全 文 ：第 ws卷 第 x期
u s s w年 | 月
林 业 科 学
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≥ ³¨qou s s w
甜橙液泡转化酶基因kΧΣςΙl的分离及全序列分析 3
安新民tl 张上隆ul 徐昌杰vl 秦巧平xl
k浙江大学 杭州 vtssu|l
陶 俊wl
k扬州大学 扬州 uuxss|l
摘 要 } 根据不同植物液泡转化酶基因序列的保守区设计合成引物 o采用滤纸吸附噬菌体 °≤• 法 o首次从甜橙基
因组文库筛选出含甜橙液泡转化酶基因的阳性 Κ噬菌体 o经过大量培养并提取其 ⁄‘„ o限制性内切酶消化后进行
⁄ŒŠ ¶²∏·«¨µ±印迹分析 o将阳性条带回收 !加工并克隆测序 ∀序列分析表明 o该基因全长 w zuu ¥³o编码 x{{个氨基
酸 o包括 y个外显子和 x个内含子 ∀在 Š¨ ±…¤±®进行 …¯¤¶·检索的结果表明 o该基因编码的氨基酸序列与马铃薯 !番
茄和酸樱桃液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为 y{ h !y{ h和 yu h ∀系统进化关系聚类分析结果表
明 o该基因属液泡转化酶基因类型 ∀该基因已经在 Š¨ ±…¤±®登录k登录号 }„ƒwvvywvl ∀该基因的获得为从分子水平
研究柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解机制以及通过基因工程改良果实品质奠定了基础 ∀
关键词 } 甜橙 o液泡转化酶 o基因分离
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlsx p ss|| p sy
收稿日期 }ussv p sw p t{ ∀
基金项目 }国家自然科学基金重点项目kv|zvsvwsl和面上项目kvstzsyw{l资助 ∀
3 tl !ul !vl !wl !xl为作者排序 ∀张上隆为通讯作者 ∀安新民现在北京林业大学工作 ∀
Ισολατιον ανδ Χηαραχτεριζατιον οφ Χιτρυσσινενσισ ς αχυολαρ Ινϖερτασε Γενε k ΧΣςΙl
„± ÷¬±°¬±tl «¤±ª≥«¤±ª¯²±ªul ÷∏≤«¤±ª­¬¨vl ±¬± ±¬¤²³¬±ªxl
k Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Ηανγζηουvtssu|l
פ²∏±wl
kΨανγζηου Υνιϖερσιτψ Ψανγζηουuuxss|l
Αβστραχτ} „ ³¤¬µ²©³µ¬°¨ µ¶o§¨¶¬ª±¨ §©µ²° ¦²±¶¨µ√¨ §µ¨ª¬²±¶²© ³¯¤±·√¤¦∏²¯¤µ¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ ¶o º¤¶∏¶¨§·²¶¦µ¨ ±¨ Χιτρυσ
σινενσισ √¤¦∏²¯¤µ¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ k ΧΣςΙl ©µ²° Χqσινενσισ ª¨ ±²°¬¦¬¯¥µ¤µ¼q׫¨ ³²¶¬·¬√¨ Κ³«¤ª¨ º¤¶¬¶²¯¤·¨§¥¼©¬¯·¨µ³¤³¨µ¤¥2
¶²µ³·¬²± ³«¤ª¨ °≤• o¤±§¦∏¯·∏µ¨§ ¤¯µª¨ ¼¯ q ⁄‘„ ©µ²°·«¨ ³²¶¬·¬√¨ Κ³«¤ª¨ º¤¶§¬ª¨¶·¨§ º¬·«¶¨√¨ µ¤¯ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ ¶q׫¨
