全 文 ：第 wv卷 第 v期
u s s z年 v 月
林 业 科 学
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¤µqou s s z
毛白杨纤维素合酶基因kΠτοΧεσΑ1l的克隆及其
在烟草中的遗传转化 3
李春秀 齐力旺 史胜青 汪阳东 王建华 张守攻
k中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室 北京 tsss|tl
摘 要 } 克隆毛白杨纤维素合酶基因k ΠτοΧεσΑ1l o全长为 v utx ¥³o与欧洲颤杨的 ΠτρΧεσΑ1 基因的同源性为 |z h o
具有开放的阅读框 o编码区在 xu ∗ u |{{碱基之间 o为 u |vz ¥³∀构建 ΠτοΧεσΑ1 基因的全长正义植物表达载体为
³…Œ°„t o经酶切和 °≤• 鉴定确认载体构建正确 ∀通过农杆菌介导的方法将 ³…Œ°„t表达载体转入烟草中 o转基因植
株的纤维细胞壁厚度和木质部厚度都有不同程度的下降 o形态表征为植株明显变矮 o叶片变小 ∀
关键词 } 毛白杨 ~纤维素合酶基因 ~遗传转化
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlsv p ssv| p sz
收稿日期 }ussx p tu p s| ∀
基金项目 }国家高技术研究发展计划k/ {yv0计划l资助项目kussv„„uwwsys与 ussv„„uwwsusl ∀
3 张守攻为通讯作者 ∀
Ισολατιον ανδ Τρανσφορµατιον ιν Νιχοτιανα ταβαχυµ οφ α Χελλυλοσε Σψντηασε Γενε kΠτοΧεσΑ1l
φροµ Ποπυλυστοµεντοσα
¬≤«∏±¬¬∏ ±¬¬º¤±ª ≥«¬≥«¨ ±ª´¬±ª • ¤±ª≠¤±ª§²±ª • ¤±ª¬¤±«∏¤ «¤±ª≥«²∏ª²±ª
kΛαβορατορψοφ Χελλ Βιολογψo Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψo ΧΑΦ Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ } „ ¦¨¯¯∏¯²¶¨ ¶¼±·«¤¶¨ ª¨ ±¨ k ΠτοΧεσΑ1l o¬¶²¯¤·¨§©µ²° Ποπυλυστοµεντοσαoº¤¶v utx ¥³ ²¯±ªº¬·«¤±²³¨ ±¬±ªµ¨¤§¬±ª
©µ¤°¨ ²©u |vz ¥³ ¬¨·¨±§¬±ª©µ²° ±∏¦¯¨ ²·¬§¨¶xu ∗ u |{{1 ≤²°³µ¬¶²±²©·«¨ ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© ΠτοΧεσΑ1 º¬·« ΠτρχεσΑ1 ©µ²°
Ποπυλυστοµεντοσᶫ²º¨ §|z h ¬§¨±·¬·¼q׫¨ ©∏¯¯ ¯¨ ±ª·« ΠτοΧεσΑ1 ¦⁄‘„ º¤¶¶∏¥¦¯²±¨ §¬±·²³…Œtut ¤±§¬§¨±·¬©¬¨§¥¼§¬ª¨¶·¬²±o
·«¨ ±·µ¤±¶©²µ°¨ §¬±·² Νιχοτιανα ταβαχυµ ¥¼ ¯¨ ¤© §¬¶¦q ׫¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶º¬·« ΠτοΧεσΑ1 «¤§¶°¤¯¯ ¯¨ ¤√¨ ¶o¤±§ / §º¤µ©0
³«¨ ±²·¼³¨ o¦²±¶¬¶·¨±·º¬·«¤ ²¯¶¶²©¬¼¯ °¨ ¤±§©¬¥¨µ¦¨¯¯ º¤¯¯·«¬¦®±¨ ¶¶∀
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυστοµεντοσα~ ΠτοΧεσΑ1 ~·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
纤维素的基本单位是吡喃式 ⁄p葡萄糖 o以 Βp t ow p糖苷键相连 o其葡萄糖残基约为 u sss ∗ u xss个 ∀
植物中的纤维素主要是以小微纤丝的形式存在 o一般微纤丝是由 vy根 Βp t ow p葡糖苷链结晶而成 o它是植
物细胞里的主要成分 ∀自然界每年有 t {ss亿·的纤维素生成 o是地球上最丰富的生物大分子和重要的可再
生资源k⁄¨¯°¨ µot|||l ∀随着社会的快速发展 o人类对植物纤维的需求激增 o而过度利用自然界的植物纤维
资源将对人类生存造成极大的破坏 ∀植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良 !木材定向培育以及农业 !
