全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
# $ % $ 年 # 月
林 业 科 学
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2345，# $ % $
小黑杨转几丁质酶基因及酶活性!
王志英% 6 张福丽%，# 6 王占斌%
（%5东北林业大学 6 哈尔滨 %7$$!$；#5 周口师范学院 6 周口 !""$$$）
关键词：6 小黑杨；转化；几丁质酶基因；几丁质酶活性
中图分类号：&8%95 !"；:;!<5 #6 6 6 文献标识码：,6 6 6 文章编号：%$$% = 8!99（#$%$）$# = $%!8 = $7
收稿日期：#$$9 = %% = %!。
基金项目：黑龙江省攻关项目（>?$"?<$<）、省重点基金项目（@A*$! = $%$%）、哈尔滨科技创新人才专项（#$$"B2:*$$7）资助。
!王占斌为通讯作者。
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6 6 小黑杨（ 7#9363) ).5#-.. C 7! -.:$(）是以小叶
杨为母本、欧洲黑杨为父本，经人工杂交后选种而得
（赵天锡等，%;;!），具有速生、适应性强、抗逆性强
及材质好等优点（周以良等，%;9"），是林业生产上
推广应用的优良品种之一。但是随着杨树的广泛栽
培，真菌病害的发生越来越严重，已经严重威胁到了
杨树生长。几丁质酶是植物在受到病原菌侵染时所
表达出的一组蛋白质，可水解真菌细胞壁的主要成
分———几丁质，从而抑制真菌的生长。当植物在受
到病原体入侵后，自身的几丁质酶等防卫蛋白在细
胞内积累，但这些蛋白往往表达量不足或是表达期
太晚，以致不能有效地使植物体免受病原菌危害。
将外源几丁质酶注入植物细胞中，可有效破坏病菌
的结构，阻止其侵入。而通过基因工程手段人为降
低植物体内几丁质酶的活性后，植物变得更易感病，
这些充分说明几丁质酶在植物抗病中的作用
（?/003N，%;98；吴志刚等，#$$#）。?N/GK3 等（%;;%）
将菜豆（7&()’#63) /36:($.)）几丁质酶基因转入烟草
（".8#%.(-( %#1(835 ）和油菜（<$()).8( -(93)），组成
型表达菜豆几丁质酶基因的转基因植株病情发展缓
慢，死苗率大大降低，这是首次报道的转几丁质酶基
因的植物具抗真菌病特性。另外大量的试验也表
明，植物中导入外源的几丁质酶基因后，其抗病性得
到明显提高（ @HK ’% (65，%;;!；+E43I ’% (65，%;;9；
?0IQQ30T ’% (65，%;;;；]ERER/O/ ’% (65，#$$$；^ILHIR/O/
’% (65，#$$#；(O/H ’% (65，#$$<；_/FTE0 ’% (65，#$$<；
&NIT3UI ’% (65，#$$<； +EVEHELHI ’% (65， #$$7；
*EFTEVKREN ’% (65，#$$8；&HIF ’% (6!，#$$9）。
目前，杨树基因转化主要集中在抗除草剂与抗
虫的研究上，对于抗真菌病的研究还很少。本研究
通过农杆菌介导把外源的几丁质酶基因导入小黑杨
体内，以期获得抗真菌病的小黑杨植株，并为其遗传
转化及抗性育种提供理论依据。
林 业 科 学 !" 卷 #
!" 材料与方法
$% $# 材料 # 小黑杨组培苗由东北林业大学森林病
虫害生物学实验室保存。携带菜豆几丁质酶基因的
中间表达载体 &’()、含植物表达载体的根癌农杆菌
（!"#$%&’()#*+, (+,)-&’*)./）*’+!!,! 均由哈尔滨师
范大学遗传学科惠赠。外源基因 ’0*(*.&/) 在植物表
达载体上的结构如图 $。
图 $# 质粒 -’() 结构
./01 $# 2()3456/( 73-73839656/:9 :; -<584/= -’()
分化培养基为：>2 ? ,% @ 40·* A $ "B’+ ? ,% $
40·* A $ C++；生根和继代培养基为：D&> ? ,% !
