以毛白杨花芽为材料, 采用RT-PCR技术分离克隆毛白杨PtLFYcDNA序列, 测序结果表明该序列全长1 314 bp, 包含1个开放阅读框，编码377个氨基酸。 Alignment分析显示该基因与拟南芥等物种LFY/FLO同源基因所编码的氨基酸相似性达到68％～75%。蛋白结构预测分析表明，在PtLFY蛋白N-端和C-端具有2个高度保守的区域，其中PtLFY-C端由7个α-helix组成Helix-turn-helix结构。采用Real-time qRT-PCR技术检测PtLFY在雌雄花芽发育过程中的表达模式，结果显示从9月13日到翌年1月25日, PtLFY在毛白杨雌雄花芽中持续稳定表达, 到2月25日表达量少许下调，但该基因在雄花芽中的相对表达量明显高于雌花芽。解剖分析结果表明，雄花芽形态分化进程明显早于雌花芽，这种差异可能与PtLFY在雌雄花芽发育过程的差异表达存在密切联系。研究结果对于阐明PtLFY在毛白杨雌雄花芽发育和开花中的分子作用机制具有重要的理论意义，为进一步开展毛白杨开花调控研究奠定基础。
A full-length cDNA denominated PtLFY was obtained from Populus tomentosa using RT-PCR technique. PtLFY is 1 314 bp and contains an open reading frame encoding a 377 amino acid polypeptide. Sequence analysis by blast showed that PtLFY shares 68%-75% homology in amino acid sequence with that encoded by Arobidopsis LFY and other species LFY/FLO homologues. It was found that PtLFY protein contains 2 conserved domains at N-terminal and C-terminal by alignment analysis. PtLFY-C region consists of a seven-α helix fold structure that binds target promoter DNA elements. The expression patterns of PtLFY in developmental floral buds were examined using real-time quantitative RT-PCR. The result showed that the continuous and stable transcripts of PtLFY were detected in both male and female floral buds of P.tomentosa from September 13th to January 25th, and then a slight decline was detected on February 25th. The relative expression of PtLFY in male floral buds was obviously much higher than that in female floral buds. The anatomical results showed that initiation and differentiation of male floral buds were obviously earlier than female floral buds. It revealed that there is close relationship between expression of PtLFY and morphological differentiation of floral buds in P.tomentosa. This study shed light on the molecular mechanism of PtLFY in development of both male and female floral buds and flowering in P.tomentosa, and the knowledge will benefit regulation of flowering.
全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
# $ % $ 年 # 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01 !"，*/1 #
2345，# $ % $
毛白杨 !"#$%在花芽发育中的
表达模式与花芽形态分化!
安新民6 王冬梅6 王泽亮6 王静澄6 曹冠琳6 薄文浩6 张志毅
（北京林业大学 6 林木育种国家工程实验室 6 林木花卉遗传育种教育部重点实验室 6 北京 %$$$78）
摘 6 要：6 以毛白杨花芽为材料，采用 9+:;’9 技术分离克隆毛白杨 !"#$% <=*, 序列，测序结果表明该序列全长
% 8%! 4>，包含 % 个开放阅读框，编码 8?? 个氨基酸。,0@ABC3BD 分析显示该基因与拟南芥等物种 #$% & $#’ 同源基
因所编码的氨基酸相似性达到 "7E F ?GE。蛋白结构预测分析表明，在 ;D-2H 蛋白 * I端和 ’ I端具有 # 个高度
保守的区域，其中 ;D-2H:’ 端由 ? 个 !:J30@K 组成 L30@K:DMNB:J30@K 结构。采用 93O0:D@C3 P9+:;’9 技术检测 !"#$% 在
雌雄花芽发育过程中的表达模式，结果显示从 Q 月 %8 日到翌年 % 月 #G 日，!"#$% 在毛白杨雌雄花芽中持续稳定表
达，到 # 月 #G 日表达量少许下调，但该基因在雄花芽中的相对表达量明显高于雌花芽。解剖分析结果表明，雄花
芽形态分化进程明显早于雌花芽，这种差异可能与 !"#$% 在雌雄花芽发育过程的差异表达存在密切联系。研究结
果对于阐明 !"#$% 在毛白杨雌雄花芽发育和开花中的分子作用机制具有重要的理论意义，为进一步开展毛白杨开
花调控研究奠定基础。
关键词：6 毛白杨；!"#$%；表达模式；花芽；形态分化；P9+:;’9
中图分类号：&?%71 !"；RQ!81 #6 6 6 文献标识码：,6 6 6 文章编号：%$$% I ?!77（#$%$）$# I $$8# I $?
