全 文 ：第 wt卷 第 x期
u s s x年 | 月
林 业 科 学
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∂²¯1wt o‘²1x
≥ ³¨qou s s x
肉桂离体胚超低温保存研究 3
陈礼光 郑郁善 李庆荣 张祝金
k福建农林大学林学院 福州 vxsssul
摘 要 } 对不同含水量肉桂离体胚进行超低温k‘ul保存 o采用不同冷冻方式 !解冻方式及防冻剂预处理 o并测定
超低温保存前后的脱氢酶 !电导率 !Αp淀粉酶生理生化指标 ∀结果表明 }超低温保存的技术关键是减少保存材料
在脱水过程中所受的伤害 o以及采用适宜的冷冻和解冻方式和添加适宜的防冻剂 ∀防冻剂预处理可以适当提高保
存含水量 o增加含水量范围 ∀肉桂离体胚没有添加防冻剂时最适宜保存含水量为 vs h ∗ ws h k ωΒ ωl o采用快冻快
解处理 ∀防冻剂预处理后的保存效果比没有防冻剂预处理的更佳 o采用缓冻快解或快冻缓解处理较为适宜 ∀
关键词 } 肉桂 ~超低温保存 ~离体胚 ~含水量 ~防冻剂
中图分类号 }≥zt{1wv ~≥zuu1tn z 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsx p ssv{ p sz
收稿日期 }ussw p sy p sv ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kv|yzsys{l和中国教育部/高等学校骨干教师资助计划0kusss p yxl基金项目 ∀
3 郑郁善为通讯作者 ∀
Στυδψ οφ Χρψοπρεσερϖατιον ον Χινναµοµυµ χασσια Εξχισεδ Εµ βρψοσ
≤«¨ ± ¬ª∏¤±ª «¨ ±ª ≠∏¶«¤± ¬±¬±ªµ²±ª «¤±ª«∏­¬±
k Φορεστρψ Χολλεγε οφ Φυϕιαν Αγριχυλτυραλανδ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Φυζηου vxsssul
Αβστραχτ } …¼·¤®¬±ª§¬©©¨µ¨±·©µ¨ ½¨¬±ª°¨ ·«²§o·«¤º¬±ª°¨ ·«²§¤±§¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶¤¶·µ¨¤·°¨ ±·©¤¦·²µ¶o·«¨ ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±²©
Χινναµοµυµ χασσια ¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶ º¬·« §¬©©¨µ¨±·°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·º¤¶ ¶·∏§¬¨§o ¤±§ ·«¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼o ·«¨
¦²±§∏¦·¬√¬·¼ ¤±§Α2¤°¼¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼ º¨ µ¨ °¨ ¤¶∏µ¨§¤±§¦²±·µ¤¶·¨§¤©·¨µ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¬±ª º¬·«¥¨©²µ¨ q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º¨ §·«¤··«¨
®¨ ¼ ²©¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±·¨¦«±²¯²ª¼ °∏¶·¥¨ ¶∏¦¦¨ §¨¨§¬± µ¨§∏¦¬±ª·«¨ «¤µ° ²©¦²±¶¨µ√¤·¬²± °¤·¨µ¬¤¯¶§∏µ¬±ª·«¨ §¨¶¬¦¦¤·¬²± ¤±§
¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ³µ²¦¨¶¶o¥¼ ·¤®¬±ª·«¨ ²³·¬°∏° °¤ª±¬·∏§¨ ¤±§·¼³¨ ²© ¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶o©µ¨ ½¨¬±ª ¤±§·«¤º¬±ª °¨ ·«²§q ׫¨
³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ©¨©¨¦·¶¤§§¬±ª·«¨ ¶∏¬·¤¥¯¨ ¤±·¬©µ¨ ½¨¨ ¶¥µ²¤§¨ ±¨ §·«¨ ²³·¬°∏° ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¬±ª °²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·¯¨ √¨ ¯o ¤±§·«¨ ±
