全 文 ：第 50 卷 第 3 期
2 0 1 4 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 3
Mar．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140304
收稿日期: 2013 － 05 － 09; 修回日期: 2013 － 05 － 20。
基金项目: “十二五”“863”计划“杨树分子育种与品种创制”(2011AA100201)。
* 卢孟柱为通讯作者。
毛白杨和烟草次生维管发育相关 NAC转录因子的比较*
郭 伟 卢孟柱
(中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 100091)
摘 要: 烟草具有典型的次生维管发育过程，与毛白杨在转录组水平上进行比较，有利于通过烟草来鉴定出次生
维管发育相关的关键基因。通过高通量测序技术获得烟草维管组织的转录组数据，将 NAC 转录因子基因通过
BLASTP 程序比对毛果杨基因组数据库，共得到 43 对 NAC 直系同源基因，并根据序列同源性将其分为 19 个亚组。
利用烟草和毛白杨的基因表达谱，分析 NAC 基因表达量变化，找到 13 对表达模式相似的烟草和毛白杨的同源基
因。选取 8 对 NAC 同源基因通过相对荧光定量 PCR 进行不同组织的表达分析，结果表明这 8 对 NAC 同源基因在
烟草和毛白杨中的表达模式非常相似。研究结果为利用烟草病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术研究 NAC 转录因
子，进而揭示杨树的维管发育相应基因的功能提供基础。
关键词: 烟草; 杨树; NAC; 维管发育
中图分类号: S 718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)03 － 0022 － 09
Comparison of NAC Transcription Factor Involved in Secondary
Vascular Development between Populus tomentosa and Tobacco
Guo Wei Lu Mengzhu
(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration
Research Insitute of Forestry，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091)
Abstract: Tobacco (Nicotiana tabacum) plants have typical secondary vascular development process． It is useful for
identifying key genes in the secondary vascular development based on the transcriptome comparison between tobacco and
Populus tomentosa． Totally 43 pairs of NAC orthologous genes were identified using BLASTP search in the entire Populus
trichocarpa genome sequence with NAC transcription factor genes identified in tobacco vascular tissue transcriptome
database as probe and were divided into 19 subgroup based on the sequence homology． The analyses of gene expression
levels obtained using RNA-seq in tobacco and P． tomentosa suggest that there are 13 pairs of NAC orthologous genes
sharing similar expression patterns in tobacco and P． tomentosa． Eight pairs of NAC orthologous genes were selected to
perform expression analysis using relative real time RT-PCR in different tissues of tobacco and P． tomentosa． The results
indicated that the 8 pairs of NAC orthologous genes shared similar expression patterns in tobacco and P． tomentosa． It is
suggested feasibility to study the functions of corresponding poplar genes through studying functions of tobacco NAC
transcription factor using tobacco VIGS system and the study provides the basic data for studying the vascular tissue
development regulation．
Key words: Nicotiana tabacum; Populus tomentosa; NAC; vascular development
木材是世界上最重要的天然资源之一，具有代
替化石资源的潜力( Plomion et al．，2001)。木材是
次生维管发育的产物，主要由具有次生细胞壁的纤
维和管状细胞组成( Plomion et al．，2001)。木材的
形成源于顶端分生组织及维管形成层细胞的连续分
裂与分化，是具有高度时空调控性的次生发育过程，
包括 6 个主要的生物学过程: 维管形成层母细胞的
分化、细胞分裂、细胞扩张、次生细胞壁的合成、细胞
程序化死亡 和 心材 形成 ( Groover et al．，2006;
Groover，2005; Plomion et al．，2001)。因此，研究木
材形成的分子机制对于丰富次生维管发育的理论基
础，了解木材形成的生物学基础，采用分子育种手段
第 3 期 郭 伟等: 毛白杨和烟草次生维管发育相关 NAC 转录因子的比较
定向培育材性优良的树木新品种具有重要价值。
木本植物的研究难度比较大，所以大多数研究
工作是在草本植物中开展的，导致林木木材形成的
调控机制研究仍然属于初始阶段。因此，对于木本
植物维管形成层的起始、维持及分化的分子决定机
制方面仍然需要大量的研究工作 ( Farrokhi et al．，
2006; Somerville，2006)。随着基因组学和功能基
因组学的飞速发展，研究人员在拟南芥( Arabidopsis
thaliana) ( Ehlting et al．，2005; Oh et al．，2003;
Zhao，2005 )、百日草 ( Zinnia elegans) ( Demura et
al．，2007)、毛白杨(Populus tomentosa) (Wang et al．，
2009 )、 毛 果 杨 ( Populus trichocarpa )
(Dharmawardhana et al．，2010)、杂交山杨 ( Populus
tremula × Populus tremuloides ) ( Hertzberg et al．，
2001)、刺槐 ( Robinia pseudoacacia ) ( Yang et al．，