收稿日期：#$$Q I $Q I %7。
基金项目：国家自然科学基金（8$G?%G%%），国家“Q!7”项目（#$$" I ! I ?#）和教育部重点项目（%$7$%?）资助。
!张志毅为通讯作者。
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=%> 8($1&：6 !+B>->; "+<0,"+;)；!"#$%；3K>N3]]@/B >N/Z@0@BA；Z0/NO0 4M[]；C/N>J/0/A@
派树种，雌雄异株，但偶见雌雄同株现象（张志毅
等，%QQ#）。在开花发育方面，董源（%Q7#；%Q7!）就
进行了毛白杨的胚胎学观察研究；朱大保（%QQ$）对
! 第 " 期 安新民等：毛白杨 !"#$% 在花芽发育中的表达模式与花芽形态分化
毛白杨的有性生殖能力进行了研究；张志毅等
（#$$"；"%%%）先后对毛白杨开花结实特性和三倍体
毛白杨的有性生殖能力进行了研究。杨树作为木本
模式树种，与拟南芥（&’()*+,-.*. "/(0*(1(）有许多不
同之处，杨树具有多年生、童期长达 & ’ #% 年、生命
周期长达 #%% ’ "%% 年等特点（()**+,- 2" (0.，#$$/）。
另外杨树在生命中首次经历开花事件后，一年一次
的季节性开花现象伴随杨树的整个生殖阶段
（012--) 2" (0.，"%%3）。这些特点决定了杨树具有自
身的花发育规律。杨树的花结构也不同于拟南芥等
模式植物具有的四轮花器官结构，仅由苞片和雄蕊
或雌蕊两轮结构组成（ 45-66*)7 2" (0.，"%%%），这种
结构差异的分子机制尚不清楚。早在 "% 世纪 $% 年
代初，有关花分生组织特征基因和花器官特征基因
在拟南芥、金鱼草（&1"*’’/*134 4(53.）等许多植物中
相继被分离（42518+9 2" (0.，#$$#；:;-, 2" (0.，#$$%）。
这些基因的发现，使得人们对植物的成花和花器官
的发生与发育机理的认识进入到分子水平。作为花
分生组织特征基因，#6&$%（ #$%）控制拟南芥花序
梢分生组织向花分生组织的转变（<-=>-8 2" (0.，
#$$"；#$$?；@-A* 2" (0.，"%%#）。#$% 的表达水平被
认为是开花转变的关键因子（B=8CC;, 2" (0.，#$$D）。
尽 管 E;++F*,, 等（ "%%%）从 毛 果 杨（ !,-303.
"’*7/,7(’-(）中分离克隆了 !8#$ 基因，并在杨树和
拟南芥中进行了转化研究，但杨树 #$% 同源基因在
花芽发育过程的表达模式尚不清楚，关于该基因的
表达与杨树花芽分化关系的研究还未见报道。为此
开展毛白杨 #$% 同源基因 2GBH 的克隆及其表达规
律的研究，并对毛白杨雌雄花芽的形态分化规律进
行解析，分析毛白杨 #$% 同源基因的表达与花芽分
化的内在关系，对于揭示毛白杨开花的分子调控机
制具有重要的理论意义，为进一步通过基因工程手
段实现缩短育种周期和抑制杨树花粉与飞絮污染的
研究奠定基础。
#! 材料与方法
!" !# 材料
供试毛白杨雌雄成年植株定植于北京林业大学
苗圃，分别采集不同发育阶段的雌雄花芽，一部分固
定在 IHH 固定液中于 J K保存，用于花芽形态解剖
观察分析，另一部分液氮速冻贮于 L &% K冰箱中，
用于 EBH 提取。
表 !# 用于毛白杨 !"#$% 基因克隆和 $%&’($ 分析的引物
%)*+ !# ’($ ,-./0-1 2103 .4 5674.48 79 !"#$% )43 $%&’($ )4)6:1.1
编号
B;.
