全 文 ：第 !" 卷 第 ## 期
$ % # % 年 ## 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1##
*/23!$ % # %
利用激光共聚焦显微镜研究孝顺竹花粉粒发育!
徐川梅4高4欣4汤定钦
"浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地4临安 5##5%%$
关键词’4孝顺竹# 花粉粒发育# 激光扫描共聚焦显微镜
中图分类号! &:#73!:444文献标识码!,444文章编号!#%%# >:!77#$%#%$## >%#87 >%!
收稿日期’ $%#% >%$ >%$# 修回日期’$%#% >%! >%#&
基金项目’ 国家自然科学基金项目 "5%::#:85 $ # *十一五+科技支撑项目 "$%%"C,K#6C%$%$ $ # 浙江省科技厅优先主题重点农业项目
"$%#%’#$%##$ # 浙江林学院启动基金"$!8#%%##5#$ &
!汤定钦为通讯作者&
U8/.,A&’(")"0!"%.)E.A.%"#F.)’()A".<$%" .$#-&,#’B ;(’+J&/.,@-&)
*")0"-&%3(-,"/-"#.
[E ’=EGI;MD4OG/[DIJ4+GIJKDIJQDI
"F#)O5(+5(406 !+/+4$0 &$(+#)!+/+):),./;$(/+$(,$&!5;+($24"/%!4%84"5%+5()! ]#)B4/06 36(4"5%+5()/01 ’$()*+(,7048)(*4+,4.40(/0 5##5%%$
78/’,&-’’4+=MRNT/0UM2M0/S;MIT/X;G0MJG;MT/S=NTM/XA/=;5*/ =5%+42%)GYGWWTEUDMU ZNUNDIJYDT= GX0E/VMWRMIRM
UNM/XF/MR=WT555!$ GIU /ZWMV2DIJYDT= 0GWMVWRGIIDIJR/IX/RG0;DRV/WR/SM"-&’]$3+=MVMWE0TW=/YMU TYDRM;DT/WMW
T//d S0GRMGIU T=M;GTEVMS/0MIW=GU T=VMMRM0WYDT= /IMGSMVTEVMUEVDIJT=MUM2M0/S;MIT/XT=M;G0MJG;MT/S=NTMW! GIU
T=M;G0MJG;MT/S=NTMWGZI/V;G0NGRTMU GTGXVMQEMIRN/X57a DI AI=5%+42%)G3LDT= T=MR/IX/RG0GVVGIJM;MIT! WMVDG0
/STDRG0WRGIIDIJ! GIU GU2GIRMU T=VMM^UD;MIWD/IG0VMR/IWTVERTD/I /XT=M-&’]! UDVMRTGIU 2DWEG0UDWS0GN/XT=MT=VMM^
UD;MIWD/IG0S/0MI GVR=DTMRTEVMYGWG2GD0GZ0MDI T=DWWTEUN3
9.: ;",44激光扫描共聚焦显微镜 "0GWMVWRGIIDIJR/IX/RG0
;DRV/WR/SM! -&’]$ 是 $% 世纪 7% 年代发展的高科
技产品!主要是采用激光作为光源!在荧光显微镜的
基础上添加了激光扫描装置和计算机图像处理系统
等!通过对观察样品进行光学断层扫描及三维结构
重建等!可得到细胞或组织内部细微结构的荧光图
像!同时激光扫描共聚焦显微镜还是活细胞动态观
察%多重免疫荧光标记和’G$ q荧光观察"’=MI )+/%I!
$%%6$ 的有力工具!目前已在花粉 "@GIJ)+/%I!
$%%7$和花粉管发育 "’=MI )+/%I! $%%7# LE )+/%I!
$%%7$%蛋白质功能"H=MIJ)+/%I! $%%6$及信号传导
"-DE )+/%I! $%%6$等的研究中发挥了重要作用&
竹 类 植 物 是 禾 本 科 " OVG;DIMGM$ 竹 亚 科
"CG;ZEW/DUMGM$植物的总称!其利用价值极高! 被
公认为 $# 世纪世界上最重要的植物资源之一& 竹
类植物开花现象异常复杂!主要表现为开花周期长%
开花后多数死亡%结实率低下或无种子等& 近几年!