造纸等化工业都十分重要 o因此通过了解植物纤维素的生物合成机制 o进而改善植物纤维的品质与产量就显
得十分必要 ∀相关研究已持续了 vs多年 o但进展非常缓慢 ∀t||y年在棉花k Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµl中克隆了第
t个植物纤维素合酶基因 o随后在拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl全基因组测序后 o发现了 ts个纤维素合酶基因
k¬ετ αλqot||v ~°¨ ¤µετ αλqot||yl ∀林木中克隆的第 t个纤维素合酶基因是美国密西根大学从欧洲颤杨
kΠοπυλυστρεµυλοιδεσl中得到的 ΠτρΧεσΑ1基因 o它是一个在木质部特异表达的纤维素合酶基因 o共有 u |zv ¥³o
与次生壁的形成有关 o在次生壁形成的时期 o该纤维素合酶基因的表达丰度最高 o该基因表达还受外来物理
拉力信号的调控k • ∏ ετ αλqousssl ∀随后美国密西根大学先后报道了欧洲颤杨的 ΠτρΧεσΑ2 , ΠτρΧεσΑ3 ,
ΠτρΧεσΑ4 , ΠτρΧεσΑ5 , ΠτρΧεσΑ6 , ΠτρΧεσΑ7共 y个基因k≥¤°∏ª¤ ετ αλqoussu ~Ž¤¯ ∏¯µ¬ετ αλqoussv ~usswl o通过对以
上基因的表达时期和部位的分析 o发现 ΠτρΧεσΑ1 , ΠτρΧεσΑ2 , ΠτρΧεσΑ3 的表达时期与表达部位很相似 o因此推
测这 v个基因可能是在同一个纤维素合酶复合体中 o共同完成杨树的次生壁的合成k≥¤°∏ª¤ ετ αλqousswl ~而
ΠτρΧεσΑ4 , ΠτρΧεσΑ5 , ΠτρΧεσΑ7 的表达时期和部位相似 o推测它们可能与初生壁的形成相关kŽ¤¯ ∏¯µ¬ ετ αλqo
usswl ~ΠτρΧεσΑ6与茎的伸长生长有关 o在杨树枝条的快速生长期表达丰度高k¬¤±ª ετ αλqousswl ∀除了欧洲
颤杨 o在杂交杨k Ποπυλυστρεµυλα ≅ Πqτρεµυλοιδεσl中也克隆了纤维素合酶基因 o同时还报道了几个类纤维素合
酶基因 kχλσl参与纤维素的生物合成k≥²µ¤¼¤ ετ αλqousswl ∀虽然已克隆部分杨树纤维素合酶基因 o目前还没
有杨树纤维素合酶基因的转基因功能的研究报道 ∀
毛白杨k Ποπυλυστοµεντοσαl是我国特有的优质乡土树种 o在杨属树种中 o毛白杨以其速生丰产 !纤维长度
较长 o成为最适的纸浆用材林树种之一 ∀因此本研究选用毛白杨为材料来研究其纤维素合酶基因 o克隆了
ΠτρΧεσΑ1的同源基因毛白杨纤维素合酶基因 ΠτοΧεσΑ1 o构建了全长正义植物表达载体 o进行了烟草k Νιχοτιανα
ταβαχυµl的遗传转化 o分析了转基因烟草的表型特征 o为鉴定该基因的功能提供了试验证据 ∀
t 材料与方法
111 材料
植物材料为 v年生毛白杨 ~植物表达载体 ³…Œtutk中国林业科学研究院分子生物学重点实验室提供l ~
³Š∞2×载体k°µ²°¨ ª¤l ~ • ‘¤¶¨ „ kפ®¤µ¤l ~蛋白酶k华绿渊生物试剂公司l ~ פ´ ⁄‘„ 聚合酶k°µ²°¨ ª¤l ~