引物序列
@)=F-) C-M1-,2-
退火温度
H,,-*8=,> +-F6-)*+1)- N K
说明
G-C2)=6+=;,
@#O ?P L Q:RR:H:RHRRR:HRHQHRHQHQR L 3P
/%
用于 !"#$% 2GBH 的分离
@#G ?P L QQHRHR::QQQHHR:HQHQ:HQRHQ L 3P I;) =C;8*+=;, ;S !"#$% 2GBH
@"O ?P L RQQQ:Q:QRHRRHR::HRQH:HR: L 3P
??
用于 !"#$% EQT@:E 分析
@"G ?P L :QQHRQRRRR:HQQQQQ:Q::::Q L 3P I;) EQT@:E *,*8UC=C ;S !"#$%
@3O ?P L :QR:::RQQR:Q:QRHQRHQQ:H L 3P
??
#D4 )EBH 引物用作 EQT@:E 内参
@3G ?P L ::QQRRHQRQRRQHR::RQQQ:Q L 3P #D4 )EBH 1C-7 S;) )-S-)-,2- =, EQT@:E *,*8UC=C
!" ;# 方法
#V "V #! !"#$% 2GBH 的克隆和测序 ! 雌雄花芽总
EBH 的提取采用改良的 :QH( 法（ :5*,> 2" (09，
#$$3），逆转录与 2GBH 第 # 链的合成按照 4WHEQ
XY 2GBH Z=[)*)U :;,C+)12+=;, \=+（(G :8;,+-25）说明
书进行。?% !Z @:E 反应体系包括 # !Z 2GBH 第 #
链，各 %V " !F;8·Z L #上游引物 @#O 和下游引物 @#G
（表 #），# ] @:E 反应缓冲液，" FF;8·Z L # W>:8"，"%%
!F;8·Z L # 7BQ@C 和 " 单位 8(: GBH 聚合酶。@:E
循环条件为 $J K 预变性 3 F=,，最后 &" K 延伸
& F=,，$J K变性 3% C，/% K退火 3% C，&" K 延伸
J% C，共进行 3? 轮循环。GBH 序列委托上海生工生
物工程技术服务有限公司测定。GBH 序列分析采
用 4-M H=7 "和 (=;-7=+ 软件包进行。
#V "V "! 序列同源性分析与蛋白结构预测 ! #$% 同
源基因氨基酸序列来自 R-,(*,^（ 5++6：N N ___.
,2[=. ,8F. ,=5. >;‘ N -,+)-9 N M1-)U. S2>=），H8=>,F-,+ 分
析采用 :ZO4QHZa#V D# 进行，@+ZI0 蛋白二级结构
预测采用 HBQbc@EdQ "%%% Y/V % 软件进行，保守
序列和功能域分析采用 ce@H4U 软件（ 5++6：N N 2,.
-e6*CU. ;)> N）（R*C+-=>-) 2" (0.，"%%3），@+ZI0 蛋白
三级结构预测分析采用 3GTfXR4H< "V %（ 5++6：N N
[FF. 2*,2-))- C-*)251^. ;)> N ’ 37g=>C*_ N），进一步
采用 E*CW;8 Y "V &V "V # 进行优化。
#V "V 3! E-*8T+=F- MEQT@:E 分析 ! 按照 :5*,> 等
（#$$3）的方法，分别提取毛白杨不同发育时期雌雄
花芽的总 EBH，用 Eh# GB*C- X（ @);F->*）对总
EBH 进行处理以去除 GBH 污染。EBH 浓度的测定
采用 4@c\dZ #3%% C6-2+);65;+;F-+-)（ f-,*）。根据
416-)42)=6+QW XXX @8*+=,1F&E Q_;T4+-6 MEQT@:E \=+
33
林 业 科 学 !" 卷 #
$%&’ ()*+&+ ,-../（ 0/1%&-23./）说明，分别取预处理
后不同样品总 +45 6 !3，进行 7845 第 6 链合成，
然后将第 6 链 7845 稀释 9 倍作为 :;+ 的反应模
板，进行 <:;+ 反应。=> !? <:;+ 反应体系包括
6 !?稀释 9 倍的 7845 第 6 链，各 >@ = !A2B·? C 6上
游引物 :=D 和下游引物 :=8（表 6），6> !? = E
()*+ ,-../ :;+ FGH&.- F%I（ 0/1%&-23./），反应在
J:K0;J4=（FL -.H.G-7’）中进行。<+KM:;+ 热循环
条件为 9> N，O! N各 = A%/，最后 P= N延伸P A%/，
O! N变性 => H，99 N退火 => H，P= N 延伸=> H，共进
行 Q9 轮循环。以 6R( -+45 作为内参基因，采用上
游引物 :QD 和下游引物 :Q8（表 6）进行 :;+ 反
应，反应体系和热循环条件同上。以上试验均为 Q
次重复。
6@ =@ !# 花芽解剖结构分析 # 定期采集毛白杨雌雄
花芽样品，按照李正理（6OO"）和林加涵（=>>>）的方
法，对样品进行如下处理：固定—脱水—透明—浸
蜡—包埋—切片—贴片—脱蜡—复水—番红、固绿
染色—封藏，切片厚度为 6> !A，用加拿大树胶封
片。在 JBSATUH5IP> 光学显微镜下观察、拍照记录。
图 =# 毛白杨 !"#$% 7845 及推测的氨基酸序列
V%3W =# K’. 7845 G/X X.XU7.X GA%/2 G7%X H.