±¨¯¤µª¨§·«¨ ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¨ §¶¦¤¯¨²© °²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¨ §º¬·«²∏·¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶o·«¨ ¶∏¬·¤¥¯¨°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·²©·«¨
Χqχασσια ¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶¬¶vs h ∗ ws h q„±§·¤®¬±ª ∏´¬¦®©µ¨ ½¨¬±ª2 ∏´¬¦®·«¤º¬±ª°¨ ·«²§¶º¤¶¥¨·¨µ·«¤±²·«¨µ¶q’·«¨µº¬¶¨ o
·«¨ ©¨©¨¦·¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¨ § º¬·«¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶º¤¶°∏¦« ¥¨·¨µ·«¤±·«¤·º¬·«²∏·¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶o¤¶¶²¦¬¤·¨§ º¬·« °¬¯§©µ¨ ½¨¬±ª2
∏´¬¦®·«¤º¬±ª °¨ ·«²§¶²µ ∏´¬¦®©µ¨ ½¨¬±ª2°¬¯§·«¤º¬±ª °¨ ·«²§¶q
Κεψ ωορδσ} Χινναµοµυµ χασσια~¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±~ ¬¨¨µ¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶~°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·~¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶
肉桂k Χινναµοµυµ χασσιαl是一种在常温下既不耐脱水又不耐贮藏k•²µ¥¨µ·¶ot|zvl的高含水量顽拗性种
子kµ¨¦¤¯¦¬·µ¤±·¶¨ §¨¶l ∀人们通常在种子采收后将种子与湿润物充分混合后贮藏延长其寿命 o以达到短期k一
般只有几周到几个月l贮藏的目的k傅家瑞 ot||t ~陈建勋等 ot|||l ∀如何长期有效地保存顽拗性种子已经日
益受到国内外种质资源工作者的重视 ∀超低温保存 o又称液态氮k‘ul保存 o目前被认为是最有希望的途径
k郑郁善等 ousst ~殷晓辉等 ot||y ~陈礼光等 ousstl ∀然而在国内 o超低温保存技术用于林木种子保存的研究
为时尚短k陆旺金等 ot||{l o供试种类又少 o这就给成功地长期保存林木种子造成很大困难 ∀许多研究认为 o
在 p t|y ε 低温下 o种子的一切生理代谢和分裂活动基本上处于静止状态k¤±·¨¯¯ ετ αλqot|{vl o种子保存时
间长短对种子活力无显著影响k徐刚标等 ot||{ ~吴永杰等 ot|||l ∀通过适度脱水来避免或减轻在冷冻或解
冻过程中的低温伤害是超低温保存成功的关键kƒ∏ ετ αλqot||v ~•∏«¯ ετ αλqot|{{l ∀和种子相比 o种胚具有较
高的脱水耐性和较弱的低温敏感性 o而且蕴含了种子绝大部分的遗传信息 o体积小 o是超低温保存的理想材
料k≤«¤±§¨¯ ετ αλqot||x ~°¨ ±¦¨ ot||u ~Šµ²∏·ετ αλqot|{vl ∀本文以肉桂离体胚为对象 o研究超低温保存后脱氢
酶活性 !电导率 !Αp淀粉酶活性 o为肉桂种子的长期保存提供理论依据 ∀
t 研究材料和方法
111 材料
ussv年在福建华安金山林场的肉桂人工林内采集种子 o室内消毒湿藏备用 ∀在不伤及胚的前提下 o在
种胚部位切取约 x °° ≅ x °° ≅ x °°的胚块 o制备离体胚 ∀
112 方法
t1u1t 离体胚含水量k简作 ≤l 根据5国际林木种子检验规程6k国际种子检验协会 ot|||l规定 o将离体胚
切碎 o采用ktsx ? ul ε 烘 { «测定相对含水量 }Ξs € k鲜质量 p绝干质量lΠ鲜质量 ≅ tss h ∀用 vs ε n硅胶法
制备离体胚各种含水梯度 o使其含水量降至 xs h !wx h !ws h !vx h !vs h和 us h o失水过程中经常更换硅胶 o