Œ°×Š !÷2ª¤¯ !氨苄青霉素 !卡那霉素和羧苄青霉素k≥¬ª°¤l ~¦⁄‘„合成试剂盒k≤¯ ²±·¨¦«l ~×µ¬½¬²¯ • ‘„提取试剂
盒kŒ±√¬·µ¬ª¬²±l ∀
112 方法
t1u1t • ‘„纯化 取毛白杨 u年生枝条的皮下形成层及次生木质部组织k‹∏ ετ αλqot||{l o迅速放入液氮中
研磨成粉末状 o并立即放入 ×µ¬½¬²¯ • ‘„提取液中 o按照 Œ±√¬·µ¬ª¬²±公司 ×µ¬½¬²¯ 试剂盒的操作方案纯化 • ‘„ ∀
t1u1u ¦⁄‘„的合成及克隆 ¦⁄‘„用 ≥°¤µ·¦⁄‘„ ¬¥µ¤µ¼ ≤²±¶·µ∏¦·¬²± Ž¬·k≤¯ ²±·¨¦«l合成 ∀设计引物 °„tƒƒ }
xχ2Š×≤Š„≤≤≤„≤Š≤Š×≤≤Š×≤×׊„„„Š„„ׄ2vχ ~°„tƒ• }xχ2≤≤≤≤„„„„ׄ≤׊ŠŠ„Š„Š„≤×ׄ×׊Š„Š2vχ o以毛
白杨 ≤⁄‘„为模板进行 °≤• 反应 o条件为 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε vs ¶与 y{ ε v °¬±为 t个循环 o共 vx个
循环 ~zu ε 延伸 z °¬±∀回收 °≤• 产物 o取 x ˏ回收的 ⁄‘„ 片段连接到 × p 载体上 o转化大肠杆菌
k Εσχηεριχηια χολιl ⁄‹ xΑ菌株 o蓝白斑筛选 o质粒提取 o酶切鉴定片段大小后进行测序鉴定 ∀
t1u1v 植物表达载体的构建 ¦⁄‘„的 °≤• 扩增 o°≤• 产物的回收 !连接 !酶切 o感受态细胞制备 o质粒 ⁄‘„
的提取 !连接 !转化 o以及琼脂糖凝胶电泳分析均按萨母布鲁克等kusstl的方法进行 o构建的正义植物表达载
体命名为 ³…Œ°„t ∀
t1u1w 农杆菌转化 按照萨母布鲁克等kusstl的方法制备农杆菌k ΑγροβαχτεριυµlŠ∂vtst感受态 o采用热激
法将质粒 ³…Œ°„t和 ³…Œtut转化到农杆菌 Š∂vtst o热激温度为 wu ε o时间为 |s ¶∀
t1u1x 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生 接种转化农杆菌阳性单克隆在含卡那霉素 xs
°ª#pt的 …培养基中振荡培养过夜 o取 x °菌液加入 xs °含卡那霉素 xs °ª#pt的 …培养基中 ouss
µ#°¬±pt振荡培养至 ’⁄yss为 s1x左右备用 ∀用解剖刀将鲜嫩的烟草组培苗叶划成条状 o放入备好的菌液中
x °¬±o取出沥干后 o共培养 v §o再转入含有卡那霉素和氨苄青霉素的选择培养基中分化再生抗性植株 ∀
t1u1y 转化植株 °≤• 和 ≥²∏·«¨µ±鉴定 用 ≤ׄ…法提取转化烟草植株的基因组 ⁄‘„ ∀ °≤• 鉴定采用 ux ˏ
体系 ∀具体条件为 |w ε 预变性 x °¬±~|w ε t °¬±和 y{ ε t °¬± vs ¶为一个循环 o共 vx个循环 ~zu ε 延伸
z °¬±∀转化烟草的 °≤• 分子检测采用插入基因片段和载体上的 νπτ µ基因序列 °≤• 联合检测 ∀设计引物