不少地区陆续出现竹子开花现象!一些研究者在一
些竹种的开花生物学特性 "程有龙等!#668# 杜凡
等!$%%%# 赖广辉!$%%## 何其江!$%%5$%花粉粒形
态及花粉活力 "张文燕等!#676# #66$# 汪奎宏等!
$%%%# 林树燕等!$%%7$%竹子杂交育种 "@E!#668#
张光楚!$%%%$等方面开展了研究!但总体上进展缓
慢& 花粉粒发育是植物生活周期中一个重要的过
程!直接决定着植物的有性生殖"-D)+/%I! $%#%$!与
植物遗传育种有十分密切的关系!因此探讨竹类植
物花粉的发育特性可以丰富其开花结实的内容!阐
明竹类植物结实率低下的部分原因!为竹类植物遗
传改良提供依据和参考&
孝顺竹"A/=;5*/ =5%+42%)G$ 属竹亚科鷚竹属
"A/=;5*/$ !在竹子分类学上属于丛生竹!是重要
的园林绿化竹种!被广泛用作绿篱%栅栏等# 竹秆
细长强韧!可用于编织%造纸等"袁金玲等!$%%6$ &
目前对于孝顺竹的研究主要集中于加工利用及生
理生化等方面!关于其雄配子体发育研究还未见
报道& 本研究利用激光共聚焦显微镜!对孝顺竹
雄配子体发育过程进行细胞学观察分析!旨在揭
示孝顺竹结实率低下原因!并为小孢子单倍体育
种等研究提供理论依据&
=>材料与方法
#1#4材料4孝顺竹花粉及花药均采集于浙江林学
4第 ## 期 徐川梅等’ 利用激光共聚焦显微镜研究孝顺竹花粉粒发育
院翠竹园& 剪取孝顺竹花枝!剥出花药!用刻度尺量
出花药长度!根据长度差异分装在不同离心管中&
#1$4方法4#$材料预处理4花药及花粉用卡诺固
定液固定 $ = 以上!经 :%a!8%a!5%a酒精逐级脱
水至蒸馏水!每级停留 5% ;DI!在蒸馏水中停留数小
时!并换水数次把材料中的固定液冲洗干净&
$$ F/MR=WT555!$ 荧光染色4参照李国平等
"$%%"Z$ 的方法略有改进& 先用柠檬酸 >磷酸氢二
钠缓冲液" %1# ;/0(->#! SF81%$ 预处理 " =!加入
$% -J(;-># F/MR=WT555!$ 在$8 j黑暗条件下染色
#! =& 染色后的材料在 5%a! 8%a! :%a! 6%a!
68a!#%%a酒精中各梯度脱水 5% ;DI!无水乙醇中
脱水 5 次!前 $ 次为 # =!最后 # 次 #$ = 以上& 转入
冬青油及无水乙醇的等量混合液中透明 $ =!最后用
冬青油透明 5 次!前 $ 次为 $ =!最后 # 次 #$ = 以
上& 透明后的材料保存于! j冰箱中&
5$ 制片4用镊子将花药取出置于清洁的载玻
片上!用镊子将花药夹碎!加入抗褪色胶!盖上
$$ ;;m$$ ;;的盖玻片&
!$ 激光共聚焦显微镜观察4将制备好的制片
放置在激光共聚焦显微镜 "-&]8#% ;MTG!蔡司公
司$上!用 $% 倍%"5 倍镜头选取所需观察对象& 启
动扫描软件 H)*$%%:!利用 p.激光器的激光作光
源进行预扫描!p.激光器激发波长 !%8 I;!检测发
射光波长 !#% 988% I;!伪彩色采用兰色& 设置合
适的光路及扫描参数!通过单次扫描 "WDIJ0MWRGI$
和连续扫描"WMVDMWWRGI$方式进行图像采集&
B>结果与分析
$1#4四分体时期4孝顺竹花粉母细胞经减数分裂
后!首先形成四分体!在四分体周围及各细胞之间均
有胼胝质包围和分隔!由于胼胝质的低透性控制着
细胞之间的物质交流!因此四分体各细胞之间具有
独立性 "图版# >#’ 三维重建立体图# 图版# >$’
平面扫描图$&
$1$4单核居中期4在多数植物中四分体持续时间
很短!随后!由于胼胝质壁的溶解!子细胞彼此分离!
