钾条件下钙调蛋白 TFP 对外生菌根真菌生
长的影响
同一钾浓度条件下不同菌种之间的生物量差异
显著，表现为 Bo08 ＞ Sl01 ＞ CgSIV。培养液中钾离
子浓度明显影响了菌丝真菌的生长状况(表 1)，低
钾处理时 3 种菌株的生物量都明显低于正常钾时的
生物量，例如未添加 TFP 时，菌株 CgSIV 的生物量
减少 了 49. 93%，Bo08 的 菌 丝 生 物 量 减 少 了
40. 48%，表现为前者的耐低钾胁迫能力要低于后
者。但不同浓度的 TFP 对真菌的生物量没有明显
的影响。
表 1 不同钾条件下 TFP 对外生菌根真菌生物量的影响①
Tab. 1 The dry weight of ectomycorrhizal hyphae under
different potassium and TFP treatments
mg·g － 1 DW
钾处理
Potassium
treatment
菌株
Fungal
strains
生物量 Dry weight
0
μmol·L － 1
25
μmol·L － 1
100
μmol·L － 1
正常钾
Bo08 69. 17a 62. 36a 68. 20a
Normal potassium
CgSIV 20. 43d 19. 47d 20. 93d
Sl01 29. 17bc 30. 03bc 29. 00bc
低钾
Bo08 41. 17b 39. 70b 38. 75bc
Low potassium
CgSIV 10. 23de 9. 87e 8. 67e
Sl01 15. 50d 15. 20d 15. 56d
① 不同字母表示处理间差异达到 5% 的显著水平，下同。
Different letters mean significantly different in different treatments at 5%
level． The same below．
2. 2 低钾条件下 TFP 对外生菌根真菌氮、磷、钾含
量的影响
2. 2. 1 氮含量 不同菌株之间的菌丝氮含量差异
较大(表 2)，表现为菌株 CgSIV 显著低于其他 2 个
菌株。低钾胁迫显著影响菌丝真菌的含氮量，菌株
Bo08 和 CgSIV 在正常钾时显著高于低钾时的氮含
量，说明钾可以提高部分菌丝真菌的氮含量，促进氮
素的吸收，而菌株 Sl01 在不同钾离子浓度下菌丝真
菌氮含量差异不显著。而对于不同浓度 TFP 处理，
在正常供钾处理时，每一个菌种的氮含量差异不显
著，但是对于低钾培养的 CgSIV 而言，在高浓度 TFP
处理后，其菌丝氮含量明显降低。
2. 2. 2 磷含量 不同菌株之间的菌丝磷含量差异
较大(表 2)，表现为菌株 CgSIV 显著低于其他 2 个菌
89
第 12 期 郭 涛等: 钾胁迫条件下 Ca2 +信号抑制剂对外生菌根真菌分泌 H +的影响
株，但 TFP 阻断剂处理未显著影响菌丝的磷含量。
2. 2. 3 钾含量 Bo08 的钾含量明显高于其他 2 个
菌株(表 2)，即钾含量的大小顺序为 Bo08 ＞ Sl01 ＞
CgSIV。Bo08 和 Sl01 在正常钾处理时钾含量显著
高于低钾处理时，而 TFP 处理整体上对菌丝真菌钾
含量的影响差异不显著。
表 2 不同钾条件下不同浓度 TFP 处理对外生菌根真菌菌丝氮、磷、钾含量的影响
Tab. 2 The content of nitrogen，phosphorus and potassium in ectomycorrhizal fungi
under different potassium and TFP treatments mg·g － 1 DW
钾处理
Potassium
treatment
菌株
Fungal
strains
氮含量 N content 磷含量 P content 钾含量 K content
0
μmol·L － 1
25
μmol·L － 1
100
μmol·L － 1
0
μmol·L － 1
25
μmol·L － 1
100
μmol·L － 1
