全 文 ：第 49 卷 第 10 期
2 0 1 3 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 10
Oct．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20131026
收稿日期: 2013 － 05 － 13; 修回日期: 2013 － 06 － 27。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30271082; 30571496) ; 高等学校博士学科点专项科研基金项目(20050466003 ) ; 河南省杰出人才计
划项目(122101110700)。
* 范国强为通讯作者。
豫杂一号泡桐二倍体及其同源四倍体的 AFLP和 MSAP分析*
张晓申 范国强 赵振利 曹喜兵 赵改丽 邓敏捷 董焱鹏
(河南农业大学泡桐研究所 郑州 450002)
关键词: 豫杂一号泡桐; 二倍体; 同源四倍体; AFLP; MSAP
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)10 － 0167 － 06
Analysis of Diploid and Its Autotetraploid Paulownia tomentosa ×
P． fortunei with AFLP and MSAP
Zhang Xiaoshen Fan Guoqiang Zhao Zhenli Cao Xibing Zhao Gaili Deng Minjie Dong Yanpeng
( Institute of Paulownia，Henan Agricultural University Zhengzhou 450002)
Abstract: The DNA base sequences and the methylation of diploid and the corresponding autotetraploid seedlings of
Paulownia tomentosa × P． fortunei were investigated with the amplified fragment length polymorphism (AFLP) and the
methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) molecular markers． The result indicated that average 50 to 70
bands were amplified with each pair of AFLP primers and the fragment length was less than 500 bp． The DNA base
sequences of diploid P． tomentosa × P． fortunei were identical to its autotetraploids． The products of MSAP amplification
were from 100 to 500 bp and contained 2 093 and 2 217 restriction sites in the diploid and the corresponding
autotetraploid，respectively． Their methylated sites accounted for 36. 41% and 39. 78% ( where fully methylation rate
were 12. 85% and 14. 98% )，separately． In the autotetraploid，21. 89% DNA methylation patterns changed compared to
its diploid，and the global DNA methylation level was higher than its diploid．
Key words: Paulownia tomentosa × P． fortunei; diploid; autotetraploid; AFLP; MSAP
植物多倍化既是对自然环境适应的结果，也是
推动其进化和物种形成的重要因素。自然界大约
70%的被子植物在进化史中经历过一次或多次多倍
化过程(Masterson，1994; Wendel，2000)。多倍体
植物具有器官和生物量增大的特征及较强适应生物
和非生物胁迫的能力(Hilu，1993; Liu et al．，2002)。
植物多倍化过程中，在染色体结构 ( Swapna et al．，
2010; Song et al．，1995; Pires et al．，2004; Pontes et
al．，2004)和基因表达模式等发生变化 ( Lu et al．，
2006; Adams et al．，2003; Kashkush et al．，2002;
Adams et al．，2004)的同时，也发生了 DNA 甲基化
变化 ( Levy et al．，2004; Liu et al．，2003; Wang et
al．，2004)。研究表明，拟南芥(Arabidopsis thaliana)
(Madlung et al．，2002 )、小麦 ( Triticum aestivum )
(Shaked et al．，2001; Han et al．，2003)、水稻(Oryza
sativa) ( Zhang et al．，2006 )、陆地棉 ( Gossypium
hirsutum) ( Keyte et al．， 2006 ) 和 黄 瓜 ( Cucumis
sativus) (Chen et al．，2008) 多倍化后，DNA 甲基化
水平和甲基化模式都发生了变化。然而，有关 DNA
甲基化与多倍化关系研究多集中在草本植物
(Ochogavia et al．，2009; Rodriguez et al．，2012)，而