成为 ! 个各含 # 个细胞核的花粉粒!此时的花粉粒!
细胞壁薄 "图版# >5$& 随着小孢子的进一步发
育!其细胞壁逐渐加厚!在准备形成萌发孔的地方细
胞壁发生凹陷!细胞质变浓!细胞核增大且细胞核位
于细胞中央 "图版# >!$&
$154单核靠边期4由于小孢子不断地从周围的绒
毡层分泌物或其降解物质吸取营养物质及水分!其
体积增大!细胞质中的小液泡逐渐合并成大液泡!细
胞核逐渐向细胞壁靠近 "图版# >8$!随着大液泡
的增大!细胞核完全移向与花粉粒萌发孔相对应的
一侧 "图版# >"!:’ 三维重建图$!即单核靠边期&
由图版# >: 花粉粒的三维重建立体图!可以清楚
地看出此时萌发孔已经形成!且只具有 # 个萌发孔&
$1!4二细胞花粉粒4单核花粉粒的核在靠近细胞
壁的位置进行 # 次有丝分裂 "图版# >7$!形成 $
个子核!$ 个子核中!# 个贴近花粉粒内壁为生殖核!
另 # 个靠近花粉粒萌发孔为营养核 "图版# >6$#
随后!细胞质发生分裂!细胞质分裂时!其细胞板成
弧形!弯向生殖核一侧!最后生殖细胞呈现凸透镜型
或球形!只含有少量的细胞质!花粉粒中其余大量的
细胞质为营养细胞所有 "图版# >#%’ 三维重建立
体图$& 生殖细胞形成后不久!生殖细胞由最初紧
贴花粉内壁处逐渐沿壁向内推移%收缩!细胞渐渐变
圆!最后细胞和花粉内壁分离!游离在营养细胞之
中!出现细胞中有细胞的独特现象 "图版# >##’
三维重建立体图$!最后营养细胞和生殖细胞构成
了二细胞花粉粒&
$184三细胞花粉粒及不育花粉粒4随着二细胞花
粉粒进一步发育!生殖细胞再进行 # 次有丝分裂!形
成 $ 个精细胞!成为三核花粉粒!即三细胞花粉粒
"图版# >#$$# 此时孝顺竹花粉粒完全成熟!从开
裂的花粉囊中散出!经过传粉在雌蕊的柱头上萌发!
形成花粉管!为受精准备条件 "图版# >#!’ 成熟
的孝顺竹花粉粒人工培养 :$ = 后萌发$& 在试验过
程中!还发现大约有 57a的小孢子不能发育成正常
的花粉粒!而停止在雄配子体发育过程中的某一阶
段!这些败育的小孢子表现为外形皱缩!形态不规
则!细胞质稀薄!细胞核小或者消失 "图版# >#5$&
D>讨论
竹类植物具有开花周期长%开花时间和空间难
以预测等诸多的特殊开花习性!因此目前关于竹类
植 物 雄 配 子 体 发 育 的 研 究 不 多& 仅 在 爬 竹
"3=2)%$"/%/=5**"/01)0*$ "庞延军等!#66!$%雷竹
"?#,%$*+/"#,*2(/)"$G$ "黄坚钦等!#666 $%巨龙竹
"L)01($"/%/=5**404"5*$ "王曙光等!$%%"$和月月竹
"H)0*+(5$"/%/=5**4"#5/0)0*4*$ "林树燕等!$%%6$等
少数竹种有过报道!上述研究多采用传统的组织石
蜡切片方法!观察花粉的外部形态变化& 本试验将
荧光染色技术应用于孝顺竹雄配子体发育研究!并
结合激光扫描共聚焦显微镜观察拍照!与传统石蜡
切片技术及普通荧光显微镜拍照系统相比!激光共
聚焦显微镜能够实现图像的三维重建与显示!即所
68#
林 业 科 学 !" 卷4
谓*细胞 ’++!把获得的系列扫描图像经计算机软
件处理!可得到一幅能体现样品空间形态结构且具
立体感的三维图像!并能对三维图像的整体结构任
意旋转!从各个角度进行体视学分析 "李国平等!