采用减重法来换算 }Ξ € ≈t p最初质量 ≅ kt p Ξsl最后质量   ≅ tss h ∀
t1u1u 冷解冻程序 以未经超低温保存为对照k≤Žl o采用 {kwt ≅ uwl和 t{kyt ≅ vyl正交试验设计k洪伟 o
t||tl进行因子水平安排k表 t o表 ul o其中 t{kyt ≅ vyl正交试验设计包含防冻剂预处理试验 o经各种冷冻流
程 o接着将各处理投入到液态氮保存 u §o然后进行解冻处理k图 tl o处理后测定脱氢酶活性 !电导率和 Αp淀
粉酶活性 ∀
图 t 冷解冻流程
ƒ¬ªqt ƒµ¨ ½¨¬±ª¤±§·«¤º¬±ª³µ²¦¨¶¶
冷冻方式 ƒµ¨ ½¨¬±ª °¨ ·«²§¶~א }解冻方式 ׫¤º¬±ª °¨ ·«²§¶~≥×° }停留时间 ≥·¤¼¬±ª·¬°¨ ~ ±ƒ }快冻 ±∏¬¦®©µ¨ ½¨¬±ª~ ƒ }缓冻 ¬¯§©µ¨ ½¨¬±ª~
≥ƒ }慢冻 ≥¯ ²º ©µ¨ ½¨¬±ª~ ±× }快解 ±∏¬¦®·«¤º¬±ª~ × }缓解 ¬¯§·«¤º¬±ª~≥× }慢解 ≥¯ ²º·«¤º¬±ªq下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
表 1 Λ8 (41 ≅ 24 )正交试验设计因子水平安排表 ≠
Ταβ .1 Τηε αρρανγεµεντ οφ φαχτορσ ανδ λεϖελσ οφ ορτηογοναλ
εξπεριµεντ δεσιγν οφ Λ8 (41 ≅ 24 )
因素
ƒ¤¦·²µ¶
水平 ¨√¨ ¶¯
t u v w
≤Πh us vs ws ys1utk自然 ’µ¬ª¬±¤¯l
ƒ ±ƒ ƒ
א ±× ≥×
≠ ≤ }含水量 ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨ ¥¨ ²¯º q
t1u1v 脱氢酶活性测定 采用 ××≤ku ov ox
p三苯基四氮唑l染色法k黄学林等 ot||sl ∀
每个处理 w个重复 o每个重复 vs个离体胚 o
用 s1t h kºΒ√l××≤溶液 o在 vx ε 黑暗条件下
保温染色 y «o按/ ××≤定位图形法0作肉桂种
子生活力鉴定 ∀然后再加丙酮及少许分析
表 2 Λ18 (61 ≅ 36 )正交试验设计因子水平安排表
Ταβ .2 Τηε αρρανγεµεντ οφ φαχτορσ ανδ λεϖελσ οφ ορτηογοναλ εξπεριµεντ
δεσιγν οφ Λ18 (61 ≅ 36 )
水平
¨√¨ ¶¯
因素 ƒ¤¦·²µ¶
≤Πh ƒ א
添加液 „§§¬·¬√¨ Πh
甘油
Š¯ ¼¦¨µ²¯kϖΒϖl
二甲亚砜
⁄≥’k ωΒϖl
聚乙二醇
°∞ŠkϖΒϖl
t vs ±ƒ ±× x x x
u vx ƒ × ts ts ts
v ws ≥ƒ ≥× tx tx tx
w wx
x xs
y ys1utk自然 ’µ¬ª¬±¤¯l
纯石英充分研磨 o用丙酮冲洗研
钵 u ∗ v次 o合并洗涤液倒入 ts
°离心管中 o于 w sss ≅ ª条件
下离心 ts °¬±∀取上清液在 w|s
±°波长下用 zu p t型分光光度
计测定 ’⁄w|s值 o从标准曲线中
查出相应的还原态 ××≤ 含量 ∀
脱氢酶活性以每 vs个种胚中含
有 ××≤还原物含量 o即三苯基甲
k××≤‹l含量kΛª#°ptl表示 ∀
t1u1w 电导率测定 ⁄⁄≥ p vsz
型电导率仪测定法k黄学林等 o
|v 第 x期 陈礼光等 }肉桂离体胚超低温保存研究
t||sl ∀选择大小均匀 !颗粒饱满 !无损伤的肉桂离体胚 o用蒸馏水冲洗干净后 o加入 xs °蒸馏水 o在恒温箱
中浸泡 { «后 o先测在 ux ε 条件下的电导率k Σtl ∀然后将浸泡液连同离体胚在沸水中煮 tx °¬±o冷却至 ux
ε 左右后再测定电导率 o称之为绝对电导率k Σul o以不加种子的蒸馏水为空白对照 ∀然后计算相对电导率 }
Σµ€ ΣtΠΣu ≅ tss h ∀
t1u1x Αp淀粉酶活性测定 Œu p ŽŒ显色法k黄学林等 ot||sl ∀处理的肉桂离体胚 o剥取种胚 vs个 o用 x °
醋酸研磨缓冲液将其研磨成匀浆 o再用 x °醋酸研磨缓冲液冲洗 ∀并将其移至试管中 o在 zs ε 恒温水浴 us
°¬±o同时不断振荡试管 o使其充分反应 ∀在 w sss ≅ ª离心 x °¬±∀将上清液用研磨缓冲液定容至 ts °作为
酶试剂 ∀吸取 t °酶制剂放入试管 o然后加入 t °反应缓冲液和 t °淀粉溶液 o摇匀后放在 vz ε 恒温中
加热 s ox和 ts °¬±o再分别吸取 s1v °反应混合液放入试管中 o迅速加入 t °显色剂和 v °蒸馏水 o充分
混合 o测 ’⁄yusksl o’⁄yuskxl o’⁄yusktsl值 ∀淀粉酶活性用单位时间k°¬±l内水解淀粉的质量数k°ªl表示 ∀