2004)、海岸松(Pinus pinaster) (Paiva et al．，2008)、
冈尼桉(Eucalyptus gunnii) (Foucart et al．，2006)和
白云杉(Picea glauca) (Pavy et al．，2008)中进行了
维管发育的相关研究。杨树被证实是一种进行维管
发育研究的木本模式植物，其茎的生长具有典型的
次生维管发育特征(Robischon et al．，2011)。研究
人员利用 cDNA 基因芯片和蛋白表达谱等技术从杨
树维管发育过程中鉴定了大量的功能基因，迫切地
需要对它们进行功能分析 (Dharmawardhana et al．，
2010; Du et al．，2006; Wang et al．，2009)。其中，
NAC 转录因子是一类重要的参与木质部分化的调
控因子。
NAC(NAM，ATAF1 /2 和 CUC2)结构域蛋白家
族是最大的植物特异的转录因子家族( Fang et al．，
2008; Ooka et al．，2003)。NAC 蛋白通常在 N 末端
具有 1 个保守的 NAC 结构域，该结构域由 160 个被
划分为 5 个亚结构域的氨基酸残基组成(Kikuchi et
al．，2000; Ooka et al．，2003)。NAC 结构域中的 1 个
60 个氨基酸残基的序列区域包含 1 个特异的 TF 折
叠，由外部的螺旋元件和内部的扭曲折叠构成
(Duval et al．，2002)。NAC 结构域定位在细胞核，
能够结合 DNA，并且与其他 NAC 蛋白形成同源二
聚体或异源二聚体(Duval et al．，2002; Jensen et al．，
2010)。而 NAC 蛋白的 C 末端具有高度的特异性，
导致具有不同的转录调节活性(Zhong et al．，2010)。
研究发现 NAC 结构域蛋白在木质素形成、纤维素的
发育和维管植物木材形成中起到重要的作用
(Mitsuda et al．，2008; Zhao et al．，2008; Zhong et al．，
2010; 2008)。尽管对 NAC 转录因子基因的功能分
析取得了很多进展，但 NAC 基因家族庞大，大部分
成员功能仍然未知，特别是在杨树中进行功能分析
的 NAC 家族基因非常有限。缺乏高效的基因功能
鉴定手段是制约因素之一。
相对较大的体积和较慢的生长速度使得杨树在
研究基因的详细功能时存在困难，需要找到更容易
进行研究的模式植物。拟南芥虽然体积比较小、生
长速度比较快、遗传转化比较容易，但是却不具备典
型的次生生长特征，同时缺少某些木材形成的基因
和相关的生物学过程(Nieminen et al．，2004)。烟草
(Nicotiana tabacum)作为一种具有典型的次生维管
发育的一年生草本植物(Cook et al．，2012; Damiani
et al．，2005; Guillaumie et al．，2010)，具有较高的遗
传转化效率、较快的生长速度、较短的生命周期
(Al-Ahmad et al．，2004)，并且烟草的病毒诱导基因
沉默( virus induced gene silencing，VIGS)系统为研
究者进行大量的基因功能研究提供了平台 (Gossele
et al．，2002; Huang et al．，2011; Tao et al．，2004;
Zhu et al．，2010)。这一平台实际为大规模筛选、鉴
定相关基因提供了有效手段。
本文将烟草维管组织转录组数据中的 NAC 基
因与毛果杨基因组数据库进行比对，得到了 43 对直
系同源基因，通过基因表达谱测序(RNA-seq)和相
对荧光定量 PCR 对烟草和毛白杨 NAC 同源基因的
表达异同进行了分析，旨在进一步通过烟草 VIGS
系统进行杨树次生维管发育相关基因的功能研究，
揭示木材形成过程中 NAC 转录因子的调控机制。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
烟草(Nicotiana tabacum cv． SR1)和毛白杨为
中国林业科学研究院林业研究所生物技术室保存并
繁殖。植株种植在直径为 15 cm 的塑料花盆(内含
50%的营养土 + 50%的蛭石)中，置于温室中培养，
每隔 5 天用自来水浇 1 次。
分别选取生根期( rooting stage，4 片展开叶)、抽
薹期 ( stem bolting stage，6 片 展 开 叶 )、团 棵 期
( rosette stage，8 片展开 叶 )、旺 长 期 ( vigorously
growing stage，14 片 展 开 叶 ) 和 现 蕾 期 ( flower
budding stage，20 片展开叶)的烟草的第 1 － 4，1 －
6，1 － 8，1 － 8，1 － 8 节间进行取材，作为烟草转录组
高通量测序的试验材料。
分别对旺长期( vigorously growing stage，14 片展
开叶)的烟草和扦插 4 个月的毛白杨的顶端分生组
织、第 1 节间、第 2 节间、第 3 节间、第 4 节间、第 5
节间、第 6 节间、从顶端起第 5 片展开叶、根进行取
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林 业 科 学 50 卷
材，分别标记为 TS，TIN1，TIN2，TIN3，TIN4，TIN5，
TIN6，TL，TR 和 PS，PIN1，PIN2，PIN3，PIN4，PIN5，
PIN6，PL，PR，作为基因表达谱高通量测序和相对荧
光定量 PCR 的试验材料。
取材时间是 16:00—17:00。每个样本均为取
自 5 个植株的混合样本，液氮速冻后放置在 － 80 ℃
的超低温冰箱里储存。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 烟草转录组的高通量测序 选取生根期、抽
薹期、团棵期、旺长期和现蕾期的烟草的节间，用
Qiagen 的 RNA 提取试剂盒(RNeasy Plant Mini kit)
提取 RNA，用 Qiagen 的 RNase-free DNaseⅠ去除
DNA，通过 Agilent 2100 Bioanalyzer 对 RNA 样本进
行检测。 cDNA 文库构建、高通量测序 ( Illumina
HiSeqTM 2000)和数据处理由华大基因公司完成，通
过 SOAPdenovo 软件对 short reads 进行组装。
1. 2. 2 烟草与毛白杨之间的 NAC 直系同源基因的
鉴定 通过基因注释与 NAC 保守基序进行本地
BLASTP 搜索相结合的方法在烟草维管发育的转录
组数据库中对 NAC 基因进行 搜索，然后通过
BLASTX 程序(E-value≤1e － 10)比对烟草基因组数
据库(http:∥ solgenomics． net /，v0. 4. 4)得到全长蛋
白序列，然后通过 BLASTP 程序(E-value≤1e － 10)
比对毛果杨基因组数据库( http:∥www． phytozome．
net /，版本 v3. 0)。
1. 2. 3 基因表达谱(RNA-seq)高通量测序 选取
烟草的 3 个样本 ( TIN1，TIN2，TIN3)和毛白杨的 3
个样本 ( PIN1，PIN2，PIN3)，RNA 提取、RNA 检测、
cDNA 文库构建、高通量测序方法同 1. 2. 1。基因表
达水平(RPKM) 的归一化计算通过 ERANGE 软件
(http:∥woldlab． caltech． edu / gitweb /，版本 4. 0)完
成(Mortazavi et al．，2008)。
1. 2. 4 相对荧光定量 PCR 表达分析 提取烟草和
毛白杨不同组织样本 ( TS，TIN1，TIN2，TIN3，TIN4，
TIN5，TIN6，TL，TR 和 PS，PIN1，PIN2，PIN3，PIN4，