≤≤tƒ }xχ2׊Š×≤ׄŠ„Š×ŠŠ≤×ׄ≤××≤׊×≤„ׄ׊2vχ ~ ≤≤t• }xχ2≤×≤ŠŠ„×≤≤„ŠŠ„׊≤„≤„×׊≤≤×≤×≤Š„2vχ和
引 物 ±³·µƒ } xχ2„„≤„„Š„׊Š„×׊≤„≤Š≤„ŠŠ××≤×≤≤ŠŠ2vχ ~ ±³·µ • } xχ2Š„„≤×≤Š×≤„„Š„„ŠŠ≤Š„ׄ
Š„„ŠŠ≤Š„×2vχ o同时检测插入基因片段和表达载体的 νπτ µ基因片段 ∀
≥²∏·«¨µ±杂交按照 ⁄ŒŠ ‹¬ª«°µ¬°¨ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± ≥·¤µ·¨µŽ¬·´ 试剂操作指南进行 o转基因烟
草基因组 ⁄‘„用内切酶 Φοξ ´消化 ∀探针设计选取 νπτ µ基因中约 vxs ¥³的 ⁄‘„片段为杂交探针 ∀
t1u1z 转基因烟草的表型测定 测定转基因阳性烟草的株高 !节间距 !基径 !叶片的长度和宽度 ~测定次生
木质部厚度 !胞壁厚度 ∀
u 结果与分析
211 基因克隆
以毛白杨 ¦⁄‘„为模板 o克隆了基因 ΠτοΧεσΑ1 o其基因序列为 v utx ¥³o与欧洲颤杨的 ΠτρΧεσΑ1 的同源
性为 |z h k²¶«¬oussvl ∀该基因具有开放的阅读框 o编码区在 xu ∗ u |{{碱基之间 o为 u |vz ¥³o编码 |z|个
sw 林 业 科 学 wv卷
氨基酸 ∀将其与典型的植物纤维素合酶基因k•¬¦«°²±§ ετ αλqousss ~ •¬¦«°²±§ousssl进行比较 o结构特点如
图 t }具有纤维素合酶共有的 ⁄o⁄o⁄±÷÷• • 保守区 ox个植物纤维素合酶所特有的保守区 ≤•2° ou个植物纤
维素合酶基因所特有的高变区 o{个跨膜区 o因此确认 v utx ¥³的 ⁄‘„片段为毛白杨的一个全长纤维素合
酶基因 o命名为 ΠτοΧεσΑ1基因kŠ¨ ±…¤±®注册号 ⁄±sswxzsl ∀
图 t °·²≤ ¶¨„t纤维素合酶的结构
ƒ¬ªqt ≥·µ∏¦·∏µ¨ ²©°·²≤ ¶¨„t ¦¨¯¯∏¯²¶¨ ¶¼±·«¤¶¨
212 表达载体的构建及鉴定
采取了如下策略将全长基因两步克隆到植物表达载体 ³…Œtut中k图 ul ∀从编码区的第 t个碱基开始计
数 o从 t zzu至 t zu{的碱基序列与 Βαµ ‹ ´的碱基序列只相差一个碱基 o即 t zuu位的碱基 „ o它在编码氨基
酸的密码子中正好为第 v个碱基 o根据氨基酸密码子的规律 o密码子第 v个碱基的变化不会影响它所编码的
氨基酸k图 vl o因此通过设计引物 }³¤t¥¤°«µxχ2ª¦·ªª¤·¦¦·ª¤ª¦¤ªª¦·¦·¦··ª¤ª2vχ和 ³¤t¥¤°«©xχ2·¦¤ªª¤·¦¦
¤ª¦·ª¤ªª·³¯¤±·2¶³¨¦¬©¬¦¦²±¶¨µ√¨ §µ¨ª¬²± ¤·¤¦¤ª¤ª¤·ª¦2vχ将 t zuu位的碱基 „变为碱基 Šk下划线的 Šl o引入了
酶切位点 Βαµ ‹ ´ ∀以引入的 Βαµ ‹ ´酶切位点为分界点将全长基因分为 ΠτοΧεσΑ12…• 和 ΠτοΧεσΑ12…ƒ 两
段 ∀其中 ΠτοΧεσΑ12…ƒ带有 Σαχ´酶切位点 ∀先利用 Σαχ´ 和 Βαµ ‹ ´ u个酶切位点将不带 Σαχ´酶切位点