u 结果与分析
211 脱氢酶活性分析
脱氢酶是种子呼吸过程中的一种重要的还原酶 o其活性的高低与种子的发芽力密切相关k׫µ²±¨ ¥¨µµ¼ ετ
αλqot|xxl o与种子的呼吸强度呈正相关 ∀脱氢酶活性的迅速下降 o常伴随着种子发芽力的迅速丧失k郑光
华 ot|{x ~郑郁善 oussul ∀所测脱氢酶活性反映了细胞代谢的还原能力和离体胚损伤程度 o是种子活力的重
要生化指标 ∀
图 u 不同含水量肉桂离体胚脱氢酶活性
ƒ¬ªqu ⁄¨ «¼§µ²ª¨ ±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶²© Χq χασσια
¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶º¬·«√¤µ¬²∏¶°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·
u1t1t 超低温保存前脱氢酶活性 肉桂离体胚在 vs ε n硅胶条件下
干燥过程中 o随脱水程度的加深 o其 ××≤‹含量不断降低 o新鲜的肉桂
离体胚 ××≤含量最高 o每 vs个胚达到 tt1sxt Λª#°pt o表明脱氢酶活
性强 o种子代谢能力强 ~含水量在 tx h ∗ vs h这个范围内 o××≤‹ 含量
降幅较小 o且能够维持在较高水平 o表明所受的伤害较小 o其活性比较
大 ∀当含水量小于 tx h时 o肉桂离体胚造成严重的脱水伤害 o××≤‹含
量急剧下降 o此时已不适合贮藏 k图 ul ∀方差分析表明 }Φ€ vsz1txx
 Φs1stk| ovsl € v1syy o含水量因素造成的差异达极显著水平 ∀因此 o
肉桂离体胚耐脱水性弱 o属高顽拗度种子kƒ¤µµ¤±·ετ αλ1 ot|{{l ∀
u1t1u 超低温处理后肉桂离体胚脱氢酶活性 按照 {kwt ≅ uwl正交
设计 o将 ts h !tx h !us h和自然含水量离体胚进行超低温保存试验 ∀
表 3 超低温保存后肉桂离体胚(30 个胚)脱氢酶活性
Ταβ .3 ∆εηψδρογενασε αχτιϖιτιεσ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ
(30 εµ βρψοσ) αφτερ χρψοπρεσερϖατιον Λª#°pt
处理因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
·µ¨¤·° ±¨·¶
不同处理水平脱氢酶活性
⁄¨ «¼§µ²ª¨ ±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶¤·§¬©©¨µ¨±··µ¨¤·°¨ ±·¯ √¨¨ ¶¯
t u v w
极差
¤¬q√¤µ¬¤·¬²±
≤ u1usu v1zv| w1w{y u1zss u1u{x
ƒ v1wuz v1tvy s1u|t
א v1x|v u1|zs s1yuv
结果表明 }超低温保存对离体胚的含水量有
极大的影响 ow个水平间的最大差异为 u1u{x
k表 vl o经方差分析k表 wl oΦ € vst1wu| 
Φs1stkv oul € ||1u o表明各含水量之间差异达
到极显著水平 ~解冻方式也达到极显著水
平 oΦ€ tts1{xz  Φs1st kt oul € |{1x o说明解
冻方式对超低温保存是一个重要因素 ~冷冻
方式差异达显著水平 ∀可见 o含水量是关键
因素 o肉桂离体胚含水量为 vs h ∗ ws h能够维持较高的脱氢酶活性 o当含水量为 ws h时其脱氢酶活性最高 o
表明种子所受的伤害最小 o其活力最强 ∀在冷冻方式中 o缓冻和快冻方式脱氢酶活性非常接近 ~在解冻方式中 o
快解方式的脱氢酶含量较高 ∀因此快冻快解组合的方式使体胚维持较高的脱氢酶活性kw1w{y Λª#°ptl∀
肉桂种子在超低温保存过程中 o由于其耐脱水能力差 o其保存含水量高 o以 vs h ∗ ws h为宜 ∀正因如
此 o加大了肉桂离体胚超低温保存难度 o主要是因为其保存含水量相对较高 o在进行超低温保存时降温和升
温过程中易受低温伤害 ∀
u1t1v 防冻剂预处理超低温保存肉桂离体胚脱氢酶活性 为了尽可能减轻甚至避免肉桂离体胚在超低温
sw 林 业 科 学 wt卷
表 4 超低温保存后肉桂离体胚脱氢酶活性方差分析
Ταβ .4 ς αριανχε αναλψσισ οφ δεηψδρογενασε αχτιϖιτιεσ οφ Χ . χασσια
εξχισεδ εµ βρψοσ αφτερ χρψοπρεσερϖατιον
变异来源 ∂¤µ¬¤·¬²± ¶²∏µ¦¨ ≥≥ ⁄ƒ ≥ Φ ΦΑ
≤ y1vvs v u1tts vst1wu| Φs1stkv oul € ||1u
ƒ s1ty| t s1ty| uw1twv Φs1sxkv oul € t|1u