³²¶¬·¬√¨ ©µ¤ª°¨ ±·¶­∏§ª¨§¥¼ ⁄ŒŠ ¶²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª¤±¤¯¼¶¬¶o º¨ µ¨ µ¨¦¯¤¬°¨ §o °²§¬©¬¨§o¦¯²±¨ §¬±·² ³˜≤t| ¤±§³˜≤°p× o¤±§
¶¨ ∏´¨±¦¨§µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q׫¨ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ º¤¶w zuu ¥³¬±¦¯∏§¬±ªy ¬¨²±¶¤±§x¬±·µ²±¶o¦²§¬±ªx{{ ¤°¬±²
¤¦¬§¶qŒ·º¤¶©²∏±§·²«¤√¨ y{ h oy{ h ¤±§yu h «²°²¯²ª¼µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯·² Σολανυµ τυβεροσυµ k÷zsvy{l o Λψχοπερσχιον εσχυλεν2
ταµ ktusuxl ¤±§ Πρυνυσχερασυσk„≠sw{xz|l √¤¦∏²¯¤µ¬±√¨ µ·¤¶¨¶¥¼ ¥¯¤¶·¤±¤¯¼¶¬¶¬± Š¨ ±…¤±®q ¤¨±º«¬¯¨ o¬·º¤¶¶∏¥¦¯¤¶¶¨§
¬±·² ³¯¤±·√¤¦∏²¯¤µ¬±√¨ µ·¤¶¨ ¥¼ ³«¼¯²ª¨ ±¨·¬¦ µ¨ ¤¯·¬²± ¤±¤¯¼¶¬¶q ΧΣςΙ «¤§ ¥¨ ±¨ µ¨ª¬¶·¨µ¨§ ¬± Š¨ ±…¤±® k „¦¦¨¶¶¬²± ‘²q
„ƒwvvywvl q׫¬¶º²µ® º¬¯¯ ¦²±·µ¬¥∏·¨·²¤¶·∏§¼ ²±·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¨ ¦«¤±¬¶°¶²©¤¦¦∏°∏¯¤·¬²±¤±§¦¤·¤¥²¯¬¶° ²©¶∏¦µ²¶¨ §∏µ¬±ª
Χιτρυσ©µ∏¬·§¨√¨ ²¯³°¨ ±·o¤±§¬°³µ²√¨ °¨ ±·²© Χιτρυσ©µ∏¬·´ ∏¤¯¬·¼ ¥¼ ª¨ ±¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ªq
Κεψ ωορδσ} Χιτρυσσινενσισo∂¤¦∏²¯¤µ¬±√¨ µ·¤¶¨ o Š¨ ±¨ ¬¶²¯¤·¬²±
蔗糖是植物光合产物的主要贮运形式之一 o而转化酶与蔗糖的代谢密切相关 o它催化蔗糖分解为果糖和
葡萄糖 ∀高等植物的转化酶包括几种同工酶 o它们可通过亚细胞定位 !溶解性 !最适 ³‹值以及等电点k³Œl来
加以区分 ∀酸性转化酶存在于细胞壁k不溶性的l和液泡k可溶性的l中 o中性或碱性转化酶存在于细胞质中
k≥·∏µ° ετ αλqot||s ~Ž¬° ετ αλqousssl ∀有关研究表明 o液泡转化酶参与植物的渗透调节和细胞膨大 !调控果
实等贮藏器官中糖成份及比例以及对胁迫如寒冷作出响应等生理过程k • ²²§¶²± ετ αλqot|{z ~’«¼¤°¤ ετ αλqo
t||x ~Ž¯¤±± ετ αλqot||y ~µ¨±±¨ µετ αλqot||yl ∀
自从 ≥·∏µ°等kt||sl从胡萝卜k ∆αυχυσχαροταl中分离出第一个转化酶基因以来 o迄今为止 o已从甜菜k Βε2
τα ϖυλγαρισl !马铃薯k Σολανυµ τυβεροσυµ l !拟南芥k Αραβιδοπσισ τηαλιαναl !烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµ l !玉米k Ζεα