$%%"G$& 因而在缩短试验周期!简化试验步骤的同
时!能够更为清晰直观%立体%连续地观察雄配子体
内部结构的变化& 图版# >#!:!#%!##!#$ 是孝顺
竹花粉粒经激光共聚焦显微镜系列扫描!然后经三
维重建获得的立体图!可以清晰地看出孝顺竹花粉
粒具有 # 个萌发孔!且其各时期的细胞核变化情况
及空间分布得以很好展示& 图版# >## 是生殖细
胞脱离花粉粒内壁后游离在营养细胞中的二细胞花
粉粒!图版# >#$ 是成熟的花粉粒三维重建后旋
转!其具有 5 个细胞核!营养细胞核靠近萌发孔!$
个生殖细胞成楔形远离萌发孔& 花粉粒内部这些结
构细节是通过普通的光学显微镜很难观察到的&
被子植物花粉的形成通常经历如下几个过程’
#$通过几次有丝分裂形成二倍体造孢组织# $$通过
# 次减数分裂和 # 次有丝分裂形成单倍体小孢子#
5$小孢子通过 $ 次有丝分裂形成含精细胞的雄配
子体 "蔡雪!#666$& 一些研究表明!在不同科属植
物间!其雄配子体发育过程存在很大差异!如百合科
"-D0DGRMGM$和茄科"&/0GIGRMGM$的一些植物!其小孢
子发育为成熟的花粉粒只需经历 # 次有丝分裂成为
二细胞花粉粒!授粉后在花粉管萌发的过程中再发
生第 $ 次有丝分裂!即其成熟的花粉粒为二细胞花
粉 粒# 而 十 字 花 科 " ’VERDXMVGM$ 及 禾 本 科
"OVG;DIMGM$一些植物!其小孢子要经历 $ 次有丝分
裂发育为具有 5 个细胞核的成熟花粉粒!然后从花
药中散出进行授粉"]R’/V;DRd! #665# $%%!# +YM0
)+/%3! #667# ]G! $%%8# &DIJ= )+/%I! $%%:$& 本研究
中观察到孝顺竹单倍体小孢子经过 $ 次有丝分裂过
程最终形成了具有 # 个萌发孔和 5 个细胞核的成熟
花粉粒!与禾本科和十字花科中的一些植物相似&
万双粉等 " $%%" $ 对十字花科青花菜 "A(/**4"/
$%)(/")/ 2GV34+/%4"/$雄配子体发育的研究表明其成
熟的花粉粒为三细胞型!同时具有 5 个萌发孔!孝顺
竹与其存在很大差异!与水稻 "P(,_/ */+48/$%小麦
"F(4+4"5=/)*+485=$相似!仅具有 # 个萌发孔&
本研究观察发现孝顺竹小孢子发育过程中!大
约有 57a孢子不能发育成正常的花粉粒!这些败育
的小孢子与正常的小孢子相比!主要表现为外形皱
缩%形态不规则!以及内部细胞质稀薄%细胞核小或
者消失等现象!这可能是孝顺竹花粉萌发率低的主
要原因& 笔者对孝顺竹花粉萌发率也进行了测试!
其实际萌发率也只有 $%a "数据未发表$& 植物种
子败育或结实率低下主要受内部因素和外部环境影
响 "梁春莉等!$%%8$!低下的萌发率是影响许多竹
种结实率的主要原因 "张文燕等!#676# 汪奎宏等!