!" #$ 毛白杨 !"#$% 基因的分离克隆
为了从毛白杨中分离 !"#$% 同源基因，首先根
据美 洲 黑 杨（ !&’()(* /,)"&0/,*）#$% 同 源 基 因
（!1#$）设计合成了 6 对 :;+ 引物（:6D，:68），利
用 +KM:;+ 技术从毛白杨雄花芽 A+45 中分离
!"#$%。:;+ 结果如图 6 所示，扩增出长度大约为
6@ Q Z[ 条带。将该片段克隆并测序。结果表明该
基因序列长度为 6 Q6! [T，包含 6 个完整的阅读框
（J+V），编码 QPP 氨基酸（图 =）。
图 6# !"#$% 7845 的 :;+ 扩增
V%3W 6# ;B2/%/3 2Y !"#$% 7845
FW 8?M=>>> AG-Z.-；6@ :;+ 产物 :;+ T-2XU7&W
!" !$ 序列同源性分析与蛋白结构预测
在 ,./*G/Z 进行 *BGH& 检索，结果表明毛白杨
!"#$% 编码的氨基酸与毛果杨 !1#$（DOQ6O"）、金
鱼草 $#2（ F999=9）、烟草（ 304&"0.-. ".5.4(+）
3$#6（D69POR）和 3#$= （D69POO）、苹果（6.)(*
/&+,*"04. ） 7#$6 （ 5*>9"69R ） 和 7#$=
（ 5*>9"69O ）、矮 牵 牛（ !,"(-0. 895:0/. ） 7#$
（ 5V>Q>6P6 ）、巨 桉（ ;(4.)9’"(* <:.-/0*） ;#$6
（5V>Q!R>"）所编码的氨基酸同源性分别为 OO\，
P9\，P>\和 P>\，"R\ 和 "O\，"R\，"R\。通过
与其他物种的同源基因比较发现，在这些同源基因
的 4 C端与 ; C端各具有6 个高度同源保守区，分别
在氨基酸 QP C 6"= 和=>Q C Q">之间，这是 #$% 及其
同源基因的一个显著特征。
为分析预测 :&?V) 蛋白的分子功能，联合使用
!Q
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# !"#$% 基因在毛白杨雌雄花芽发育过程中的表达模式
%&’( $# )*+ +,-.+//&01 -233+.1 04 !"#$% ’+1+ 56.&1’ 703* 829+ 215 4+829+ 490.29 765/ 5+:+90-8+13 &1 !& "’()*"’+, 3.++/
;(雄花芽发育过程中 !"#$% 基因的实时 <=)>?@= 分析 # =+29>3&8+ <=)>?@= 2129A/&/ 04 !"#$% 56.&1’ 829+ 490.29 765/ 5+:+90-8+13；B(雌
花芽发育过程中 !"#$% 基因的实时 <=)>?@= 分析 # =+29>3&8+ <=)>?@= 2129A/&/ 04 !"#$% 56.&1’ 4+829+ 490.29 765/ 5+:+90-8+13(
年 C 月 D$ 日，含有 D 个心皮的单室子房和柱头形
成，柱头二分裂，花柱中空，基生胎座，胚珠倒生于胎
座上，珠柄发达，单珠被，通常珠心较厚（图 "%）。
毛白杨雄花芽的形态分化如图 E 所示。雄花器
官的发育并不集中在花芽的顶端，在环状的花原基
边缘不断膨大的突起的组织环，中间的细胞分化慢，
其结果是一个凹陷的分生组织区，花的发端出现
（图 E;）。经过大约 C 个半月的发育，圆盘状的分生
组织伸出，雄蕊原基出现，雄花序形成（图 EB）。之
后经过约半月的发育，每个花盘内花药形状已经非
常明显（图 E@），花药进一步发育（图 EF），到 CG 月