א s1zzy t s1zzy tts1{xz Φs1stkt oul € |{1x
剩余方差 ≥∏µ³¯∏¶√¤µ¬¤·¬²± s1stw u s1ssz Φs1sxkt oul € t{1x
总和 ײ·¤¯ z1u|s z
保存过程受到低温伤害 o采取适当的措施是
必需的 ∀其中常用的方法之一就是进行防
冻剂预处理 ∀按照 t{ kyt ≅ vyl正交设计进
行防冻剂预处理后肉桂离体胚超低温保存
试验 o处理因素包括含水量 !冷冻方式 !解冻
方式和防冻剂k包括甘油 !二甲亚砜和聚乙
二醇ly个因素 o试验结果见表 x和表 y ∀
防冻剂预处理后进行超低温保存 o肉桂
离体胚脱氢酶活性随含水量的变化而变化 o
表 5 防冻剂预处理超低温保存肉桂离体胚(30 个胚)的脱氢酶活性
Ταβ .5 ∆εηψδρογενασε αχτιϖιτιεσ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ (30
εµ βρψοσ) χρψοπρεσερϖεδ ωιτη χρψοπροτεχταντσ πρετρεατµεντ Λª#°pt
处理因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
·µ¨¤·° ±¨·¶
不同处理水平脱氢酶活性
⁄¨ «¼§µ²ª¨ ±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶¤·§¬©©¨µ¨±··µ¨¤·° ±¨·¯ √¨¨¯¶
t u v w x y
极差
¤¬q√¤µ¬¤·¬²±
≤ x1tuv x1x|w x1{wv w1xzs w1uvz v1xwx u1u||
ƒ w1xu{ x1s|y w1{vv s1xy{
א w1|ty w1{{{ w1yxv s1uyv
甘油 Š¯ ¼¦¨µ²¯ w1zzz w1{zw w1{sx s1s|z
二甲亚砜 ⁄≥’ w1{zw x1stv w1xzs s1wwv
聚乙二醇 °∞Š w1{ys w1y{s w1|ty s1uvx
表 6 防冻剂预处理超低温保存肉桂离体胚脱氢酶活性方差分析
Ταβ .6 ς αριανχε αναλψσισ οφ δεηψδρογενασε αχτιϖιτιεσ οφ Χ . χασσια εξχισεδ
εµ βρψοσ χρψοπρεσερϖεδ ωιτη χρψοπροτεχταντσ πρετρεατµεντ
变异来源 ∂¤µ¬¤·¬²± ¶²∏µ¦¨ ≥≥ ⁄ƒ ≥ Φ ΦΑ
≤ tt1vsu x u1uys tyv1zvv Φs1stkx oul € ||1v
ƒ s1|y| u s1w{w vx1s{v Φs1sxkx oul € t|1v
א s1uxt u s1tux |1s{v Φs1stku oul € ||
甘油 Š¯ ¼¦¨µ²¯ s1svs u s1stx t1s{v Φs1sxku oul € t|
二甲亚砜 ⁄≥’ s1ytz u s1vs{ uu1vvv
聚乙二醇 °∞Š s1t{u u s1s|t y1x{v
剩余方差 ≥∏µ³¯∏¶√¤µ¬¤·¬²± s1su{ u s1stw
总和 ײ·¤¯ tv1vzz tz
在不同含水量之间 o其活性的差异达
极显著水平 oΦ€ tyv1zvv  Φs1st kx oul
€ ||1v ∀含水量在 vs h ∗ ws h的肉桂
离体胚脱氢酶活性变化比较平缓 o处
于 x1x|w ∗ x1{wv Λª#°pt o与其他含水
量水平相比 o其活性较高 ∀另外 o自然
含水量的脱氢酶活性有了明显的降
低 ∀这说明高含水量种子在超低温处
理过程中受到明显的低温伤害 ∀但是
与没有防冻剂处理的相比 o其受伤害
程度较小 o这是因为防冻剂起了保护
作用 o有效地减轻了低温伤害 ∀
冷冻方式也有显著影响 o Φ €
vx1s{v  Φs1sx ku oul € t|1s o在防冻剂
中二甲亚砜的影响最明显 oΦ€ uu1vvv
 Φs1sxku oul € t| o达显著水平 o而甘油
和蔗糖的影响不明显 ∀ux h含水量的
离体胚 o在添加 ts h ⁄≥’ n ts h Š¯ ¼
n tx h °∞Š及缓冻 p快解的处理方式
中 o其脱氢酶活性平均值最大 o为
x1x|w Λª#°pt o表明其活性最高 o最适
合超低温保存 ∀
212 电导率变化规律
前人研究发现 o细胞结构的完整性是种子活力的基础k傅家瑞 ot|{xl o当种子老化劣变时 o细胞膜受到损
伤 o膜透性增大 o电解质外渗 o水浸液电导率上升k彭幼芬等 ot||wl ∀电解质最初外渗属于被动扩散 o随后的
渗出量大小才是反映了细胞膜的损伤程度k张保恩等 ot|||l ∀不同活力的种子 o外渗量的多少可以测定电导
率或相对电导率来反映 ∀种子活力大小与电导率的高低一般呈负相关 o活力高的种子 o其膜修补能力强 o电