40·* A $ E’+，约 F, 天继代 $ 次。
$1 F# 方法 # $）卡那霉素和头孢唑林钠对叶片分化
的影响 # 选取培养 F, 天左右生长一致的健壮叶片，
横过主脉剪成（,% @ G $）(4 H（,% @ G $）(4 的叶块，
放入分别附加有选择性和抑菌性抗生素的分化培养
基上，每盘放 I 个叶块，每一浓度设 J 个重复，每周
更换 $ 次培养基，J 周时观察叶片变化。卡那霉素
的浓度分别设为 ,，@，$,，$@，F,，J,，!,，@,，",，
K,，L, 40·* A $。头孢唑林钠浓度分别设为 ,，$@,，
F,,，F@,，J,,，J@,，!,,，!@,，@,,，",,，K,,，
L,,，I,,，$ ,,,，$ $,, 40·* A $。确定头孢唑林钠对
农杆菌的抑制效果时，参考常玉广等（F,,!）和笔者
试验经验，使用临界浓度为 K,, 40·* A $。
F）农杆菌介导的几丁质酶基因转化 # 选择完
全展开、深绿色的小黑杨叶片，横过主脉剪成
（,% @ G $）(4 H（,% @ G $）(4 的叶块，放到 >2 分化
培养基上预培养 ,，F，J，!，@ 天或 K 天，然后浸入
到农杆菌菌液中进行侵染，侵染时间分别为 J，"，
$,，$@，$L，F, 4/9。取出侵染后的叶片用无菌滤
纸汲干菌液后，转入到 >2 固体培养基上，F@ M左右
暗培养 F，J，!，@ 天或 K 天。
J）转基因植株的分子检测 # 在 &NO 检测基础
上，对阳性植株进行 &NOB2:P6)379 检测和 OQB&NO
分析，以确定外源基因在转基因植株中的表达情况。
NQ+’ 法提取 OC+ 后用 OC583B.733 RC583 消化污
染的 RC+。OQB&NO 反应条件为 @, M 预变性
J, 4/9，I! M变性 F 4/9，I! M变性 J, 8，@@ M 扩增
J, 8，KF M延伸 $ 4/9，! M终止反应。引物：@’BSN+
SQS QSS ++S SN+ +SN +SBJ’和 @’BNQS +S+
SSQ S+N ++S SQN +SBJ’由上海生工合成。
!）转基因植株几丁质酶活性测定 # 采用氨基
葡萄糖法测定转基因植株叶片几丁质酶活性。首先
从转基因植株叶片中提取几丁质酶液，用紫外分光
光度计测 @J, 94 处的吸收值以确定外切酶活性及
总酶活性。根据标准曲线方程，将 TR 值换算成氨
基葡萄糖产量，以每小时分解胶体壳聚糖产生 $ !0
氨基葡萄糖为 $ 个酶活性单位。标准曲线方程为：
1 U JFI% LF2 A J% JF! I［2：TR 值；1：氨基葡萄糖量
（!0）；直线相关系数 # U ,% IIF J］，最后计算出内切
酶活性（内切酶活性 U总酶活性 A外切酶活性）。
#" 结果与分析
F% $# 卡那霉素和头孢霉素对叶片的影响 # 卡那霉
素对小黑杨叶片的分化和生长具有明显的抑制作
用。培养基中卡那霉素的含量小于 F, 40·* A $时叶
片变形，并在一定时间内呈现绿色，同时还不断伸长
变大，但再生能力受到抑制，产生的不定芽逐渐变
白；当卡那霉素浓度达到 J, 40·* A $时，叶片的分化
和生长都明显受到抑制，仅在叶片主脉的伤口处形
成极少量的芽；当达到 !, 40·* A $时，叶片黄化，无
再生芽形成，叶片不膨大、无愈伤；浓度再增加时，
叶片就会逐渐变褐、死亡（图 F）。从试验中可知，!,
40·* A $的卡那霉素完全可以抑制小黑杨叶片芽的
分化，故确定 !, 40·* A $的卡那霉素为叶片转化筛
选的临界浓度。
图 F# 卡那霉素对小黑杨叶片分化的影响
./01 F# V;;3(6 :; W5954X(/9 :9 <35; =/;;37396/56/:9 :;
3$4+5+/ /*,$.** H 36 .*"#&
接种在 >2 培养基（附加有不同浓度头孢霉素）
上的小黑杨叶片经过 F, 天的生长，除接种在含头孢
唑林钠 $ ,,,，$ $,, 40·* A $培养基上的叶片稍微发
黄外，其余浓度培养基上的叶片均正常生长，与对照
L!$
! 第 " 期 王志英等：小黑杨转几丁质酶基因及酶活性
基本保持一致，说明小黑杨叶片对头孢唑林钠具有
一定抗性，筛选培养时加入 #$$ %&·’ ( )的头孢霉素
不会对小黑杨叶片分化产生显著影响。
"* "! 预培养时间对叶片分化和转化的影响 ! 虽然
随着预培养时间的延长小黑杨叶片分化率逐渐提
高，但转化率却未随分化率的增加而增加。预培养
时间 " 天以下分化率和抗性芽率均较低，预培养时
间为 + , - 天二者的变动比较一致，其中 - 天时抗性