ΠτοΧεσΑ12…• 连入植物表达载体 ³…Œtut中 o然后利用 Βαµ ‹ ´和 Ξβα´酶切位点将 ΠτοΧεσΑ12…ƒ连入 ³…Œtut2
…• 载体上 o构建好的表达载体命名为 ³…Œ°„t ∀总体的构建策略见图 u ∀
根据表达载体 ³…Œ°„t酶切位点的分析 o该载体经 Σαχ ´单酶切后与用 Ξβα´和 Βαµ ‹ ´ 双酶切后 o应
出现 u条带谱 o一条带谱超过 {1s ®¥o一条为 t1z ®¥左右 ∀³…Œ°„t表达载体质粒 ⁄‘„酶切电泳后出现如下
电泳谱k图 wl o符合预期结果 ∀用 ΠτοΧεσΑ1 基因的两端引物进行 °≤• 检测扩增出预期目的大小的片段k图
xl ∀证明全长基因 ΠτοΧεσΑ1基因已构建到植物表达载体 ³…Œ°„t中 ∀
213 转化烟草的分子检测
转基因烟草的 ΠτοΧεσΑ1基因片段检测和 νπτ µ序列检测都为阳性 o°≤• 检测的电泳图见图 y ∀
为了进一步证明目的基因片段已整合到转基因植株的基因组中 o提取 °≤• 检测为阳性的植株的基因组
⁄‘„进行 ≥²∏·«¨µ± 杂交检验k图 zl ∀以未转化的烟草基因组 ⁄‘„ 为阴性对照 ∀试验结果表明 }转化
ΠτοΧεσΑ1基因的烟草基因组 ⁄‘„ 酶切的片段能够与 νπτ µ基因片段标记的探针结合 ~而对照烟草的基因组
⁄‘„ 酶切的片段不能与 νπτ µ基因片段标记的探针结合 o说明外源基因已经整合到烟草的基因组中 ∀
214 转基因烟草的表型
转基因烟草表现为植株生长受到抑制 o植株高度低于对照植株 o基径和叶片均小于对照植株 ∀转基因植
株的基部木质部厚度也比对照植株和野生型植株小 o纤维细胞壁厚度也有所减小k图 { o表 tl ∀而空载体
³…Œtut的转基因烟草与野生型烟草的表型差异不显著 ∀
v 讨论
植物纤维素合酶基因的研究近年来获得了可喜的进展 o在 ws多个不同植物中 o已有 tyw sss多个与纤维
素合酶基因相关的序列报道 o序列比较分析表明 o不同物种之间的同源纤维素合酶基因的同源性远高于同一
物种中不同纤维素合酶基因之间的同源性k≥¤¬¨ ±¤ ετ αλqoussxl ∀拟南芥纤维素合酶基因突变体的发现为纤
tw 第 v期 李春秀等 }毛白杨纤维素合酶基因k ΠτοΧεσΑ1l的克隆及其在烟草中的遗传转化
图 u ΠτοΧεσΑ1 基因植物表达载体的构建
ƒ¬ªqu ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ²© ΠτοΧεσΑ1
维素合酶基因精细功能的研究提供了可能 o在拟南芥已获得纤维素合酶基因的突变体 x个 o相应的纤维素合
酶基因功能得到了初步鉴定k周晓馥等 oussul ∀但林木作为多年生植物 o其纤维素合酶基因的功能研究非
常困难 ∀在欧洲颤杨中先后报道了 ΠτρΧεσΑ1 , ΠτρΧεσΑ2 , ΠτρΧεσΑ3 , ΠτρΧεσΑ4 , ΠτρΧεσΑ5 , ΠτρΧεσΑ6 共 y个基因
k• ¬¨·¨µoussu ~≥¤·²¶«¬ετ αλqoussu ~«²±ª ετ αλqoussvl o但由于纤维素合酶基因较长 o全长转基因功能鉴定相