解质外渗量少 o积累速度慢 o活力弱的种子则反之k郑郁善 ot|{|l ∀
u1u1t 超低温保存前不同含水量的肉桂离体胚电导率变化规律 未经超低温处理的肉桂离体胚的电解质
渗漏量的大小随含水量的不同而不同 ∀一般情况下 o电导率随含水量的降低而升高 o新鲜种子的相对电导率
仅为 ty1x| h o细胞膜具有良好的完整性 o选择吸收性强 o透性较小 ~含水量在 us h ∗ ws h电导率变化比较平
缓 o其相对电导率为 vw1{v h ∗ v|1ts h o表明离体胚细胞膜受到一定程度的损伤 o经过吸胀修复 o膜功能得以
恢复 ~而低于 tx h含水量时 o已经表现出明显的脱水伤害 o细胞膜受到极大伤害 o选择吸收能力几乎丧失 o膜
透性增强 o相对电导率大幅上升k表 zl ∀
tw 第 x期 陈礼光等 }肉桂离体胚超低温保存研究
表 7 超低温保存前肉桂离体胚电导率变化
Ταβ .7 Τηε χηανγε οφ χονδυχτιϖιτψ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ βεφορε χρψοπρεσερϖατιον
项目
Œ·¨°
含水量 ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·¶
x h ts h tx h us h ux h vs h vx h ws h wx h xs h xx h ys1ut h
电导率 ≤²±§∏¦·¬√¬·¼ΠkΛ≥#¦°ptªp tl uv|1wwx uu{1twx tyw1sw ts|1ww ts|1|| ttz1ut tvt1tw tuw1vw tts1sw zw1yw zw1yw xx1sw
绝对电导率
„¥¶²¯∏·¨ ¦²±§∏¦·¬√¬·¼ΠkΛ≥#¦°ptªp tl
vuy1zz vut1z{ vts1u{ uz|1{{ u{v1t{ vt|1z{ vy|1z{ vxy1|{ vwz1v{ vy{1z{ vy{1z{ vvt1z{
相对电导率
• ¨¯¤·¬√¨ ¦²±§∏¦·¬√¬·¼Πh zv1u{ zs1|s xu1{z v|1ts v{1{w vy1yx vx1wz vw1{v vt1y{ uy1y{ us1uw ty1x|
表 8 超低温处理后肉桂离体胚各含水梯度电导率方差分析
Ταβ .8 ς αριανχε αναλψσισ οφ χονδυχτιϖιτψ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ
ωιτη διφφερεντ µ οιστυρε χοντεντ αφτερ χρψοπρεσερϖατιον
变异来源 ∂¤µ¬¤·¬²± ¶²∏µ¦¨ ≥≥ ⁄ƒ ≥ Φ ΦΑ
≤ zvt1zs v uwv1{|| vvt1{vy Φs1stkv oul € ||1u
ƒ u1xx t u1xxs v1wy| Φs1sxkv oul € t|1u
א vt1x| t vt1x|s wu1|{s Φs1stkt oul € |{1x
剩余方差 ≥∏µ³¯∏¶√¤µ¬¤·¬²± t1wz u s1zvx Φs1sxkt oul € t{1x
总和 ײ·¤¯ zyz1vt z
u1u1u 超低温保存后不同含水量的肉桂离
体胚电导率变化规律 采用 {kwt ≅ uwl正交
试验设计 o对 us h !ux h !vs h和自然含水量
的肉桂离体胚超低温保存后 o方差分析k表
{l结果表明 o含水量的影响达到极显著 oΦ€
vvt1{vy  Φs1stkv oul € ||1u ~解冻方式对离体
胚的电导率也有较大的影响 o达显著水平 oΦ
€ wu1|{s  Φs1sxkt oul € t{1x ~而冷冻方式对
离体胚电导率的影响并不明显 ∀离体胚含
水量 vs h时用快冻快解方式处理相对电导率最小为 wt1zv h o说明该条件下保存肉桂种子效果最好 ∀
u1u1v 在防冻剂预处理条件下超低温保存不同含水量的肉桂离体胚电导率变化规律 将含水量分别为
vs h !vx h !ws h !wx h !xs h和自然含水量的肉桂离体胚 o加入防冻剂 o采用 t{kyt ≅ vyl正交试验设计 o进行
超低温保存后 o结果k图 vl显示 o不同含水量的离体胚对多种防冻剂的配合浓度的要求不同 o在甘油浓度
ts h !二甲亚砜 x h !聚乙二醇 x h的混合防冻剂下 o含水量在 vx h的离体胚相对电导率最小 o说明 vx h的肉
桂离体胚在此混合防冻剂浓度下及快冻缓解处理的效果最好 ∀在冷冻解冻的处理中 o含水量为 vx h ∗ ws h
的离体胚采用缓冻快解和缓冻缓解的处理方式其电导率值较低 o说明这种处理对肉桂种子膜系统损伤较小 o
种子能保持较高的活性 ∀
图 v 肉桂离体胚超低温保存后电导率极差分析