PIN5，PIN6，PL，PR) 的 RNA，并且进行 DNA 去除
(同上)，取 800 ng RNA 为模板，用 Invitrogen 的反转
录 试 剂 盒 ( Superscript Ⅲ First-Strand Synthesis
System)进行 cDNA 的合成，并且稀释 20 倍作为荧
光定量 PCR 反应的模板。
反应在 ABI 7500 实时定量 PCR 仪上进行，方
法参照《美国应用生物系统公司 7300 /7500 实时定
量 PCR 仪相对定量实验入门指南》和荧光定量试剂
盒 SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)说明书。反应
体系为: 2 μL cDNA，10 μL 2 SYBR Premix Ex
TaqⅡ(Tli RnaseH Plus)，0. 4 μL 50 ROX Reference
DyeⅡ，上下游特异引物(表 1)各 0. 8 μL，双蒸水
6 μL。采用两步法标准反应程序: 1)95 ℃ 30 s; 2)
95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。每个试验设 4 次重
复，选取 NtEF-1α (Accession number: AF120093) and
PtUBQ (Accession number: BU879229)分别作为烟
草和毛白杨的内参基因。利用 Sequence Detection
Software 软件 ( 2 － ΔΔ C t 法 ) ( Livak et al．，2001 ) 和
SigmaPlot 12. 0 软件进行数据分析。
表 1 荧光定量 PCR 的引物序列
Tab． 1 Primer sequences for real-time PCR
基因名称 Gene name 引物序列(正向 /反向) Primer sequences ( forward / reverse)
NtEF-1α TGAGATGCACCACGAAGCTC / CCAACATTGTCACCAGGAAGTG
NtNAC056 GAGCGGCAACTTCTGGTTACTG / TTGACACCCACTTTTTGAGTTCC
NtNAC073-1 TGGCACAAAACAGGCAAGACTA / CTCAGGTTTTCTTTGCTTTCCA
NtNAC073-2 AAGGATGGTCAAGTGCGTCATT / GCCATCTTGTTTCTCCACCATC
NtNAC074-2 GCAACTTTGCCACCAGGATTTA / GTTGCCATGGCTCACAAGTATG
NtNAC040 TGCTGTAAATGATGGCCGTA / ACGGCGGTATACCCATCTGT
NtNAC043-2 GAAGGTTGGGTTGTTTGTCG / TCTGAAATTGAGGGATTGACCA
NtNAC062 TGCTGTAAATGATGGCCGTA / ACGGCGGTATACCCATCTGT
NtNAC100-2 CTGCCCAGAATGAATGTGTG / TTTGAGGACCGTGGACTTTC
PtUBQ GTTGATTTTTGCTGGGAAGC / GATCTTGGCCTTCACGTTGT
PtNAC056 TGCCACTCAATGCAACATTT / GGAGTGGCGAATTTGAGAAA
PtNAC073-1 ATGTGGGCACCAAATCAAAT / CTTCACCTTCCCCTCCAAAT
PtNAC073-2 TTTTGTCGCTGCAAAAACAG / CCGTCGGATCAAACTTCACT
PtNAC074-2 GAGCTCCCAATGGAATCAAA / CACAACACCCAGTCCTCCTT
PtNAC040 TGAAAGGCATTTGTCAACCA / CACAGCTCTTGGAGCATTCA
PtNAC043-2 GGAAGGACTTGCAAGATGGA / CTTTCATGGAGCCCATCACT
PtNAC062 CGGATGCCGATACTTCTGAT / TCTCGTGTGGGATTGTTGAA
PtNAC100-2 GAAACCCCATGAAACCATTG / CAGAACTGAGGAAGGGGACA
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第 3 期 郭 伟等: 毛白杨和烟草次生维管发育相关 NAC 转录因子的比较
2 结果与分析
2. 1 烟草和毛白杨 NAC 基因家族同源基因的鉴定
烟草维管组织转录组测序产生了 51 Mb 的 short
reads 和 4. 6 Gb 的核苷酸数据，通过 SOAPdenovo 组
装得到了 170 321 条 unigene(另文发表)。通过基因
注释与 NAC 保守基序进行本地 BLASTP 搜索相结合
的方法在烟草维管组织转录组数据库中鉴定到了 43
个 NAC 转录因子家族成员基因。然后将烟草的 NAC
基因的蛋白序列作为探针在毛果杨基因组数据库中
进行 BLASTP 搜索，选择比对结果中分值(Score)最
高并且 E-value ＜ e － 10 的序列作为烟草 NAC 基因在
毛白杨中的直系同源基因(表 2)，并且根据所对应的
拟南芥的基因名称对烟草和毛白杨基因进行命名。
表 2 烟草和毛白杨木材形成相关的直系同源 NAC 基因①
Tab． 2 Wood formation related NAC orthologous gene relationships between tobacco and Populus tomentosa
序号
No．
毛白杨基因名称
Populus tomentosa
gene name
毛果杨基因编号
Populus trichocarpa
gene locus
烟草基因名称
Tobacco gene name
烟草基因编号
Tobacco gene locus
基因描述
Gene description
1 PtNAC002-1 Potri． 002G081000. 1 NtNAC002-1 NbS00006384g0013. 1 ANAC002，ATAF1
2 PtNAC002-2 Potri． 002G081000. 3 NtNAC002-2 NbS00045974g0003. 1 ANAC002，ATAF1
3 PtNAC002-3 Potri． 007G099400. 1 NtNAC002-3 NbS00019367g0016. 1 ANAC002，ATAF1
4 PtNAC007-1 Potri． 001G120000. 1 NtNAC007-1 NbS00017371g0006. 1 ANAC007，VND4
5 PtNAC007-2 Potri． 012G126500. 1 NtNAC007-2 NbS00009418g0015. 1 ANAC007，VND4
6 PtNAC007-3 Potri． 015G127400. 2 NtNAC007-3 NbS00004566g0116. 1 ANAC007，VND4
7 PtNAC008-1 Potri． 001G343800. 2 NtNAC008-1 NbS00012769g0008. 1 ANAC008，SOG1
8 PtNAC008-2 Potri． 010G129700. 2 NtNAC008-2 NbS00017980g0006. 1 ANAC008，SOG1
9 PtNAC017 Potri． 005G200100. 1 NtNAC017 NbS00025319g0006. 1 ANAC017，NAC017
10 PtNAC021 Potri． 007G065400. 2 NtNAC021 NbS00003767g0007. 1 ANAC021，NAC1
11 PtNAC028-1 Potri． 004G081000. 1 NtNAC028-1 NbS00026999g0005. 1 ANAC028，NAC028