对困难 o至今都还没有转基因的功能研究报道 o各基因的确切功能及各基因的相互作用模式都还不清楚 ∀在
烟草和拟南芥中开展的纤维素合酶基因转基因功能的研究 o都是从反义敲除的途径来研究的 o均没有纤维素
uw 林 业 科 学 wv卷

图 v 同义突变引入 Βαµ ‹ ´在 ΠτοΧεσΑ1 中的位置
ƒ¬ªqv Œ±·µ²§∏¦·¬²± Βαµ ‹ ´ ¶¬·¨¬± ΠτοΧεσΑ1 ¥¼ ¶¼±²±¼°²∏¶°∏·¤·¬²±
图 w 植物表达载体 ³…Œ°„t的酶切电泳图
ƒ¬ªqw Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©³…Œ°„t ¥¼ §¬ª¨¶·¬²±
t } Σαχ´ 酶切产物 ⁄¬ª¨¶·¬²± ¥¼ Σαχ´ ~u } Ξβα´和
Βαµ ‹ ´ 双酶切产物 ⁄¬ª¨¶·¬²± ¥¼ Ξβα´ ¤±§ Βαµ ‹ ´ ~
v }分子量标记 ²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·°¤µ®¨µq
图 x 植物表达载体 ³…Œ°„t的 °≤• 鉴定
ƒ¬ªqx °≤• ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ΠτοΧεσΑ1 ©µ²° ³…Œ°„t
图 y ³…Œ°„t表达载体转基因烟草的 νπτ µ和
ΠτοΧεσΑ1 基因片段联合 °≤• 联合检测
ƒ¬ªqy ≤²2§¨·¨¦·¬²± ²© νπτ µª¨ ±¨ ¤±§ ΠτοΧεσΑ1
©µ¤ª°¨ ±·²©·µ¤±¶ª¨±¬¦·²¥¤¦¦² º¬·«³…Œ°„t
t p v }扩增的 ΠτοΧεσΑ1 基因片段 ΠτοΧεσΑ1 ©µ¤ª° ±¨·²©
µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²~w o{ }阴性对照 ‘²±2·µ¤±¶©²µ°¨ §·²¥¤¦¦²¶¤°³¯¨¤¶
±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~x p z }扩增的 νπτ µ基因片段 νπτ µ©µ¤ª° ±¨·²©
·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²q
图 z ΠτοΧεσΑ1 转基因烟草的 ≥²∏·«¨µ±杂交结果
ƒ¬ªqz ≥²∏·«¨µ± §¨·¨¦·¬²± ²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² º¬·« ΠτοΧεσΑ1
t p v }转基因烟草植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² º¬·« ΠτοΧεσΑ1 ~ • × }野
生型烟草k阴性对照l • ¬¯§·¼³¨ ·²¥¤¦¦²k±¨ ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯l q转基
因烟草基因组 ⁄‘„用内切酶 Φοξ ´消化 ⁄‘„ ²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