0
μmol·L － 1
25
μmol·L － 1
100
μmol·L － 1
正常钾 Normal
Bo08 25. 53a 23. 29ab 24. 20a 25. 53a 23. 29ab 24. 20 ab 22. 50a 19. 73b 21. 49ab
potassium
CgSIV 14. 71c 14. 93c 16. 04c 14. 71c 14. 93c 16. 04c 3. 84e 3. 74e 3. 00e
Sl01 23. 25ab 23. 76ab 22. 87ab 23. 25ab 23. 76ab 23. 87ab 10. 21d 8. 86d 10. 50d
低钾 Low
Bo08 19. 24bc 19. 43bc 17. 40c 19. 24b 19. 43b 17. 40b 16. 21c 15. 10c 14. 67c
potassium
CgSIV 11. 35d 9. 08de 8. 08e 11. 35c 9. 08c 8. 08c 4. 82e 4. 00e 4. 01e
Sl01 22. 63ab 19. 57bc 21. 10b 22. 63ab 19. 57ab 21. 10 ab 4. 34e 4. 56e 4. 67e
2. 3 不同供钾条件下 TFP 对外生菌根真菌分泌
H +作用的影响
总体上不同菌株 H +分泌的作用差异显著，Sl01
＞ Bo08 ＞ cgSIV 表 3。相对于正常供钾水平，低钾处
理都显著促进了各个菌株的 H + 的产生，其中菌株
cgSIV 在没有添加 TFP 时，H +增加了 99. 11%。
表 3 不同钾条件下 TFP 对外生菌根真菌
分泌 H +作用的影响
Tab. 3 The effect of different potassium and TFP on
H + efflux by ectomycorrhizal fungi
μmol·g － 1 DW
钾处理
Potassium
treatment
菌株
Fungal strains
H + 产量 H + production
0
μmol·L － 1
25
μmol·L － 1
100
μmol·L － 1
正常钾
Bo08 27. 70f 27. 23f 24. 62f
Normal potassium
CgSIV 6. 80gh 6. 85gh 5. 85h
Sl01 59. 54cd 50. 28d 50. 62d
低钾
Bo08 40. 43e 35. 63e 28. 43f
Low potassium
CgSIV 13. 54g 10. 36gh 9. 90gh
Sl01 76. 40a 68. 45b 63. 59bc
在正常供钾条件下，TFP 处理对 3 种菌株产生
H +的影响差异不显著; 而在低钾条件下，菌株 Sl01
和菌株 Bo08 的 H + 的分泌随着 TFP 浓度的增加而
显著降低，与不添加 TFP 的处理相比，在 25，100
μmol·L － 1处理时 Bo08 分泌的 H +分别减少了 22%
和 30%，Sl01 分别减少了 10%和 17%，但 CgSIV 未
受到显著影响。
2. 4 不同供钾条件下 EGTA 对外生菌根真菌分泌
H +作用的影响
如表 4 所示，不同菌株分泌 H +作用对 EGTA 处
理的响应与对 TFP 的响应类似。在正常供钾条件
下，EGTA 处理对 3 种菌株产生 H +的影响差异不显
著; 而在低钾条件下，菌株 Sl01 和菌株 Bo08 的 H +
的分泌随着 TFP 浓度的增加而显著降低，与不添加
TFP 的处理相比，在25，100 μmol·L － 1处理时 Bo08
分泌的 H +分别减少了 13%和 31%，Sl01 分别减少
了 11%和 16%，但 CgSIV 未受到显著影响。
表 4 不同钾条件下 EGTA 对外生菌根真菌
分泌 H +作用的影响
Tab. 4 The effect of different potassium and EGTA