12 PtNAC028-2 Potri． 014G041300. 3 NtNAC028-2 NbS00007748g0002. 1 ANAC028，NAC028
13 PtNAC029 Potri． 008G089000. 1 NtNAC029 NbS00023955g0006. 1 ANAC029，ATNAP
14 PtNAC034 Potri． 004G230800. 2 NtNAC034 NbS00032088g0003. 1 ANAC034，ANAC035
15 PtNAC036 Potri． 004G181900. 1 NtNAC036 NbS00023821g0012. 1 ANAC036，NAC036
16 PtNAC037 Potri． 007G014400. 1 NtNAC037 NbS00035413g0002. 1 ANAC037，VND1
17 PtNAC040 Potri． 009G161300. 1 NtNAC040 NbS00023153g0005. 1 ANAC040，NTL8
18 PtNAC043-1 Potri． 002G178700. 2 NtNAC043-1 NbS00001656g0001. 1 ANAC043，NST1
19 PtNAC043-2 Potri． 001G448400. 1 NtNAC043-2 NbS00005773g0212. 1 ANAC043，NST1
20 PtNAC050 Potri． 010G229700. 1 NtNAC050 NbS00002392g0011. 1 ANAC050，NAC050
21 PtNAC056 Potri． 011G123500. 1 NtNAC056 NbS00029705g0011. 1 ANAC056，NAC2
22 PtNAC057 Potri． 015G030200. 1 NtNAC057 NbS00024483g0014. 1 ANAC057，NAC057
23 PtNAC062 Potri． 015G004100. 1 NtNAC062 NbS00058586g0005. 1 ANAC062，NAC062
24 PtNAC072 Potri． 011G123300. 1 NtNAC072 NbS00003711g0003. 1 ANAC072，RD26
25 PtNAC073-1 Potri． 017G016700. 1 NtNAC073-1 NbS00040775g0003. 1 ANAC073，SND2
26 PtNAC073-2 Potri． 004G049300. 1 NtNAC073-2 NbS00005607g0013. 1 ANAC073，SND2
27 PtNAC074-1 Potri． 002G037100. 1 NtNAC074-1 NbS00028280g0004. 1 ANAC074，NAC074
28 PtNAC074-2 Potri． 005G225800. 1 NtNAC074-2 NbS00012650g0016. 1 ANAC074，NAC074
29 PtNAC075-1 Potri． 006G152700. 1 NtNAC075-1 NbS00017455g0012. 1 ANAC075，NAC075
30 PtNAC075-2 Potri． 006G152700. 4 NtNAC075-2 NbS00006659g0007. 1 ANAC075，NAC075
31 PtNAC078-1 Potri． 008G031800. 2 NtNAC078-1 NbS00000666g0007. 1 ANAC078，NAC2
32 PtNAC078-2 Potri． 010G229900. 3 NtNAC078-2 NbC25816882g0004. 1 ANAC078，NAC2
33 PtNAC082-1 Potri． 007G109100. 1 NtNAC082-1 NbS00033381g0004. 1 ANAC082，NAC082
34 PtNAC082-2 Potri． 007G109100. 3 NtNAC082-2 NbS00051560g0014. 1 ANAC082，NAC082
35 PtNAC083-1 Potri． 003G166500. 1 NtNAC083-1 NbS00000575g0010. 1 ANAC083，NAC083
36 PtNAC083-2 Potri． 001G061200. 1 NtNAC083-2 NbS00025931g0004. 1 ANAC083，NAC083
37 PtNAC087 Potri． 019G031600. 1 NtNAC087 NbS00059007g0009. 1 ANAC087
38 PtNAC090 Potri． 006G209200. 1 NtNAC090 NbS00031626g0010. 1 ANAC090，NAC090
39 PtNAC094 Potri． 017G082000. 1 NtNAC094 NbS00014666g0007. 1 ANAC094，NAC094
40 PtNAC096 Potri． 003G089800. 1 NtNAC096 NbS00031624g0002. 1 ANAC096，NAC096
41 PtNAC100-1 Potri． 012G001400. 1 NtNAC100-1 NbS00016883g0004. 1 ANAC100，ATNAC5
42 PtNAC100-2 Potri． 017G086200. 1 NtNAC100-2 NbS00005565g0006. 1 ANAC100，ATNAC5
43 PtNAC104 Potri． 003G022800. 1 NtNAC104 NbS00007461g0014. 1 ANAC104，XND1
①毛果杨基因编号来自 phytozome 网站 http:∥ www． phytozome． net /，版本 v3. 0。烟草基因编号来自 sol genomics network 网站 http:∥
solgenomics． net /，版本 v0. 4. 4。使用拟南芥的基因名称进行基因描述。Populus trichocarpa gene loci are from the phytozome website http:∥www．
phytozome． net /，release v3. 0． Tobacco gene loci are from the solgenomics network website http:∥solgenomics． net / ，release v0. 4. 4． Gene is described
using the gene names of Arabidopsis thaliana．
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林 业 科 学 50 卷
2. 2 烟草和毛白杨的 NAC 同源基因的系统进化树
分析
运用 Clustal X 1. 83 软件对烟草和毛白杨的
NAC 基因的蛋白全长序列进行多重序列比对，用
MEGA 5. 10 软件采用 Neighbor-Joining (NJ)方法进
行了系统进化树的构建(图 1)。如图所示，86 个烟
草和毛白杨的 NAC 基因划分为 19 个亚组 ( S1 －
19)，且烟草和毛白杨的直系同源基因在系统进化
树中属于同一个亚组。
Hu 等(2010)根据毛果杨基因组 v2. 0 版本，将
毛果杨的 NAC 基因分为 18 个亚组( Sa － Sr)，其中
Sb，Sc，Se，Sd，Sq，Sk，Sd 和 Sf 亚组分别对应本研究
中毛白杨(比对毛果杨基因组 v3. 0 版本)和烟草的
S4，S5，S9，S10，S14，S15，S18 和 S19 亚组。而 S2 中
的 NAC029、S3 中的 NAC104 和 S13 中的 NAC057 在