芽率达到 "* $. /，分化率为 )"* 0/。预培养大于
- 天分化率显著增加，但抗性芽率却有减少的趋势，
其中 0 天时分化率和抗性芽率分别为 )+* #/ 和
)* )./。这可能由于，随着预培养时间的延长，叶片
边缘细胞已经出现芽的分化。但同时，伤口修复时
间过长时，不利于农杆菌从伤口侵入，从而降低转化
率。不经过预培养直接用于侵染时，也能得到转化
植株。通过比较确定小黑杨遗传转化时预培养的时
间以 + , - 天为最好。
"* +! 侵染时间对叶片分化和转化的影响 ! 侵染
+ %12以下时，"$$ %&·’ ( )的头孢霉素完全抑制了农
杆菌的生长，叶片不能分化；侵染 + , - %12 时，虽有
少量的叶片分化，但卡那霉素抗性芽率为 $；侵染时
间 3 , )0 %12 时，叶片的分化和卡那霉素抗性芽明
显增多；达到 )0 %12 时，不 仅 叶 片 分 化 增 多
（)+* 0+/），抗性芽率也达到 -* )#/；侵染时间再
增加，分化率和抗性芽率都迅速下降，其中侵染时间
为 ). %12 时，分化率和抗性芽率分别为 "* ")/ 和
$* $3/；达到 "$ %12 时，由于菌液毒害作用使叶片
很快褐化或死亡，无叶片分化和抗性芽形成。同时，
侵染时间过长头孢无法抑制农杆菌的生长，从而导
致叶片坏死。结果表明，侵染时间控制在 3 , )0 %12
时对小黑杨叶片的遗传转化比较适合。
"* -! 共培养时间对叶片分化和转化的影响 ! 共培
养 "，+，- 天小黑杨叶片的分化率分别为 .* 0/，
)0* +/ 和 )+* ./，而 抗 性 芽 率 分 别 为 )* $./，
+* $4/，"* 4+/。共培养 0 天和 # 天分化率分别为
)-* #3/和 )3* 3/，但抗性芽率为 $。这是因为共培
养时间过长，大量的黄化芽经不起随后卡那霉素的
筛选作用而逐渐白化，最终死亡。因此，对于小黑杨
叶片的遗传转化，共培养时间在 " , - 天 时比较合
适，以 + 天最好。
"* 0! 56789:;<=>?2 杂交检测及 7@8567 分析 ! 对
567 检测呈阳性的植株进行了 56789:;<=>?2 杂交
检测。结果表明，被检测样品与阳性对照均显示出
较强的杂交信号（图 +），而非转基因植株无杂交信
号。说明外源几丁质酶基因已经成功导入并整合进
小黑杨的基因组中。
图 +! 转基因植株的 56789:;<=>?2 杂交检测
A1&B +! 56789:;<=>?2 =CD?1E1FG<1:2 GHHGC
:I 21J KLG2)：MNO %G?P>?；"：非转基因植株 N:28E KLG2<；
+：质粒阳性对照 5LGH%1E MNO GH K:H1<1Q> J:2- ( )$：转基因植株 @?G2H&>21J KLG2在进行 7@8567 扩增之前，要用无 7NGH> 的
MNGH>!处理提取的 7NO 样品，目的是去除总 7NO
中的 MNO 污染。在确定所提取的 7NO 样品中不存
在 MNO 污染后，用于 7@8567 扩增。7@8567 扩增
结果见图 -，泳道 J 为阴性对照，+，-，#，4 和 )+ 无预
期条带出现，可能是外源基因在转录水平上发生了
沉默现象。)，"，0，3，.，)$，))，)" 都扩增出了预期
的条带（) PD）。7@8567 扩增结果表明，. 株转基因
植株中几丁质酶基因已在转录水平上稳定表达，进
一步证实了外源几丁质酶基因已整合进小黑杨的基
因组中。
图 -! 转基因植株 7@8567 分析
A1&B -! 7@8567 G2GLCH1H :I 21J KLG2J：对照 6:2H1H"* 3! 转基因植株几丁质酶活力测定与分析 ! 检测
的 )+ 株转基因苗木中有 4 株叶片几丁质酶活性明
显高于对照植株（6R，非转基因植株）（图 0），其中
)) 号植株与对照的酶活性比值高达 +* $4+。部分转
基因植株（+ 号、- 号、# 号和 )+ 号）几丁质酶活性低
于对照。这可能是因为外源基因在受体中没有表
达，发生了基因沉默（失活）现象，沉默（失活）的原
因可能是外源基因插入到了甲基化程度高、转录活
性低的异染色质上，或是被植物的限制修饰系统识
别，通过甲基化使之失活，此现象有待于进一步的试
验分析。
4-)

! 第 " 期 王志英等：小黑杨转几丁质酶基因及酶活性
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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