µαψσl !番茄kΛψχοπερσιχον σχυλεντυµl !豌豆k Πισυµ σατιϖυµl !蚕豆kςιχια φαβαl !绿豆kςιγνα ραδιαταl等植物中分离
到转化酶基因 ∀就果树而言 o则仅从葡萄k ςιτισ ϖινιφεραlk⁄¤√¬¨¶ ετ αλqot||yl !草莓k Φραγαρια ανανασσαl
k„ƒsssxutl !酸樱桃k Πρυνυσχερασυσlk„≠sw{xz|l和桃k Πρυνυσ περσιχαlk„ƒvyzwxvl中分离到该基因 o在柑桔上
安新民等kusstl率先报道了柑桔转化酶基因家族的 u个成员并首次在 Š¨ ±…¤±®登录 o为研究柑桔果实蔗糖
积累与分解的分子机制 o本文开展了甜橙k Χιτρυσσινενσισl液泡转化酶全长基因的分离工作 ∀
t 材料与方法
111 材料
t qt qt 甜橙基因组 ⁄‘„文库 甜橙基因组文库由陈大明等kusssl构建 ∀
t qt qu 引物 根据植物液泡和细胞酸性转化酶基因的保守区序列设计一对 °≤• 引物如下 }上游引物 xχ
ׄׄ„≤≤≤ŠŠ„Š„„≤Š„≤„„Š×Š vχ和下游引物 xχ„≤׊××≤××≤≤×≤≤×׊Š≤≤„„„ vχk用于筛选液泡酸性转化
酶基因l ∀
t qt qv 限制性内切酶 Σαχ´ oΕχο• ´ oΣαλ´ oΝδε ´ oΕχο• ∏ oΗιν§¶ oΠστ´k购自 פŽ¤•¤l ∀
t1t qw 凝胶 ⁄‘„回收试剂盒 ±Œ„ ∏´¬¦®× Š¨ ¯ ∞¬·µ¤¦·¬²± Ž¬·k±Œ„Š∞‘l ∀
t qt qx ≥²∏·«¨µ±杂交试剂盒 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k•²¦«¨ l ∀
1 .2 方法
t qu qt °≤• 反应 xs ˏ°≤• 反应体系包括 t ˏ噬菌体液 o各 s qu Λ°²¯#pt上游引物和下游引物 ot ≅ °≤•
反应缓冲液 ou °°²¯#pt ª≤¯ u ouss Λ°²¯#pt §‘×°¶和 u单位 פ´ ⁄‘„聚合酶 ∀°≤• 循环条件为 |w ε 预变性
x °¬±o最后 zu ε 延伸 ts °¬±o|w ε 变性 ws ¶oxs ε 退火 ws ¶ozu ε 延伸 t °¬±o共进行 vx轮循环 ∀
t qu qu 甜橙基因组文库的筛选 采用安新民等kussvl改进的滤纸吸附噬菌体 p °≤• 法 ∀
t qu qv 阳性 Κ噬菌体的培养及其 Κ⁄‘„的提取 参照 ≥¤°¥µ²²®等kt||xl的方法 ∀
t qu qw 阳性噬菌体 ⁄‘„限制性酶切 us ˏ反应体系包括 tx ˏk约 x ΛªlΚ噬菌体 ⁄‘„ !x单位内切酶 !u ˏ
ts ≅缓冲液和无菌双蒸水 ovz ε 消化过夜 ∀
t qu qx ≥²∏·«¨µ±杂交分析 按照 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k•²¦«¨ l说明书进行 ∀
t qu qy 甜橙液泡酸性转化酶基因的亚克隆 凝胶中 ⁄‘„的回收采用 ±Œ„ ∏´¬¦®× Š¨ ¯ ∞¬·µ¤¦·¬²± Ž¬·k±Œ„Š∞‘l
回收凝胶中阳性 ⁄‘„片段并进行 v.末端加工k安新民等 oussvl o经加工的酶切产物与 ³˜≤°2×载体连接 o连
接产物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o通过蓝白斑筛选 !质粒长度和酶切鉴定获得重组质粒k≥¤°¥µ²²®
ετ αλqot||xl ∀
t qu qz ⁄‘„序列测定及结果分析 ⁄‘„序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测定 ∀ ⁄‘„序列分
析采用 ≥¨ ´ „¬§ µ和 …¬²¨ §¬·软件包进行 ∀