有关木本植物的相关研究则较少(胡宝全等，2011;
Bao et al．，2011)。泡桐(Paulownia)是中国重要的
速生用材和绿化树种之一，因其独特的生物学特性，
能与农作物间作形成独特的生态复合系统，为农作
物高产稳产提供了重要生态保障。但因其种质资源
匮乏、遗传背景窄等，目前利用现有的二倍体种质资
源很难培育出符合人们意愿的泡桐新品种。近年
来，不同四倍体泡桐新种质的成功诱导(范国强等，
2006; 2007a; 2007b; 2009; 2010; 赵 振 利 等，
2011)，一方面扩大了泡桐的遗传背景，另一方面也
为筛选泡桐新品种提供了材料支撑。过去，虽然开
林 业 科 学 49 卷
展过四倍体泡桐叶片结构、生长和木材特性等方面
研究工作(张晓申等，2012; 翟晓巧等，2012)，但至
目前国内外还未见四倍体及其二倍体泡桐遗传关系
相关文章的报道。为了解二倍体及其同源四倍体泡
桐遗传差异及 DNA 甲基化的作用，本文利用 AFLP
和 MSAP 分 子 标 记 技 术，研 究 豫 杂 一 号 泡 桐
(Paulownia tomentosa × Paulownia fortunei)二倍体
及其同源四倍体 DNA 序列及甲基化变化，以期为阐
明泡桐四倍体优良特性的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料 试验材料为河南农业大学泡桐研
究所经体胚发生途径获得、培养 30 天的豫杂一号泡
桐二倍体及其同源四倍体组织培养苗。剪取适量生
长状况良好、大小一致幼苗长约 0. 5 cm 的顶芽，用
液氮速冻后放于 － 86 ℃冰箱内备用。组培苗培养
条件为: 温度 ( 25 ± 2 )℃，光照强度 130 μmol·
m － 2 s － 1，光照时间每天 16 h。
图 1 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 的 AFLP 扩增产物部分 SDS-PAGE
Fig． 1 SDS-PAGE of partial AFLP amplification products of the diploid and autotetraploid plants
M: Marker; 1，2，3，…，23，24: 引物编号 Primer code．
1. 2 试验方法 1) DNA 提取 泡桐 DNA 提取参
照张延召等(2009)方法。
2)AFLP 和 MSAP 扩增 上述豫杂一号泡桐二
倍体及其四倍体 DNA 的 AFLP 和 MSAP 扩增所需
96 对引物组合的碱基序列和扩增程序及其产物的
电泳分别参照曹喜兵等(2010; 2012)的方法。
3)电泳凝胶的谱带分析 电泳结束后，对用硝
酸银染色的胶板谱带进行统计分析。统计分析中，
H 和 M 分别为 EcoRⅠ /HpaⅡ和 EcoRⅠ /MspⅠ双酶
切产物电泳谱带。每一条谱带代表一个酶切位点。
将谱带有或无分别记作 1 或 0。每个 DNA 样品的 H
和 M 扩增谱带可划分为 4 种: 种类 I (H，M = 1，
1)，无甲基化发生; 种类Ⅱ(H，M = 1，0)，单链 DNA
外甲基化; 种类Ⅲ(H，M = 0，1)，双链 DNA 内甲基
化; 种类Ⅳ (H，M = 0，0 )，双链 DNA 外甲基化。
DNA 甲基化类型分为多态性和单态性。DNA 多态
性类型包括 A(甲基化) 型、B (去甲基化) 型和 C
(不定) 型。其中，A 型中的 A1 和 A2 代表 DNA 重
新甲基化(对照样 H 和 M 泳道均有带，而处理样仅
H 或 M 泳道有带)，A3 和 A4 代表 DNA 超甲基化
(对照样仅 H 或 M 有 1 条带，而处理样 H 和 M 泳道
都没带); B 型(Bl，B2，B3 和 B4)代表 DNA 去甲基
化，DNA 甲基化谱带与 A 型相反; C 型代表 DNA 甲
基化的不确定性(对照样与处理样 DNA 甲基化差
异谱带无法确定)。单态性类型为 D 型(D1，D2 和
D3)(对照样与处理样间 DNA 谱带相同)。同时，计
算样品的总 DNA 甲基化水平［(种类Ⅱ + 种类
Ⅲ) /(种类 I + 种类Ⅱ + 种类Ⅲ) × 100%］和总
DNA甲基化多态性［(A + B + C) /(A + B + C + D) ×
100%］及 DNA单态性［D /(A + B + C + D) ×100%］。
2 结果与分析
2. 1 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 碱基序
列变化 由豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA
的 AFLP 扩增结果(图 1)可以看出，豫杂一号泡桐
二倍体及其四倍体 DNA 利用同一引物均可在相同
位置扩增出谱带，即豫杂一号泡桐二倍体与其四倍
体 DNA 的 AFLP 酶切位点没有发生变化，每对引物
861
第 10 期 张晓申等: 豫杂一号泡桐二倍体及其同源四倍体的 AFLP 和 MSAP 分析
平均可扩增出 50 ～ 70 条谱带，并且扩增出片段长度
均小于 500 bp。虽然豫杂一号泡桐二倍体及其四倍
体 DNA 经不同引物扩增后产生的片段大小和数量
存在一定的差异，但四倍体及其二倍体泡桐 DNA 经
同一引物扩增后产生了数量和长度相同的 DNA 片
段。该结果说明，豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体
DNA 碱基序列在 AFLP 水平上相同。
2. 2 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体总 DNA 甲基
化变化 1 )豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体总
DNA 甲基化水平变化 豫杂一号泡桐二倍体及其
四倍体的 MSAP 电泳谱带统计结果(表 1)表明，二
倍体总 DNA 甲基化水平低于四倍体泡桐。豫杂一
号泡桐二倍体有 MSAP 扩增位点 2 093个，其中，