ƒ¬ªqv ¤¬¬°∏° √¤µ¬¤·¬²± ²©¦²±§∏¦·¬√¬·¼ ²© Χq χασσια ¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶¤©·¨µ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±
Ρ }极差 ¤¬¬°∏° √¤µ¬¤·¬²±q
213 Α−淀粉酶活性分析
种子在萌发过程中 o由于本身不能通过光合作用合成碳水化合物 o只能依靠分解其子叶或胚乳所贮藏的
营养物质来满足种子萌发过程对养分的需求 ∀淀粉酶几乎存在于所有植物中 o是在种子萌发时 o其贮藏物特
别是碳水化合物代谢过程中起重要作用的一种酶 ∀Αp淀粉酶活性的高低严重影响种子萌发能力 o能够在一
定程度上反映种子活力k周丹等 ousswl ∀许多树种种子在萌发初期需大量的淀粉转化为葡萄糖 o作为种子萌
uw 林 业 科 学 wt卷
发生长的营养物质来源 ∀
u1v1t 超低温处理前肉桂离体胚 Αp淀粉酶活性变化 肉桂种子成熟后 o由于含水量大 oΑp淀粉酶仍处于
活性状态 o代谢旺盛 ∀如果遇到适宜的环境条件 o种子就会从成熟过程直接转向萌发过程 ~若条件不适宜 o种
子很容易进入衰老劣变过程 ∀肉桂离体胚 Αp淀粉酶活性随含水量的下降而降低 o新鲜的离体胚其 Αp淀粉
酶活性高 o水解的淀粉数为 s1v{s °ª#°¬±pt o而含水量降到 tx h以下时 oΑp淀粉酶活性降幅显著增大 o这主
要是由于含水量越低 o脱水时间越长 o对细胞的脱水伤害越大 o从而表现在水解淀粉的毫克数就越小 ∀
u1v1u 超低温处理后肉桂离体胚 Αp淀粉酶活性变化 对含水量 us h !vs h !ws h和自然含水量的肉桂离体
表 9 超低温处理后肉桂离体胚(30 个胚)的 Α−淀粉酶活性
Ταβ .9 Α− αµψλασε αχτιϖιτψ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ (30 εµ βρψοσ)
αφτερ χρψοπρεσερϖατιον °ª#°¬±pt
处理因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
·µ¨¤·° ±¨·¶
不同处理水平 Αp淀粉酶活性
Α2¤°¼¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶¤·§¬©©¨µ¨±··µ¨¤·° ±¨·¯ √¨¨ ¶¯
t u v w
极差
¤¬q√¤µ¬¤·¬²±
≤ s1tuz s1tzs s1twy s1s|s s1s{s
ƒ s1tvu s1tvx s1ssv
א s1tws s1tuz s1stv
胚 o采用 {kwt ≅ uwl正交试验设计方案进行
超低温保存 o结果如表 |所示 ∀由于经过超低
温处理 o高含水量的离体胚受到低温伤害较
严重 o其活性大大降低 o自然含水量的离体
胚其 Αp淀粉酶活性为 s1s|s °ª#°¬±pt oΑp
淀粉酶活性最大的出现在含水量为 vs h缓
冻快解处理中 o为 s1tzs °ª#°¬±pt ∀冷冻方
式对 Αp淀粉酶活性影响不大 o而解冻方式
对 Αp淀粉酶活性影响较大 o表现在同一含水量上 o快解方式处理的 Αp淀粉酶活性明显高于慢解方式处理
的 o因此在保存肉桂种子时 o用快冻 p快解方式进行液态氮处理 o能够更好地维护种子细胞膜的完整性 o有效
地维持种子的活性 ∀
表 10 防冻剂预处理超低温处理后肉桂离体胚(30个胚)Α−淀粉酶活性
Ταβ .10 Α− αµψλασε αχτιϖιτψ οφ Χ . χασσια εξχισεδ εµ βρψοσ (30 εµ βρψοσ)
χρψοπρεσερϖεδ ωιτη χρψοπροτεχταντσ πρετρεατµεντ °ª#°¬±pt
处理因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
·µ¨¤·° ±¨·¶
不同处理水平 Αp淀粉酶活性
Α2¤°¼¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶¤·§¬©©¨µ¨±··µ¨¤·°¨ ±·¯ √¨¨ ¶¯
t u v w x y
极差
¤¬q√¤µ¬¤·¬²±
≤ s1ttv s1tzy s1uss s1txs s1tv{ s1tt{ s1s{z
ƒ s1tww s1txw s1tw| s1stt
א s1txx s1txs s1twu s1stv
二甲亚砜 ⁄≥’ s1twx s1txs s1txu s1ssz
聚乙二醇 °∞Š s1twx s1txu s1txt s1ssz
甘油 Š¯ ¼¦¨µ²¯ s1txx s1txs s1twu s1stw
u1v1v 在防冻剂预处理条件下超低
温保存后肉桂离体胚 Αp淀粉酶活性
变化 用含水量为 vs h !vx h !ws h !