u 结果与分析
2 .1 阳性 Κ噬菌体 ∆ΝΑ的酶切
采用安新民等kussvl改进的滤纸吸附噬菌体 p °≤• 法 o仅通过 w轮共 z次 °≤• 反应便从甜橙基因组文
库中筛选获得了甜橙液泡转化酶基因的一个阳性 Κ噬菌体 o经过进一步纯化后分离得到甜橙液泡转化酶基
因的阳性Κ噬菌体单克隆 ∀将获得的阳性Κ噬菌体单克隆大量培养 o并提取噬菌体 ⁄‘„ ∀分别用 Σαχ´ oΣαχ
´ n Εχο• ´ oΣαχ´ n Σαλ´ oΣαχ´ n Νδε ´ oΣαχ ´ n Εχο• ∏ oΗιν§¶ oΠστ ´将 Κ噬菌体 ⁄‘„k ΧΣςΙl进行消
化 o结果表明用 Σαχ´ n Εχο• ´ oΣαχ´ n Σαλ´ oΣαχ´ n Νδε ´ oΣαχ´ n Εχο• ∏ oΗιν§¶ oΠστ´消化均获得较
多的条带k图 tl ∀
212 Σουτηερν杂交分析
为鉴别酶消化后的阳性条带 o将凝胶中的酶消化产物通过 us ≅ ≥≥≤ 印迹到尼龙膜 o按 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª
¤±§⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k•²¦«¨ l说明书进行 ≥²∏·«¨µ±杂交分析 o结果表明 o分别采用 Σαχ´ !Ηιν§¶ ! Πστ´消化后长度
分别大约为 ut ®¥和 v ®¥!w qs ®¥和 s qz ®¥以及 x ®¥的条带k图 t中第 u !z和 {泳道 o对应图 u中第 t !y和 z
泳道l呈阳性 ∀而分别采用 Σαχ´ n Εχο• ´ !Σαχ´ n Σαλ´ !Σαχ ´ n Νδε ´ ! Σαχ ´ n Εχο• ∏组合消化后 o长
度分别大约为 x ®¥和 s qx ®¥!x ®¥和 v ®¥!x ®¥和 v ®¥!v ®¥的条带k图 t中第 v ∗ y泳道 o对应图 u中第 u ∗
x泳道l呈阳性 ∀根据上述酶切和 ≥²∏·«¨µ±杂交结果 o结合探针中的酶切位点以及所采用的亚克隆方法 o认为
Ηιν§¶单酶切与 Σαχ´和 Σαλ´双酶切的阳性条带便于快速分离目的基因全长序列 ∀
sst 林 业 科 学 ws卷
图 t 阳性 Κ噬菌体 ⁄‘„ k ΧΣςΙl限制性内切酶消化结果
ƒ¬ªqt °²¶·¬√¨Κ³«¤ª¨ ⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§º¬·«µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼° ¶¨
t1 Κ⁄‘„Π∞n ‹ ¤®¨µ~u ∗ {1 分别为阳性 Κ噬菌体 ⁄‘„用 Σαχ ´ o
Σαχ´ n Εχο• ´ o Σαχ´ n Σαλ´ o Σαχ´ n Νδε ´ o Σαχ´ n Εχο• ∏ o
Ηιν§¶ o Πστ´消化结果 ∀°²¶¬·¬√¨ Κ³«¤ª¨ ⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§ º¬·« Σαχ ´ o
Σαχ´ n Εχο• ´ o Σαχ´ n Σαλ´ o Σαχ ´ n Νδε ´ o Σαχ ´ n Εχο• ∏ o
Ηιν§¶ o Πστ´ µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q
图 u 阳性 Κ噬菌体 ⁄‘„ 酶消化后的 ⁄ŒŠ ≥²∏·«¨µ± …¯²·¶分
析k箭头所指条带用于回收克隆测序l
ƒ¬ªqu ⁄ŒŠ ≥²∏·«¨µ± …¯²·¶²©³²¶¬·¬√¨Κ³«¤ª¨ ⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§º¬·«
µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼° ¶¨k©µ¤ª° ±¨·¶¤µµ²º §¨ º µ¨¨ ¦¯²±¨ §¤±§¶¨ ∏´¨ ±¦¨§l
t ∗ z }分别为阳性 Κ噬菌体 ⁄‘„用 Σαχ ´ o Σαχ ´ n Εχο• ´ o Σαχ ´
n Σαλ´ o Σαχ´ n Νδε ´ o Σαχ ´ n Εχο• ∏ o Ηιν§¶ o Πστ ´消化后
≥²∏·«¨µ±印迹 ∀ ⁄ŒŠ ≥²∏·«¨µ± …¯²·¶²©³²¶¬·¬√¨Κ³«¤ª¨ ⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§º¬·«
Σαχ´ o Σαχ´ n Εχο• ´ o Σαχ ´ n Σαλ´ o Σαχ ´ n Νδε ´ o Σαχ ´ n
Εχο• ∏ o Ηιν§¶ o Πστ´µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q
213 阳性条带的亚克隆和测序
按照 ±Œ„ ∏´¬¦®× Š¨ ¯ ∞¬·µ¤¦·¬²± Ž¬·k±Œ„Š∞‘l说明书回收并纯化上述阳性条带k Ηιν§ ¶酶切以及 Σαχ ´和
Σαλ´双酶切l o采用我们改进的亚克隆方法进行酶切产物修饰后克隆入 ³˜≤°2×和 ³˜≤t|载体 ∀经长度和
酶切鉴定获得重组质粒 ∀委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序k图 vl o该基因全长 w zuu ¥³∀
2 .4 基因序列 !结构和酶切位点分析
结合真核生物基因组 ⁄‘„内含子的一般剪切规律 o并运用 …≤ Š¨ ±¨ ƒ¬±§¨µ主页k«·³}rr§²·q¬°ª¨±q¥¦°q
·°¦q¨§∏}|vvŒrª¨ ±¨ p©¬±§¨µrª©q«·°¯ l上的 ≥°k¶¨¤µ¦«©²µ³²·¨±·¬¤¯ ¶³¯¬¦¨ ¶¬·¨¶l程序对该序列进行拼接分析 o结果表
明该基因序列包括 y 个外显子和 x 个内含子k∏³¶·µ¨¤° ¶¨ ∏´¨±¦¨ t1 qqqqq|w ~t¶·¨ ¬²± |x1 qqqqqw{{ ~t¶·¬±·µ²±
w{|1 qqqqqzxt ~u±§ ¬¨²± zxu1 qqqqqzyt ~u±§¬±·µ²± zyu1 qqqqquvzx ~vµ§ ¬¨²± uvzy1 qqqqqvuvu ~vµ§¬±·µ²± vuvv1 qqqqq
vx{s ~w·« ¬¨²± vx{t1 qqqqqvz|{ ~w·« ¬±·µ²± vz|| qqqqqqv{{y ~x·« ¬¨²± v{{z1 qqqqqv|zw ~x·« ¬±·µ²± v|zx qqqqqqws{v ~
y·« ¬¨²± ws{w1 qqqqqwu{t ~⁄²º±¶·µ¨¤° ¶¨ ∏´¨±¦¨ wu{u1 qqqqqwzuulk图 v !图 wl o编码 x{{个氨基酸k采用 ≥¨ ¤´¬§
µ推导l ∀拼接位点的位置与其它植物的转化酶基因完全一致 o但内含子长度差异较大 o该基因的第 u个内
含子长达 t yty ¥³∀而第 u个外显子长仅 | ¥³o编码 v个氨基酸k⁄°‘即天冬氨酸 !脯氨酸和天冬酰胺l o是迄
今为止在植物界发现的最小的外显子 ∀
运用 ≥¨ ¤´¬§ µ对全序列进行酶切位点分析 o发现在序列 tzyu !uv|z !uxu{ !uy{v !vwsy !vx|t !vyuw !vy{u !
wtsw !wuwu !wxzx ¥³处分别具有 Νχο ´ !Κπν ´ !Εχο• ∏ !Σµα´ !Ηιν§¶ !Πστ´ !Σαχ´ !Βγλ´ !Ηιν§¶ !Εχο• ´ !