DNA 全甲基化位点 269 个 (占总扩增位点 的
12. 85% )，DNA 半甲基化位点 493 个(占总扩增位
点的 23. 55% )，DNA 总甲基化位点 762 个(占总扩
增位点的 36. 41% )。豫杂一号泡桐四倍体 MSAP
扩增位点总数为 2 217 个，其中，DNA 全甲基化位点
332 个(占总扩增位点的 14. 98% )，DNA 半甲基化
位点 550 个(占总扩增位点的 24. 81% )，DNA 总甲
基化位点 882 个(占总扩增位点的 39. 78% )。也就
是说，豫杂一号泡桐四倍体总 DNA 甲基化水平高于
其二倍体的 DNA 甲基化水平。此外，豫杂一号泡桐
二倍体及其四倍体 DNA 甲基化(CCGG 位点)均以
双链甲基化为主，并且豫杂一号泡桐四倍体总 DNA
全甲基化和半甲基化水平皆高于其二倍体。该结果
说明，豫杂一号泡桐二倍体染色体加倍形成的四倍
体植株的 DNA 发生了甲基化修饰。
表 1 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 甲基化水平
Tab． 1 DNA methylation levels between diploid and autotetraploid Paulownia tomentosa × P． fortunei
倍性
Ploidy
扩增总带数
Total number of
amplified bands
种类Ⅰ谱带
Number of typeⅠ
种类 II 谱带
Number of type II
种类 III 谱带
Number of type III
DNA 甲基化总谱带
Total number of DNA
methylated bands
总 DNA 甲基化水平
Global DNA
methylation level
2 × 2 093 1 331 269 493 762 36. 41
4 × 2 217 1 335 332 550 882 39. 78
图 2 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体的 DNA 甲基化模式
Fig． 2 DNA methylation patterns of the diploid and autotetraploid plants
H、H1 分别表示二倍体(2 × )、四倍体(4 × )豫杂一号泡桐基因组 DNA 经 HapⅡ /EcoRⅠ酶切所产生的扩增结果; M、M1 分别表
示二倍体(2 × )、四倍体(4 × )豫杂一号泡桐基因组 DNA 经 MspⅠ /EcoRⅠ酶切所扩增结果; 箭头指示不同的 DNA 甲基变化类
型(与表 2 中的相对应) ; E1 /HM ( 4 ，…，56)指示引物组合。
H and H1，respectively，indicated that total DNA of diploid(2 × ) and autotetraploid(4 × )was digested by HapⅡ /EcoRⅠ; M and M1，
respectively，indicated that total DNA of diploid (2 × ) and autotetraploid ( 4 × ) was digested by MspⅠ /EcoRⅠ; arrows indicated the
different changes of DNA methylation patterns in Tab． 2; E1 /HM ( 4 ，…，56) indicated primer combination．
2)豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 的甲
基化模式变化 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体
DNA 分别经 HapⅡ /EcoRⅠ和 MspⅠ /EcoRⅠ酶切
后，MSAP 扩增产物的电泳结果(图 2、表 2 和表 3)
表明，豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 甲基化
模式存在一定差异。四倍体 DNA 甲基化(A 型)位
点数为 204，占总甲基化多态性位点数的 9. 97%，去
甲基化(B 型)位点数为 235，占总甲基化多态性位
点数的 11. 48%。与二倍体相比，四倍体 DNA 甲基
化多态性为 21. 89%，DNA 甲基化单态性的为
961
林 业 科 学 49 卷
78. 11%。也就是说，豫杂一号泡桐二倍体 DNA 甲 基化模式发生变化频率高于其同源四倍体。
表 2 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体 DNA 甲基化模式①
Tab． 2 DNA methylation patterns between diploid and autotetraploid Paulownia tomentosa × P． fortunei
酶切 Digestion
DNA 甲基化状态变化
Change of DNA methylation status
DNA 甲基化差异谱带数
Number of band differentiation
H M H M 2 × 4 × (2 × ) － (4 × )
带型
Band pattern
1 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
17 A1
1 1 1 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
26 A2
0 1 0 0
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
59 A3
1 0 0 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
102 A4
0 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