毛果杨基因组 v2. 0 版本中没有出现，是因为毛果杨
基因组 v3. 0 版本具有比 v2. 0 版本更多的序列信
息。S6，S7 和 S8 对应毛果杨基因组 v2. 0 版本中的
Sa，S11 和 S12 对应 Sg，S16 和 S17 对应 Si。毛果杨
基因组 2 个版本的不同造成了系统进化树中不同的
聚类方式，从而导致亚组分类的不同。
2. 3 烟草和毛白杨的 NAC 同源基因在维管发育过
程中的表达分析
在早期的研究中，通过组织切片观察，发现旺
长期的烟草和扦插 4 个月的毛白杨在 1 － 6 节间具
有相似的维管发育过程(数据未提供，另文发表)。
分别对旺长期的烟草和扦插 4 个月的毛白杨的第
1 － 3节间的样本进行了高通量测序，得到了木质化
过程中相关基因的表达谱。根据 NAC 基因的表达
值(RPKM)制作热图( heatmap) (图 2)。在 43 对烟
草和毛白杨同源对应的 NAC 基因中，NAC028-1，
NAC029，NAC036，NAC040，NAC043-2，NAC050，
NAC056，NAC062，NAC072，NAC073-1，NAC073-2，
NAC074-2，NAC100-2 13 对基因在烟草和毛白杨的 3
个节间中具有相似的表达模式。然而，NAC002-3，
NAC007-3，NAC008-1，NAC017，NAC021，NAC028-2，
NAC037，NAC043-1，NAC057，NAC075-1，NAC075-2，
NAC082-1，NAC082-2，NAC094，NAC100-1 和 NAC104
16 对 NAC 同源基因中的毛白杨基因在 3 个节间均
没有发生表达，而相应的烟草的同源基因却发生了
表达，说明烟草和毛白杨在进化过程中发生了组织
特异表达的改变。NAC002-1，NAC002-3，NAC007-1，
NAC008-2，NAC017，NAC028-2，NAC037，NAC043-1，
NAC074-1， NAC078-1， NAC078-2， NAC082-1，
NAC082-2，NAC083-1，NAC083-2 和 NAC104 16 个基
图 1 烟草和毛白杨的 NAC 基因的系统树分析
Fig． 1 Phylogenetic tree of NAC gene in tobacco and
Populus tomentosa
通过 Clustal X 1. 83 软 件 对 烟 草 和 毛 白 杨 的 NAC 基 因
(phytozome 网站 http:∥www． phytozome． net /，版本 v3. 0)的全
长蛋白序列进行比对，用MEGA5. 10 软件中的Neighbor-Joining
(NJ)方法采用 1 000 次重复比对进行系统树的构建，并且进
行了亚组( S: subgroup) 的划分。图的最右侧是对应毛果杨
NAC 基因 ( phytozome 网站 http:∥ www． phytozome． net /，版本
v2. 0)的亚组。比例尺表示 0. 1 个氨基酸替换率。
The full-length protein sequences of NAC genes ( hytozome website
http:∥ www． phytozome． net /， release v3. 0 ) in tobacco and
Populus tomentosa were aligned by Clustal X 1. 83． The
phylogenetic tree was constructed using MEGA 5. 10 by Neighbor-
Joining ( NJ ) method with 1 000 bootstrap replicates and
subgroups ( S ) were designated． The right of the panel is the
subgroups ( S) designated in the corresponding Populus trichocarpa
NAC genes ( hytozome website http:∥ www． phytozome． net /，
release v2. 0) ． The scale bar indicates an evolutionary distance of
0. 1 amino acid substitutions per site．
62
第 3 期 郭 伟等: 毛白杨和烟草次生维管发育相关 NAC 转录因子的比较
因在烟草和毛白杨中的表达模式截然不同，在毛白
杨中表达量比较低，而在烟草中表达量却比较高，说
明这 16 个基因更多参与了烟草维管组织发育的
调控。
2. 4 烟草和毛白杨 NAC 同源基因在不同组织中的
表达分析
选择 8 对在烟草和毛白杨中都发生表达并且在
杨树中尚未见研究报道的 NAC 基因，在旺长期的烟
草和扦插 4 个月的毛白杨的第 1 － 6 节间以及顶端
分生组织、叶片、根中通过荧光定量 PCR 进行表达
分析(图 3)。结果表明荧光定量 PCR 与基因表达
谱的结果具有相同的变化趋势，说明建立在高通量
测序基础上的基因表达谱测序具有较高的准确性。
这 8 对 NAC 同源基因在烟草和毛白杨的不同组织
中的表达模式也基本一致。
NAC043-2，NAC056， NAC062， NAC073-2 和
NAC100-2 的同源基因在烟草和毛白杨的顶端分生
组织(SAM)和叶片中具有最低的表达量，在根中具
有比较高的表达量，在远离顶端的节间中的表达量
比靠近顶端的节间高，说明其随着茎的木质化程度
提高表达水平也相应提高。NAC040 同源基因的表
达模式与 NAC043-2，NAC056，NAC062，NAC073-2 和
NAC100-2 相反，在远离顶端的节间比靠近顶端的节
间表达量低，同时在顶端分生组织具有最高的表达
量，说明 NAC040 的表达量变化与茎的木质化程度
成反比，可能更多参与了初生维管组织的形成。而
NAC073-1 和 NAC074-2 同源基因在烟草和毛白杨的
不同节间中的表达量先升高后降低，在第 1 和第 6
节间、顶端分生组织、叶片和根中的表达量较低，在
维管组织分化的过程(第 2 － 5 节间)中具有较高的
表达量，推测它们更多参与初生到次生生长的转换。
值得注意的是，NAC073-1 和 NAC073-2 虽然具有较
高的同源性(图 1)，但是却具有不同的表达模式，推
测这 2 个基因在进化过程中组织表达或执行的功能
发生了分化。
3 讨论
杨树作为一种研究木材形成的模式植物，具有
典型的次生维管系统发育过程 ( Groover et al．，
2006; Groover，2005; Plomion et al．，2001)。随着生
命科学和生物技术的快速发展，毛果杨基因组测序
的完成，获得了大量有关木材形成过程的相关基因。
但是数据库中的注释信息 (基因结构、推定的功能
等)是通过与拟南芥基因组进行比对，根据拟南芥
的同源基因、同源基因家族和蛋白结构域的信息进
图 2 烟草和毛白杨 NAC 直系同源基因
在前 3 个节间的表达分析
Fig． 2 Expression analysis of the NAC orthologous genes in the
first three internodes of tobacco and Populus tomentosa
从左到右分别是 PIN1，PIN2，PIN3，TIN1，TIN2，TIN3 的 RPKM
值。热图的制作是通过 Matrix2png 网站 (英属哥伦比亚大学，
http:∥ chibi． ubc． ca /matrix2png) ． RPKM 的值由不同的颜色表
示: 最小值(深绿色)0. 4，最大值(红)20。
Columns in each heatmap from left to right: PIN1，PIN2，PIN3，
TIN1， TIN2， TIN3． The heatmap image was generated from