Ηιν¦µ限制性酶切位点k图 wl ∀
215 序列比较 !同源性分析与聚类分析
采用 …¬²¨ §¬·和 ≤¯ ∏¶·¤¯¬对该基因推导的氨基酸序列及温州蜜柑k Χιτρυσ υνσηιυl转化酶基因编码的氨基酸
序列进行分析 o结果表明二者同源性仅为 xs1uu h o说明 ΧΣςΙ是柑桔转化酶基因家族的一个新的成员 ∀序列
中的/ ‘⁄°‘Š0和/  • ∞≤∂⁄0k图 xl分别为植物转化酶非常保守的 u个基序k°²·¬©l o它们在转化酶的结构和催
化活性上具有重要的功能kŽ¬° ετ αλqousssl ∀在 Š¨ ±…¤±®进行 …¯¤¶·检索 o结果表明该基因编码的氨基酸与
马铃薯k Σολανυµ τυβεροσυµ o÷zsvy{l !番茄kΛψχοπερσχιον εσχυλενταµ otusuxl和酸樱桃k Πρυνυσ χερασυσo„≠sw{xz|l
液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为 y{ h !y{ h和 yu h ∀
运用 ≤¯ ∏¶·¤¯¬对转化酶氨基酸序列进行比较并绘制了系统进化关系聚类树k图 yl ∀不考虑单子叶或双
子叶植物起源 o植物的转化酶分为细胞壁和液泡转化酶 u类 o明显区别于细菌和酵母转化酶 ∀甜橙液泡转化
酶基因k ΧΣςΙl编码的氨基酸序列在进化关系中属于液泡转化酶 o而与细胞壁转化酶关系较远 o并且它与温
州蜜柑转化酶k ΧιτΙΝς1 ,„…szw{{xl分属柑桔液泡转化酶基因家族的 u个不同成员 ∀证实了植物进化过程中
在细胞壁和液泡转化酶基因之间的歧化先于物种的多样化这一观点kŽ¬° ετ αλqousssl ∀
tst 第 x期 安新民等 }甜橙液泡转化酶基因k ΧΣςΙl的分离及全序列分析
图 v 推测的甜橙液泡转化酶基因k ΧΣςΙl全长序列及其编码的氨基酸序列
ƒ¬ªqv ׫¨ ©∏¯¯ ±∏¨ ¦¯²·¬§¨ ¤±§§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©³∏·¤·¬√¨√¤¦∏²¯¤µ¬±√ µ¨·¤¶¨ ª¨ ±¨
k ΧΣςΙl ©µ²° Χqσινενσισ
小写字母为非编码序列 o大写字母为编码序列 ∀ ׫¨ ¶°¤¯¯¯¨ ·¨µ¶¥¨ ²¯±ª·² ±²±p¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ o
·«¨ ¦¤³¬·¤¯ ¯¨ ·¨µ¶¥¨ ²¯±ª·²¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ q
ust 林 业 科 学 ws卷
图 w 甜橙液泡转化酶基因基因结构及酶切物理图谱
ƒ¬ªqw • ¶¨·µ¬¦·¬²± ¤±§¶·µ∏¦·∏µ¨ °¤³²©√¤¦∏²¯¤µ¬±√ µ¨·¤¶¨ ª¨ ±¨ ©µ²° Χq σινενσισ
} Βγλ´ ~∞} Εχο• ∏ ~∞¦} Εχο• ´ ~ ‹ } Ηιν§¶ ~‹¬} Ηιν¦ µ ~Ž} Κπν ´ ~‘} Νχο ´ ~° } Πστ´ ~≥ } Σαχ´ ~≥° } Σµα´ q
图 x 甜橙液泡转化酶基因k ΧΣςΙ o „ƒwvvywvl和温州蜜柑转化酶基因
( ΧιτΙΝς1 , „…szw{{xl编码的氨基酸序列比较