·²¥¤¦¦²§¬ª¨¶·¨§¥¼ Φοξ ´ q
表 1 成熟 ΠτοΧεσΑ1 转基因烟草植株的表型 ≠
Ταβ .1 Μορπηολογιχ φεατυρεσ οφ τηε µατυρε τρανσγενιχ τοβαχχοσ ωιτη ΠτοΧεσΑ1
烟草类型
ײ¥¤¦¦²·¼³¨
株高 °¯ ¤±·
«¨¬ª«·Π¦°
基径 …¤¶¤¯
§¬¤° ·¨¨µΠ¦°
叶片 ¨¤©Π¦°
长 ¨±ª·« 宽 •¬§·«
木质部厚度
÷¼¯ °¨
·«¬¦®±¨ ¶¶Π°°
胞壁厚度
׫¬¦®±¨ ¶¶²©©¬¥¨µ
¦¨¯¯ º¤¯ Π¯Λ°
野生型烟草 • ¬¯§·¼³¨ |{1z ? tt v1| ? s1u t{1y ? t1t z1| ? s1y u1u ? s1sx w1ux ? s1v
³…Œtut转基因烟草k对照l
×µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² º¬·«³…Œtutk≤Žl |w1x ? |1x w1t ? s1w t{1t ? s1| {1u ? s1z u1s ? s1sv w1zx ? s1x
ΠτοΧεσΑ1 转基因烟草
×µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² º¬·« ΠτοΧεσΑ1 xz1v ? z1y u1z ? s1v tu1| ? s1{ x1{ ? s1x t1t ? s1su u1xz ? s1u
≠ 表中数据为 v ∗ x个样品平均值 ? 标准误 ∀⁄¤·¤¤µ¨ ·«¨ °¨ ¤± ? ≥⁄²©·«µ¨¨·²©¬√¨¶¤°³¯ ¶¨q
合酶基因正义全长转基因的研究报道 ∀ …∏µ·²±等kusssl利用病毒诱导植物纤维素合酶基因沉默的方法来研
究 ΧεσΑ基因的功能 o将与 ΧεσΑ基因相关的 v个特异 ¦⁄‘„片段分别插入马铃薯k Σολανυµ τυβεροσυµl÷ 病毒
vw 第 v期 李春秀等 }毛白杨纤维素合酶基因k ΠτοΧεσΑ1l的克隆及其在烟草中的遗传转化
图 { ΠτοΧεσΑ1 转基因烟草的表型
ƒ¬ªq{ ²µ³«²¯²ª¬¦©¨¤·∏µ¨¶²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
·²¥¤¦¦²¶º¬·« ΠτοΧεσΑ1
t ou }转基因植株 ×µ¤±¶©²µ°¨ §³¯¤±·º¬·« ΠτοΧεσΑ1 ~
¦®}³…Œtut空载体对照植株 ³…Œtut ¦²±·µ²¯ ³¯¤±·q
载体中 o接种到烟草上进行基因功能分析 ∀结果感染的植
株表现出节间缩短 !小叶和侏儒症状 o叶表面由于缺少纤维
素而表现为细胞膨胀 o叶片的多聚糖含量降低了 ux h ∀
ΧεσΑ基因的转录水平降低 o表明 ¦⁄‘„ 片段沉默了一个或
多个纤维素合酶基因的表达 ∀
本研究从中国的乡土树种毛白杨中克隆得到了欧洲颤
杨 ΠτρΧεσΑ1基因的同源基因 ΠτοΧεσΑ1 o构建了全长的正义植
物表达载体 o获得了烟草转基因植株 ∀阳性转基因植株的
表型与已报道的烟草纤维素合酶基因反义转基因植株表型