expression profile data using the Matrix2png web interface
( University of British Columbia， http: ∥ chibi． ubc． ca /
matrix2png) ． Range of RPKM values to display as different colors:
minimum ( dark green) 0. 4，maximum ( red) 20．
72
林 业 科 学 50 卷
图 3 烟草和毛白杨的 NAC 直系同源基因在不同组织的表达分析
Fig． 3 Expression analysis of the NAC orthologous genes in a range of tissues of tobacco and Populus tomentosa
TIN1 － 6: 烟草第 1 － 6 节间 Tobacco internodes 1 － 6; TL: 烟草的叶片 Tobacco leaves; TR: 烟草的根 Tobacco roots; TS: 烟草的 SAM
Tobacco SAM; PIN1 － 6:毛白杨第 1 － 6 节间 P． tomentosa internodes 1 － 6; PL: 毛白杨的叶片 P． tomentosa leaves; PR: 毛白杨的根
P． tomentosa roots; PS: 毛白杨的 SAM P． tomentosa SAM． RPKM: 基因在相应组织中的 RNA-seq 的表达值 The gene expression values
of RNA-seq data in the corresponding home．
行推测。而拟南芥本身不具备典型的次生生长特
征，缺少某些木材形成基因和相关的生物学过程
(Nieminen et al．，2004)。很显然，这些基因的功能
需要进一步鉴定。
本文将烟草维管组织转录组数据库中的 NAC
转录因子基因与毛果杨基因组数据库进行比对，得
82
第 3 期 郭 伟等: 毛白杨和烟草次生维管发育相关 NAC 转录因子的比较
到 43 对 NAC 同源基因(表 2)。通过对烟草和毛白
杨的第 1 － 3 节间的样本进行基因表达谱高通量测
序，得到每个同源基因在不同节间的表达量，找到了
13 对表达模式相似的同源基因。选择 8 对在烟草
和毛白杨中都发生表达并且在毛白杨中没有研究的
NAC 基因，在烟草和毛白杨的第 1 － 6 节间、根、叶和
顶端分生组织中通过相对荧光定量 PCR 进行表达
分析，结果与表达谱一致，并且这 8 对 NAC 同源基
因在烟草和毛白杨中具有相似的表达模式，说明通
过研究烟草的 NAC 转录因子来揭示杨树的维管发
育相关基因的作用具有可行性。
NAC043-2，NAC056， NAC062， NAC073-2 和
NAC100-2 的同源基因在烟草和毛白杨的远离顶端
的节间中的表达量比靠近顶端的节间高，说明随着
茎的木质化程度的提高而提高。其中，NST1 /
ANAC043(NAC Secondary Wall Thickening Promoting
Factor 1)，NST2 /ANAC066 和 NST3 /SND1( Secondary
Wall-associated NAC Domain Protein) /ANAC012 在控
制次生细胞壁合成中起作用，并且功能部分冗余
(Mitsuda et al．，2007; 2008; 2005; Zhong et al．，
2007)，异位表达后能够导致转基因植株不同组织
的次生细胞壁加厚 (Mitsuda et al．，2005; Zhong et
al．， 2007 )。 NST1 /ANAC043 和 NST3 /SND1 /
ANAC012 在调节拟南芥花序茎的束间纤维和胚轴
的次生木质部的次生细胞壁加厚中功能冗余
(Mitsuda et al．，2007; 2008 )。 SND2 /ANAC073 和
SND3 /ANAC010 在调节纤维次生细胞壁的形成中起
作用 ( Zhong et al．，2008 )，SND2 已经被证实是
NST3 /SND1 的下游靶基因，而 SND3 也被推测是
NST3 /SND1 的下游靶基因(Zhong et al．，2008)。而
目前却没有关于 NAC056，NAC062 和 NAC100 的功
能研究的相关报道，但是根据表达模式推测它们在
维管发育过程中能够行使功能，需要进一步加以阐
明。NAC073-1 和 NAC074-2 同源基因在烟草和毛白
杨的维管组织分化 (第 2 － 5 节间)中具有较高的表
达量，其中 SND2 /ANAC073 在调节纤维次生细胞壁
形成中起作用( Zhong et al．，2008)，ANAC074 在拟
南芥的木质部中表达上调，可以推测 NAC073-1 和
NAC074-2 都能够在维管分化中行使功能。根据表
达模式可以推测这 8 对 NAC 基因都能够在维管发
育中起到重要作用，因此有必要利用烟草的研究系
统对这 8 对基因进行深入的功能鉴定。
采用烟草病毒诱导的基因沉默 ( virus induced
gene silencing，VIGS)系统来鉴定杨树次生维管系统
发育相关的基因是本研究的目的之一。该技术是一
种能够快速通过 RNAi 来介导基因沉默的技术，不
需要对植物进行遗传转化，能够对植物基因功能进
行快速分析 ( Gossele et al．，2002; Huang et al．，
2011; Tao et al．，2004; Zhu et al．，2010)。烟草的
VIGS 系统是一个快速、可靠和强大的系统，并且在
研究植物细胞壁形成相关基因的功能中得到了成功
的应用(Zhu et al．，2010)。纤维素、木聚糖和木质
素合成相关基因在通过 VIGS 介导的烟草植株中与
在其他不同的物种中不同的基因沉默系统具有相似
的表型(Zhu et al．，2010)。因此，上述获得的烟草
和毛白杨 NAC 同源基因可以通过烟草相应的基因，
采用烟草 VIGS 技术，研究它们在次生维管系统发
育中的作用。
参 考 文 献
Al-Ahmad H，Galili S，Gressel J． 2004． Tandem constructs to mitigate
transgene persistence: tobacco as a model． Molecular Ecology，13
(3) :697 － 710．
Cook C M，Daudi A，Millar D J，et al． 2012． Transcriptional changes
related to secondary wall formation in xylem of transgenic lines of
tobacco altered for lignin or xylan content which show improved
saccharification． Phytochemistry，74:79 － 89．
Damiani I，Morreel K，Danoun S， et al． 2005． Metabolite profiling
reveals a role for atypical cinnamyl alcohol dehydrogenase CAD1 in
the synthesis of coniferyl alcohol in tobacco xylem． Plant Molecular
Biology，59(5) :753 － 769．
Demura T， Fukuda H． 2007． Transcriptional regulation in wood
formation． Trends Plant Sci，12(2) :64 － 70．
Dharmawardhana P，Brunner A M，Strauss S H． 2010． Genome-wide