ƒ¬ªqx ≤²°³¤µ¬¶²± ²©³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶§¨§∏¦¨§©µ²° Χqσινενσισ √¤¦∏²¯¤µ¬±√ µ¨·¤¶¨ k ΧΣςΙ o „ƒwvvywvl
¤±§ Χq υνσηιυ¬±√ µ¨·¤¶¨ ( ΧιτΙΝς1 , „…szw{{xl ª¨ ±¨ ¶
氨基酸序列用 t个字母表示 o并采用 ≤¯ ∏¶·¤¯ • 软件引入k p p l以达到最大的同源性 ~保守的 Βp果糖苷酶基序k‘⁄°‘Šl
和半胱氨酸催化位点k • ∞≤∂ ⁄l用框粗体字母表示 ~完全保守和适当替代的氨基酸分别用 3 和 q表示 ∀ ׫¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶¨2
∏´¨ ±¦¨¶¤µ¨ ¬±·«¨ ²±¨ 2¯ ·¨¨µ¦²§¨ ¤±§«¤√¨¥¨ ±¨ ¤¯¬ª±¨ §¥¼¬±·µ²§∏¦¬±ªª¤³¶k p p l·² °¤¬¬°¬½¨ «²°²¯²ª¼ k≤ ∏¯¶·¤¯ • ¶²©·º¤µ¨l ~≤²±2
¶¨µ√¨ §Β2©µ∏¦·²¶¬§¤¶¨ °²·¬©¶k‘⁄°‘Šl ¦¼¶·¨¬±¨ ¦¤·¤¯¼·¬¦¶¬·¨¶k • ∞≤∂ ⁄l ¤µ¨ ¶«²º±¬± ¥²¬¨ §¥²¯§¯¨ ·¨µ¶~ײ·¤¯ ¼¯¦²±¶¨µ√¨ §¤±§¦²±¶¨µ2
√¤·¬√¨ ¼¯ µ¨³¯¤¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§¥¼ ¤¶·¨µ¬¶®¶¤±§§²·¶oµ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q
v 讨论与小结
植物的转化酶存在几种同工型 o依据其亚细胞定位可分为液泡 !细胞壁和细胞质转化酶 v种类型 ∀果实
等库器官液泡中转化酶活性的高低决定糖分组成及蔗糖与己糖的比例 o并且通过调节渗透溶质来实现对库
强的调控 ∀ Ž¯¤±±等kt||yl研究发现 o在番茄果实发育期间k直至最后一周l o酸性转化酶反义基因转化的果
实中蔗糖含量约为对照的 x倍 o而葡萄糖和果糖则只有 xs h o而果实则比对照小 vs h ∀这表明番茄果实的
糖分组成和大小受液泡转化酶水平的调控 ∀ פ±ª等kt|||l研究表明 o液泡转化酶反义基因转化抑制了胡萝
卜直根的发育而促进叶片增多 o使叶r根比提高到 t qxΒtk对照植株为 tΒvl ∀由此可见 o液泡转化酶对果实品
vst 第 x期 安新民等 }甜橙液泡转化酶基因k ΧΣςΙl的分离及全序列分析
图 y 转化酶蛋白序列的系统进化关系
ƒ¬ªqy °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²± ²©¬±√ µ¨·¤¶¨ ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
Ατβφρυχτ1 , Ατβφρυχτ2 , Ατβφρυχτ3 , Ατβφρυχτ4 k÷zwxtw o˜ttsvv o÷|xxvz o÷|zzw|l }
拟南芥 Αραβιδοπσισ~ ςφςΧΙΝςo ςφΧΩΙΝς2 kw|{vt ovxtyvl }蚕豆 ςιχια φαβα~
Ινϖ∆Χ1 , Ινϖ∆Χ2 , σΙ oσΙΙ kx{vyu o÷z{wuw o ÷zxvxu o ÷yztyvl }胡萝卜 ∆αυ2
χυσ χαροτα ~ Ιϖρ1 , Ινχω1 , Ινχω2 , Ινχω3 k ˜tytuv o ˜tzy|x o „ƒsxsyvt o