有相似之处 o都表现为植株的生长受到抑制 o即解剖和显微
构造上出现木质部的厚度和纤维细胞壁厚度有所下降 o形
态特征表现为植株的株高降低 o叶片变小 ∀这些研究结果
说明 o本研究克隆的毛白杨的纤维素合酶基因直接参与植
物纤维素的生物合成 ∀但是 o为什么正义植物表达载体在
烟草中的表达会抑制植株的生长 ‚现有的研究结果表明 o
单个纤维素合酶是组装在纤维素复合体中参与纤维素的生
物合成 ∀也就是说 o复合体中某一个纤维素合酶的过量表
达不会影响纤维素合酶复合体的数量 o不会促进纤维素的
合成k⁄²¥¯¬± ετ αλqoussul ∀本研究的结果显示 oΠτοΧεσΑ1 基
因的过量表达不但没有促进植株的生长 o反而抑制了植株的生长 ∀试验结果和预期结果的差异 o可以用转基
因研究中常见的转录后基因沉默现象k°×Š≥l得到合理的解释 o即正义转基因植株由于转录后基因的沉默 o
表现出反义抑制的表型 ∀‘¤³²¯¬等kt||sl最早发现了这一现象 o他们利用查尔酮合酶基因 ΧΗΣ转化紫花矮
牵牛k Πετυνια ηψβριδαl o预期使花色加深 o结果却得到许多浅色和杂色花 o因此发现了基因沉默 ∀²µª¨±¶¨±
kt||sl则将这一现象称为共抑制现象k¦²2¶∏³³µ¨¶¶¬²±l ∀随后 Š∏²等kt||xl在线虫的 παρ21 基因研究中 o向线
虫注射反义 • ‘„ o期望造成 παρ2t基因失活 o却发现注射正义 • ‘„的对照也出现 παρ2t基因关闭现象 ∀ ƒ¬µ¨
等kt||{l明确了造成这种现象的原因是双链 • ‘„的作用 o在动物中被称之为 • ‘„干扰k• ‘„ ¬±·¨µ©¨µ¨±¦¨l ∀
在植物研究中 o这种由双链 • ‘„ 诱导的抑制基因表达的现象 o一般被称为转录后基因沉默 k°×Š≥l
k…¤∏¯¦²°¥¨ ousssl ∀可见 ³…Œ°„t在烟草中的表达可能在烟草体内转录形成了双链 • ‘„k§¶• ‘„l o诱导抑制
了 ΠτοΧεσΑ1在烟草中的内源同源基因的表达 o影响了烟草纤维素的生物合成 o从而抑制了转基因烟草的生
长 ∀另一方面 o还可以从纤维素生物合成的机制角度分析其原因 o可能 ΠτοΧεσΑ1 在转基因植株中的过量表
达 o使纤维素合酶复合体中某一个亚基的相似亚基过量表达 o打破了纤维素合酶复合体组装的外部环境 o进
而影响了复合体的组装 o从而影响了纤维素的生物合成k•²¥¼±ousstl ∀下一步将利用本研究获得的全长正
义表达载体的转基因植株作为材料 o研究其外源基因在植株内表达情况和作用机制 o为研究纤维素合酶作用
机制提供更好的理论依据 ∀
参 考 文 献
周晓馥 o王景余 o王兴智 qussu q植物纤维素合成酶基因的研究进展 q遗传 ouwkvl }vzy p vz{
萨母布鲁克 o拉塞尔 ⁄ • qusst q分子克隆实验指南 qv版 q黄培堂等 o译 q北京 }科学出版社 ou p tvz
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k责任编辑 徐 红l
xw 第 v期 李春秀等 }毛白杨纤维素合酶基因k ΠτοΧεσΑ1l的克隆及其在烟草中的遗传转化