中旬，花粉囊成形，可见 ! 个花粉囊室。到 CD 月中
旬，花粉囊完全成形，横切面呈蝴蝶形，! 个花粉囊
室清晰可见，花粉渐趋成熟（图 E%）。
H# 讨论
本研究从毛白杨花芽 8=I; 中分离克隆了
!"#$%，并与之前分离的基因组 FI; 序列进行了比
较，证实该基因确由 H 个外显子和 D 个内含子组成，
编码 HEE 个氨基酸（;1 )" ,-(，DGG$），它与拟南芥
#$%、桉树 .#$C 、矮牵牛 /#$、苹果 /#$C 和 /#$D 、
烟草 0$#C 和 0#$D 、金鱼草 $#1 及毛果杨 !2#$
具有 $JK L MMK 的相似性。通过比较发现不同物
种 #$% 同源基因的 I N 端 和 @ N 端各有 C 个非常
保守的区域。#$% 基因 @ N端保守区的晶体结构已
经得到解析，由 E 个 !>*+9&, 构成，其中 !D 和 !H 螺
旋在与靶标 FI; 结合识别过程中至关重要，从分子
结构水平说明了转录因子 #$% 在开花调控中的作
用机制（3,(4+ )" ,-(，DGGJ）。经过系列生物信息学
软件预测分析表明，!"#$% 基因 @ N 端氨基酸具有
类似的 O+9&,>36.1>*+9&, 结构（图 H，图 !），这种序列
上的高度同源性和结构上的高度相似性说明 !"#$%
在杨树开花发育中具有相似的功能。与一些具有双
拷贝 #$% 同源基因的苹果、桉树、银杏（ 56*78’
96-’9,）、烟草等双子叶植物不同，毛白杨基因组
FI; 中只有单拷贝的 !"#$% 基因（;1 )" ,-(，DGG$）。
由此可见，!"#$% 在控制毛白杨开花转变过程中的
作用无可替代。
=0338211 等（DGGG）研究表明，!2#$ 不仅在发
育的花序中强烈表达，而且在叶原基、幼叶（在靠近
花序的顶端营养芽中最明显）、幼小实生苗中也有
表达。在其他木本植物中，#$% 同源基因的表达也
不总是在生殖发育过程中表达，在桉树和葡萄（:6"6+
;6*6<)=,）的叶原基中也有表达（ P063*+.301 )" ,-(，
CMMJ；F0.1+92/ )" ,-(，DGG!；@2.8012 )" ,-(，DGGD）。
在猕猴桃（/>"6*6?6, ?)-6>6’+,）、葡萄和苹果中观察到
了 #$% 同源基因季节性的表达现象（Q29301 )" ,-(，
DGGC；@2.8012 )" ,-(，DGGD；Q252 )" ,-(，DGGD）。此
外，通过 !2#$ 启动子驱动 RSP 基因的研究发现，
RSP 在杨树的枝条中观察到强烈的表达（Q+& )"
,-(，DGG"）。本次着重研究了 !"#$% 在毛白杨雌雄
花芽发育过程的表达模式，从 M 月 CH 日至翌年 D 月
D$ 日，无论雌雄花芽均检测到 !"#$% 基因持续稳定
的转录本，而且在雄花芽中 !"#$% 基因的相对表达
量远远高出同期雌花芽（图 $）。该结果为阐明
!"#$% 在花发育分子机制中的作用提供了新的
证据。
研究发现毛白杨雌雄花芽形态分化进程差异较
大，雄花芽的形态分化明显早于雌花芽。雄花的原
基的出现始于 " 月初（图 E;），雌花原基的出现则
晚 D 个月（图 ";）；雄花序雏形形成于 E 月中旬（图
EB），而雌花序形成则在 J 月底（图 "B）。之后雌雄
花蕊进入快速发育时期，到 CD 月 D! 日时雄蕊发育
基本完善，花粉囊横切面呈蝴蝶形，雄蕊发育花粉逐
渐成熟（图 E%）。C 个月后，子房发育较为完善，可
见二分叉的柱头和倒生的胚珠（图 "%）。一方面，
"H