transcriptome analysis of the transition from primary to secondary
stem development in Populus trichocarpa． BMC Genomics，11:150．
Du J，Xie H L，Zhang D Q，et al． 2006． Regeneration of the secondary
vascular system in poplar as a novel system to investigate gene
expression by a proteomic approach． Proteomics，6(3) :881 － 895．
Duval M，Hsieh T F，Kim S Y，et al． 2002． Molecular characterization
of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily．
Plant Molecular Biology，50(2) :237 － 248．
Ehlting J，Mattheus N，Aeschliman D S，et al． 2005． Global transcript
profiling of primary stems from Arabidopsis thaliana identifies
candidate genes for missing links in lignin biosynthesis and
transcriptional regulators of fiber differentiation． The Plant Journal，
42(5) :618 － 640．
Fang Y，You J，Xie K，et al． 2008． Systematic sequence analysis and
identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC
transcription factor family in rice． Mol Genet Genomics，280 (6 ) :
547 － 563．
Farrokhi N，Burton R A，Brownfield L，et al． 2006． Plant cell wall
biosynthesis: genetic， biochemical and functional genomics
approaches to the identification of key genes． Plant Biotechnology
Journal，4(2) :145 － 167．
Foucart C，Paux E，Ladouce N，et al． 2006． Transcript profiling of a
92
林 业 科 学 50 卷
xylem vs phloem cDNA subtractive library identifies new genes
expressed during xylogenesis in Eucalyptus． The New Phytologist，
170(4) :739 － 752．
Gossele V，Fache I，Meulewaeter F， et al． 2002． SVISS—a novel
transient gene silencing system for gene function discovery and
validation in tobacco plants． The Plant Journal，32(5) :859 － 866．
Groover A，Robischon M． 2006． Developmental mechanisms regulating
secondary growth in woody plants． Current Opinion in Plant Biology，
9(1) :55 － 58．
Groover A T． 2005． What genes make a tree a tree? Trends Plant Sci，10
(5) :210 － 214．
Guillaumie S， Mzid R， Mechin V， et al． 2010． The grapevine
transcription factor WRKY2 influences the lignin pathway and xylem
development in tobacco． Plant Molecular Biology， 72 ( 1 /2 ) :
215 － 234．
Hertzberg M，Aspeborg H，Schrader J，et al． 2001． A transcriptional
roadmap to wood formation． Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America，98(25) :14732 － 14737．
Hu R，Qi G，Kong Y，et al． 2010． Comprehensive analysis of NAC
domain transcription factor gene family in Populus trichocarpa． BMC
Plant Biol，10:145．
Huang C J，Zhang T，Li F F，et al． 2011． Development and application
of an efficient virus-induced gene silencing system in Nicotiana
tabacum using geminivirus alphasatellite． Journal of Zhejiang
University Science B，12(2) :83 － 92．
Jensen M K，Kjaersgaard T，Nielsen M M，et al． 2010． The Arabidopsis
thaliana NAC transcription factor family: structure-function
relationships and determinants of ANAC019 stress signalling． The
Biochemical Journal，426(2) :183 － 196．
Kikuchi K，Ueguchi-Tanaka M，Yoshida K T，et al． 2000． Molecular
analysis of the NAC gene family in rice． Molecular ＆ General
Genetics，262(6) :1047 － 1051．
Livak K J，Schmittgen T D． 2001． Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2 － ΔΔ Ct Method．
Methods，25(4) :402 － 408．
Mitsuda N， Iwase A，Yamamoto H，et al． 2007． NAC transcription
factors，NST1 and NST3，are key regulators of the formation of
secondary walls in woody tissues of Arabidopsis． The Plant Cell，19
(1) :270 － 280．
Mitsuda N，Ohme-Takagi M． 2008． NAC transcription factors NST1 and
NST3 regulate pod shattering in a partially redundant manner by