„ƒswvvwyl }玉米 Ζεα µαψσ~ πΧ∆141 , πΠΑλ11 kuuywx ou|s||l }马铃薯 Σολα2
νυµ τυβεροσυµ ~ ΠχΙ k ÷{xvuzl }豌豆 Πισυµ σατιϖυµ ~ ΧΩΙ k÷{t{vwl }烟草 Νιχ2
οτιαναταβαχυµ ~ ΑΙk⁄tsuyxl }绿豆 ςιγναραδιατα~ΙνϖΛε23γ ktusuxl }番茄 Λψ2
χοπερσιχον σχυλεντυµ ~ Σξψ k ÷yzzwwl }葡萄球菌 Σταπηψλοχοχχυσ ξψλοσυσ~ ςαλ
kuyxttl }弧菌 ςιβριο αλγινολψτιχυσ~ Ππε kvus|vl }足球菌 Πεδιοχοχχυσπεντασα2
χευσ~ Εχο k÷{twytl }大肠杆菌 Εσχηεριχηια χολι ~ Βσυ k÷zvtuwl }杆状菌 Βαχιλ2
λυσσυβτιλισ~ Συχ2 kwy|utl }酵母菌 Σαχχηαροµψχεσ χερεϖισιαε q
质形成和产量至关重要 ∀
本研究采用滤纸吸附噬菌体 °≤• 法从甜橙基
因组文库中筛选并分离了甜橙转化酶基因家族的
一个成员k ΧΣςΙl o并率先在 Š¨ ±…¤±®登录k登录号
为 „ƒwvvywvl ∀序列分析表明 o该基因序列全长
w zuu ¥³o编码 x{{个氨基酸 o包括 y个外显子和 x
个内含子 ∀其中第 u 个外显子仅 | ¥³o编码 ⁄°‘
k天冬氨酸 !脯氨酸和天冬酰胺l o是迄今为止在植
物中发现的最小外显子 ∀它与另一段保守序列
/  • ∞≤∂⁄0是植物转化酶中非常保守的 u个基序 ∀
同源性分析结果表明它与定位于液泡的转化酶基
因同源性较高 o与马铃薯k÷zsvy{l !番茄ktusuxl
和酸樱桃k„≠sw{xz|l液泡转化酶基因编码的氨基
酸序列同源性分别为 y{ h !y{ h和 yu h ∀进一步的
系统进化关系聚类分析结果表明 o该序列属于液泡
转化酶基因 ∀这种结构和序列的高度保守性和相
似性 o使我们有理由推测功能上的相似性 ∀
该基因的获得将为通过基因过程手段定向改
良柑桔等果树果实品质奠定了基础 o并且对于研究
柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解的分子机制
具有重要的意义 ∀另一方面 o编码液泡转化酶的基
因可能存在若干成员 o其它成员的分离工作有待进
一步进行 ∀
参 考 文 献
安新民 o徐昌杰 o张上隆 q柑桔酸性转化酶基因片段的克隆 q果树学报 ousst ot{kwl }t{| p t|v
安新民 o徐昌杰 o张上隆等 o应用滤纸吸附 p °≤• 法和改进的亚克隆方法快速筛选克隆甜橙细胞壁酸性转化酶基因k≤≥2≤ • Œl q细胞生物学杂志 o
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陈大明 o徐昌杰 o张上隆 q脐橙基因组 ⁄‘„文库的构建 q园艺学报 ousss ouzkyl }wst p wsx
≥¤°¥µ²²®oƒµ¬·¶¦« ∞ ƒ o ¤±¬¤·¬¶×著 q金冬雁 o黎孟枫等译 q分子克隆实验指南 q第二版 q北京 }科学出版社 ot||x
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