$%%%# 林树燕等!$%%7$& 可以推测孝顺竹花粉败育
率较高及萌发率低下是造成其结实率低下的主要
原因&
竹类植物目前还没有花药培养成功的报道& 禾
本科植物水稻%小麦等花药培养的最佳时期是单核
靠边期 "陈红等!$%%:$!竹类植物与水稻亲缘关系
较近同属于禾本科!其花药培养最佳时期选择可借
鉴同科的水稻或者小麦& 本研究表明!孝顺竹雄配
子体发育单核靠边期持续时间较长!单核靠边期花
药长度为 ! 9" ;;!这可为孝顺竹花药培养取材提
供理论依据&
参 考 文 献
蔡4雪3#6661被子植物花粉形成过程中细胞骨架的动态及生物学
意义3植物学通报! #""!$ ’ 556 >5!!1
陈4红! 秦瑞珍3$%%:1水稻花药培养过程中各种影响因子的研究
进展3中国农业科技导报! 6"5$ ’ 8$ >8"1
程有龙! 任德唐! 朱白玉! 等3#6681角竹开花习性观察及复壮更新
对策3浙江林业科技! #8"$$ ’ 8% >8"1
杜4凡! 薛嘉榕! 杨宇明! 等3$%%%1#8 年来云南竹子的开花现象
及其类型研究3林业科学! 5"""$ ’ 8: >"71
何其江3$%%51雷竹花穗和花器的观察研究3浙江林业科技! $5
"$$ ’ #% >##1
黄坚钦! 黄华宏! 何福基! 等3#6661雷竹的小孢子发生和雄配子体
形成3竹子研究汇刊! #7"5$ ’ 88 >871
赖广辉3$%%#1#% 种刚竹属植物花部形态的补充描述3武汉植物研
究! #6 "#$ ’ : >#51
李国平! 黄群策! 秦广雍3$%%"G3用激光扫描共聚焦显微镜观察雪
松花粉和花粉管3激光生物学报! #8"#$ ’ # >71
李国平! 黄群策! 杨鹭生! 等3$%%"Z3油杉小孢子发生的激光扫描
共聚焦显微镜观察3激光生物学报! #8"8$ ’ !"$ >!:%1
梁春莉! 刘孟军! 赵4锦3$%%81植物种子败育研究进展3分子植物
育种! 5"#$ ’ ##: >#$$1
林树燕! 丁雨龙! 张4昊3$%%718 种竹子花粉萌发率及开花特性3
林业科学! !!"#%$ ’ #86 >#"!1
林树燕! 郝娟娟! 辛4华! 等3$%%61月月竹大%小孢子发生和雌%雄
配子体发育研究3南京林业大学学报’ 自然科学版! 55 "5$ ’ 6
>#$1
庞延军! 喻富根! 胡成华! 等3#66!1爬竹雄蕊发育异常的初步观
察3竹子研究汇刊! #%"!$ ’ !$ >!"1
万双粉! 张蜀宁! 张4杰! 等3$%%"1青花菜花粉母细胞减数分裂及
雄配子体发育3西北植物学报! $""8$ ’ 6:% >6:81
汪奎宏! 何奇江! 吴4蓉3$%%%1早竹花粉形态与生物学特性3浙江
林学院学报! #:"$$ ’ #5: >#!#1
王曙光! 普晓兰! 丁雨龙3$%%"1巨龙竹生殖器官形态结构及雌%雄
配子体的发育3植物研究! $""5$ ’ $:% >$:!1
%"#
4第 ## 期 徐川梅等’ 利用激光共聚焦显微镜研究孝顺竹花粉粒发育
袁金玲! 顾小平! 李潞滨! 等3$%%61孝顺竹愈伤组织诱导及植株再
生3林业科学! !8"5$ ’ 58 >!%1
张光楚3$%%%1竹子育种工作近况3竹子研究汇刊! #6"5$ ’ #5 >#81
张文燕! 马乃训! 陈红星3#6761竹类花粉形态及萌发试验3林业科
学研究! $"#$ ’ ": >:%1
张文燕! 马乃训! 吴玲玲! 等3#66$1五月季竹开花结实的研究3竹
子研究汇刊! ## "$$ ’ #8 >$81
’=MI lEI;DIJ! LE OE/0D! LGIJBE=EG! )+/%3$%%71+=MZ0/Rd /X
DITVGRM0E0GVRG0RDE;VM0MGWMGXMRTWT=MS/0MI TEZMUM2M0/S;MIT/X
?4")/ Q4%*$04ZNR=GIJDIJT=MUMS/WDTD/I /XRM0YG0R/;S/IMITW3
kV/T/S0GW;G! $55’ 56 >!61
’=MI +/IJ! LE [DG/QDI! ’=MI BGI;MD! )+/%3$%%61 ’/;ZDIMU