89 B1
1 0 1 1
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
45 B2
0 0 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
71 B3
0 0 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
30 B4
0 1 1 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
9 C
1 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
1 181 D1
1 0 1 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
76 D2
0 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
342 D3
① C and CC: 甲基化胞嘧啶 Cytosine methylation．
表 3 豫杂一号泡桐二倍体及其四倍体的 DNA 甲基化状态
Tab． 3 DNA methylation level between diploid and autotetraploid Paulownia tomentosa × P． fortunei
倍性
Ploidy
甲基化带数
Total methylated
bands
A 型 Type A B 型 Type B C 型 Type C D 型 Type D
带数
Bands
比率
Ratio(% )
带数
Bands
比率
Ratio(% )
带数
Bands
比率
Ratio(% )
带数
Bands
比率
Ratio(% )
(2 × ) － (4 × ) 2 047 204 9. 97 235 11. 48 9 0. 44 1 599 78. 11
3 讨论
同源四倍体植株通常是由其二倍体经化学诱变
染色体加倍形成的，具有器官和生物量增大的明显
特征及较强适应生物和非生物胁迫的能力 (Hilu，
1993; Liu et al．，2002)，这些变化必然与染色体加
倍后植物 DNA 的变化有一定的联系。植物染色体
加倍前后，DNA 碱基序列及其甲基化变化情况，不
同研究者得出的结果不完全相同。刘文革等
( 2004 ) 利 用 AFLP 分 析 发 现，西 瓜 ( Citrullus
lanatus)同源四倍体较其二倍体分别有特异 DNA 片
段的增加和消失; 王卓伟等(2002)用 AFLP 比较桑
树(Morus alba)二倍体与其同源四倍体的结果表
明，二者的 DNA 碱基序列也发生了一定程度的改
变。黄瓜二倍体及其同源四倍体的研究结果也是如
此(张晓青等，2006)。但焦锋等 (2001)用 RAPD
分析了桑树二倍体及其同源四倍体的 DNA 指纹后
没有发现差异条带; 林强等(2011)利用 RAPD 分析
后认为农桑 8 号 (Morus‘Nongsang 8’)和湖桑 199
号(Morus‘Husang 199’)同源四倍体与其二倍体
DNA 指纹图谱相同; 聂丽娟等(2009)利用 AFLP 没
有检测到西瓜二倍体及其同源四倍体 DNA 碱基序
列间的变化; 马铃薯( Solanum tuberosum)染色体加
倍前后 DNA 碱基序列也没有发生变化 ( Stupar et
al．，2007)。本研究中，利用 AFLP 分析发现，豫杂一
号泡桐二倍体及其染色体加倍后的 DNA 碱基序列
没有发生变化，这可能是由于豫杂一号泡桐四倍体
诱导过程中秋水仙碱用量较小，没有引起染色体重
叠、不等交换及突变等的缘故。不同研究者试验结
果间出现差异的原因可能有以下二方面: 第一，不
071
第 10 期 张晓申等: 豫杂一号泡桐二倍体及其同源四倍体的 AFLP 和 MSAP 分析
同研究者在诱导同源四倍体过程中使用诱变剂的剂
量存在一定差异。如果诱变剂浓度过大，必然引起
DNA 结构的破坏，导致同源四倍体染色体的重组、
不等交换及突变等情况的发生，从而出现 DNA 谱带
的变化(Stupar et al．，2007); 第二，不同研究者使用
的材料在诱变后的时间跨度上不同。植物染色体加
倍后，造成植株细胞内出现了核质不平衡等问题，但
植株又要适应外部环境条件，这就往往迫使植物作
出适当的形态和遗传变化 ( Finnegan et al．，2000;
Martelotto et al．，2005; 2007)，最后表现在 DNA 结
构和表观遗传学的变化。同源四倍体诱导后的时间
越短，DNA 碱基序列的一致性越高，用 AFLP 等分子
标记技术检测出差异性的可能性越小，但由于染色
体加倍造成的 DNA 甲基化变化始终存在，故出现
MSAP 片段多态性是必然的(王春国等，2009); 同
源四倍体诱导后的时间跨度越大，DNA 碱基序列的
变化几率越大，故较容易用 AFLP 和 MSAP 技术检
测出植物染色体加倍前后 DNA 碱基序列及其甲基
化的变化(胡宝全等，2011; Ochogavía et al．，2009;
Bao et al．，2011; Rodriguez et al．，2012)。本研究中，
虽然同源四倍体泡桐 DNA 碱基序列没有发生改变，
但与其二倍体泡桐相比，DNA 甲基化水平及其甲基
化模式都发生了变化，并且株型及抗性也发生了改
变(张晓申等，2012; 翟晓巧等，2012)。据此认为
同源四倍体泡桐 DNA 甲基化可能是其形态等性状
未呈现二倍体倍增效应的原因之一。此外，尽管目
前 AFLP 分子标记技术较能准确反映 DNA 碱基序
列的变化，但毕竟检测的仍是 DNA 片段。因此，要
证明二倍体及其同源四倍体间 DNA 碱基序列是否
发生变化还需在单碱基 ( SNP) 水平上开展研究
工作。
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(责任编辑 徐 红)
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