on H + efflux by ectomycorrhizal fungi
μmol·g － 1 DW
钾处理
Potassium
treatment
菌株
Fungal strains
H + 产量 H + production
0
μmol·L － 1
0. 25
μmol·L － 1
1. 0
μmol·L － 1
正常钾
Bo08 26. 30f 25. 57f 24. 63f
Normal potassium
CgSIV 7. 16gh 6. 96gh 5. 89h
Sl01 54. 94c 52. 16c 49. 16c
低钾
Bo08 39. 49de 34. 48ef 27. 19f
Low potassium
CgSIV 12. 82g 11. 42gh 10. 92gh
Sl01 71. 53a 64. 16b 60. 29b
3 结论与讨论
为了适应自然条件下的低钾环境，生物体一方
面直接分泌 H +，另一方面通过分泌有机酸再形成
H +，都可有效活化环境中的钾源; 前者的分泌量是
后者的 6 ～ 30 倍，因此理论上直接分泌 H + 在这方
面具有更重要的作用(袁玲等，2001)。
H +和 K +均属一价阳离子，但 H + 的离子半径
小于 K +，H +对层间钾具有较强的取代作用。对植
物来说，膨胀性 2∶ 1 型黏粒矿物的部分层间钾属于
缓效钾，非膨胀性 2 ∶ 1 型黏粒矿物的层间钾则更难
被吸收利用(Menge et al．，1993)。在无钾和低钾条
件下，菌根真菌能分泌较多的 H +，可能有利于黏粒
99
林 业 科 学 49 卷
矿物层间钾的释放，这是外生菌根真菌和外生菌根
活化土壤无效钾的机制之一(Yuan et al．，2004)，从
而提高钾的营养水平进而促进生长，在本研究中得
到了进一步的证实。
胞内游离 Ca2 +作为第二信使，直接或间接调节
多种生物学过程，包括细胞对逆境胁迫的响应，引发
与提高抗性有关的级联反应 (Reddy et al．，2004)。
用铝处理小麦和黑麦根尖，胞质内的游离 Ca2 +浓度
增加，胞质 Ca2 + 的增加部分来源于细胞外和细胞
内，进而激活小麦根尖细胞的阴离子通道使苹果酸
分泌量增加(Zhang et al．，2001)。胞内 Ca2 +介导铝
诱导黑麦根系分泌有机酸的胞内信号因子，而质膜
上的阴离子通道可能是铝诱导的 Ca2 + 信号转导途
径中的下游效应器(唐新莲等，2008)。目前，关于
ECMF 分泌草酸的调控机制已有部分研究(王明霞
等，2012; 唐新莲等，2008)，但是作为在低钾环境
下生物适应中具有更重要作用的分泌 H +的调控机
制研究甚少。本研究发现，在正常供钾条件下，3 株
供试 ECMF 的分泌作用均未响应 Ca +信号抑制剂，
说明在此试验条件下，ECMF 分泌 H +在钾正常供给
时，未启动钙参与诱导 H +分泌的信号转导，但在低
钾胁迫条件下，2 种 Ca2 + 信号抑制剂都不同程度地
显著减少了 H +的产生量，说明 Ca2 + 信号参与调控
了低钾诱导的 H + 分泌，这与铝胁迫下外生菌根真
菌分泌草酸(Wang et al．，2012)有相似的机制。
值得注意的是，供试菌株分泌 H + 对不同 Ca +
信号抑制剂的敏感性不同，Bo08 和 Sl01 对钙调蛋
白抑制剂 TFP 和 Ca2 + 螯合剂 EGTA 敏感，H + 分泌
降低; 但 EGTA 处理时菌株的 H + 分泌的减少量少
于 TFP 处理时，说明胞内 Ca2 +信号的形成与胞内钙
库关系密切(Wang et al．，2012)。而菌株 CgSIV 生
长较差，H +分泌量一直较少，且未受到钙调蛋白抑
制剂的显著抑制作用，这一方面说明了不同菌种之
间的生物多样性，另一方面需要选择适宜的菌种，促
进林木生长。
参 考 文 献
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(责任编辑 朱乾坤)
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