promoting secondary wall formation after the establishment of tissue
identity． The Plant Journal，56(5) :768 － 778．
Mitsuda N，Seki M，Shinozaki K，et al． 2005． The NAC transcription
factors NST1 and NST2 of Arabidopsis regulate secondary wall
thickenings and are required for anther dehiscence． The Plant Cell，
17(11) :2993 － 3006．
Mortazavi A，Williams B A，McCue K， et al． 2008． Mapping and
quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq． Nature
Methods，5(7) :621 － 628．
Nieminen K M，Kauppinen L，Helariutta Y． 2004． A weed for wood?
Arabidopsis as a genetic model for xylem development． Plant
Physiol，135(2) :653 － 659．
Oh S，Park S，Han K H． 2003． Transcriptional regulation of secondary
growth in Arabidopsis thaliana． Journal of Experimental Botany，54
(393) :2709 － 2722．
Ooka H，Satoh K，Doi K，et al． 2003． Comprehensive analysis of NAC
family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana． DNA
Research，10(6) :239 － 247．
Paiva J A，Garces M，Alves A，et al． 2008． Molecular and phenotypic
profiling from the base to the crown in maritime pine wood-forming
tissue． The New Phytologist，178(2) :283 － 301．
Pavy N，Boyle B，Nelson C，et al． 2008． Identification of conserved core
xylem gene sets: conifer cDNA microarray development，transcript
profiling and computational analyses． The New Phytologist，180
(4) :766 － 786．
Plomion C，Leprovost G，Stokes A． 2001． Wood formation in trees．
Plant Physiology，127(4) :1513 － 1523．
Robischon M，Du J，Miura E，et al． 2011． The Populus class III HD
ZIP，popREVOLUTA，influences cambium initiation and patterning
of woody stems． Plant Physiol，155(3) :1214 － 1225．
Somerville C． 2006． Cellulose synthesis in higher plants． Annual Review
of Cell and Developmental Biology，22:53 － 78．
Tao X，Zhou X． 2004． A modified viral satellite DNA that suppresses
gene expression in plants． The Plant Journal，38(5) :850 － 860．
Wang M，Qi X，Zhao S，et al． 2009． Dynamic changes in transcripts
during regeneration of the secondary vascular system in Populus
tomentosa Carr． revealed by cDNA microarrays． BMC Genomics，
10:215．
Yang J，Kamdem D P，Keathley D E，et al． 2004． Seasonal changes in
gene expression at the sapwood-heartwood transition zone of black
locust ( Robinia pseudoacacia ) revealed by cDNA microarray
analysis． Tree Physiology，24(4) :461 － 474．
Zhao C． 2005． The xylem and phloem transcriptomes from secondary
tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl． Plant Physiology，138(2) :
803 － 818．
Zhao C，Avci U，Grant E H，et al． 2008． XND1，a member of the NAC
domain family in Arabidopsis thaliana， negatively regulates
lignocellulose synthesis and programmed cell death in xylem． The
Plant Journal，53(3) :425 － 436．
Zhong R，Lee C，Ye Z H． 2010． Functional characterization of poplar
wood-associated NAC domain transcription factors． Plant Physiol，
152(2) :1044 － 1055．
Zhong R，Lee C，Zhou J，et al． 2008． A battery of transcription factors
involved in the regulation of secondary cell wall biosynthesis in
Arabidopsis． The Plant Cell，20(10) :2763 － 2782．
Zhong R， Richardson E A， Ye Z H． 2007． Two NAC domain
transcription factors， SND1 and NST1， function redundantly in
regulation of secondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis．
Planta，225(6) :1603 － 1611．
Zhu X，Pattathil S，Mazumder K， et al． 2010． Virus-induced gene
silencing offers a functional genomics platform for studying plant cell
wall formation． Molecular Plant，3(5) :818 － 833．
(责任编辑 徐 红)
03