SV/TM/;DRGIU RNT/0/JDRG0GIG0NWDW/X’G$ q RG0;/UE0DI VMJE0GTD/I DI
?4")/ =),)(4S/0MI TEZMJV/YT=3k0GITk=NWD/0/JN! #!6’ ####
>##$"1
@GIJlMXMIJ! LGIJB/EIDGI! BE +/IJQEGI! )+/%3$%%71(W/0GTD/I /X
UM^M_DIMU S/0MI GIU RNT/0/JDRG0WTEUDMW/XT=MS/0MI DITDIMW/X?405*
;506)/0/ GIU ?4")/ Q4%*$04]GWT3@0/VG! $%5’ 55$ >5!%1
@E ]G/ND3#6681, VM2DMY /I RV/WWDIJZMTYMMI ZG;Z//WSMRDMWDI
’=DIGiiLD0DG;W \ +! AG;GIEPG A! AG/ , *3 OMIMTDR
MI=GIRM;MIT/XZG;Z//GIU VGTGI3 #WTMU3 (IUDG’ &RMIGVD/
kEZ0DRGTD/IW! 7: >673
-D+GIJ! O/IJ’=EINGI! LGIJ+GD3$%#%1A,"7 DWVMQEDVMU X/VS/WT^
;MD/TDRS/0MI UM2M0/S;MITDI P(,_/ */+48/3k0GIT]/0CD/0! :$"5$ ’
$"8 >$::1
-DE kMIJ! -DAED0D! H=GIJ-DGIJ! )+/%3$%%61-DSDU ;DRV/U/;GDI
S/0GVD‘GTD/I DWVMQEDVMU X/V*,KkF/_DUGWM^UMSMIUMITAo& WDJIG0DIJ
DI ?4")/ =),)(4S/0MI TEZMTDS JV/YT=3k0GIT\/EVIG0! "%"$$ ’ 5%5
>5#53
]GF3$%%81 ]/0MRE0GVJMIMTDRGIG0NWMW/X;DRV/WS/V/JMIMWDWGIU
;DRV/JG;MT/JMIMWDWDI X0/YMVDIJS0GITW3,IIE AM2k0GITCD/0! 8"’
565 >!5!1
]R’/V;DRd &3$%%!1’/ITV/0/X;G0MJG;MT/S=NTMUM2M0/S;MIT3k0GIT
’M0! #"’ &#!$ >͓
]R’/V;DRd &3#6651 ]G0MJG;MT/S=NTMUM2M0/S;MIT3k0GIT’M0! 8
"#%$ ’ #$"8 >#$:81
&DIJ= ]C! C=G0Gk-3$%%:1’/ITV/0/X;G0MJMV;^RM0UM2M0/S;MITDI
X0/YMVDIJS0GITW3CD/)WWGNW! $6"##$ ’ ##$! >##5$1
+YM0K! kGVd & l! -G0GIIM)3#6671,WN;;MTVDRUD2DWD/I GIU RM0^XGTM
UMTMV;DIGTD/I DI UM2M0/SDIJS/0MI3+VMIUWk0GIT&RD! 5"7$ ’ 5%8 >
5#%1
LE [DG/QDI! ’=MI +/IJ! H=MIJ]G/‘=/IJ! )+/%3$%%71(ITMJVGTD2M
SV/TM/;DRGIU RNT/0/JDRG0GIG0NWDW/XT=MMXMRTW/XM_TVGRM0E0GV’G$ q
DIX0E_/I ?405*;506)/0/ S/0MI TEZMUM2M0/S;MIT3\/EVIG0/X
kV/TM/;MAMWMGVR=! :"#%$ ’ !$66 >!5#$1
H=MIJ]G/‘=/IJ! CMRd ]GVTDIG! ]E0MV\MIW! )+/%3$%%61 ,RTDI
TEVI/2MVDWVMQEDVMU X/V;N/WDI U^MSMIUMIT;DT/R=/IUVDG0;/2M;MITW
DI 3(/;41$2*4*V//T=GDVW3k0GIT]DT/R=/IUVDG0]/TD/I! ! " " $ ’ #
>#!1
!责任编辑4徐4红"
#"#