wx h !xs h 和自然含水量的肉桂离体
胚进行 t{kyt ≅ vyl正交试验设计 o进
行超低温保存后结果见表 ts ∀由于防
冻剂的添加使得冷冻解冻方式对离体
胚活性影响变小 o极差仅为 s1stt 和
s1stv °ª#°¬±pt ~而防冻剂中甘油的影
响最大 o极差为 s1stw °ª#°¬±pt o聚乙
二醇和二甲亚砜的影响较小 o极差均
为 s1ssz °ª#°¬±pt ∀在一般情况下 o采用缓冻快解方式对肉桂离体胚的保存效果较好 ∀
v 结论与讨论
种子活力强弱和衰老状况不仅反映在细胞内各种酶活性强弱 o而且也反映在细胞膜的完整性 ∀细胞膜
不仅是分隔细胞质和胞外环境的屏障 o而且也是细胞与环境之间物质交换的主要通道 o是细胞受环境胁迫最
敏感的部位 ∀宋松泉等kt||| ~usswl经研究发现 o顽拗性种子脱水伤害的位点 o主要是膜系统k如质膜 !线粒
体膜 !液泡膜l ∀因此 o肉桂种子超低温保存的技术关键 o主要是通过最大限度地保护其各种酶活性和细胞膜
的完整性 o使种子具备更高的活力和发芽力 ∀
肉桂种子含水量是影响超低温保存成功的最主要因素 o当含水量降低到 vs h ∗ ws h时 o有较好的抗冻
能力 o主要表现在含水量降低 o脱水伤害较小和细胞保护物质的积累 o因而在超低温保存后各项生理生化指
标均能达到较好的水平 ∀含水量为 us h的肉桂离体胚脱氢酶活性为 w1w{y Λª#°pt o相对电导率为 wt1zv h o
Αp淀粉酶活性为 s1tzs °ª#°¬±pt o与超低温保存前相对应的离体胚的脱氢酶活性相近 ∀当含水量下降到
tx h以下时 o超低温保存会造成脱水伤害 o细胞膜会因过度脱水而受到损伤 ∀
在超低温保存过程中 o防冻剂的使用 o有降低肉桂种子冰点的作用 o从而使种子免受或降低低温伤害 o维
持种子各种酶的活性 ∀很多研究表明 o一般防冻剂在常温条件下毒性较强 o尤其是二甲亚砜 o但在 s ε 左右 o
vw 第 x期 陈礼光等 }肉桂离体胚超低温保存研究
其对种子或离体胚的毒害作用就会被削弱 o很少有叠加性 o且在低温下使用适宜浓度的防冻剂组合对保存材
料几乎没有任何毒性影响k徐刚标 ousssl ∀使用混合防冻剂的保护作用会比单独使用效果更佳 o混合防冻剂
的保护作用的大小 o主要取决于各种防冻剂的混合比例 o在试验过程中寻找最佳防冻剂的混合比例是超低温
保存种子的关键 ∀在本次研究中采用 ts h二甲亚砜 n ts h甘油 n tx h聚乙二醇混合防冻剂处理 o肉桂离体
胚脱氢酶活性最高 ~用 ts h甘油 n x h二甲亚砜 n x h聚乙二醇混合防冻剂处理 o肉桂离体胚的相对电导率
最小 ~用 tx h二甲亚砜 n ts h聚乙二醇 n x h甘油混合防冻剂处理 o肉桂离体胚的 Αp淀粉酶活性最高 ∀因
此混合防冻剂的使用有效地保护了种子细胞的膜系统的完整 o提高了种子的活性 ∀
此外 o防冻剂能够更好地超低温保存肉桂离体胚 o其最适宜保存含水量为 vs h ∗ ws h ∀在冷冻解冻方
式中 o没使用防冻剂处理的条件下 o以快冻快解的处理方式离体胚各项生理生化指标较好 ~加入防冻剂后 o以
缓冻快解效果最好 o且各项生理生化指标均优于没有防冻剂预处理 ∀因此 o寻求各种防冻剂的最佳混合比
例 o将是今后超低温保存种子的研究方向和必然趋势 ∀
综上所述 o肉桂离体胚的超低温保存 o需将含水量降低到一定水平 ovs h ∗ ws h之间 o并在 s ε 冰浴条件
下添加防冻剂 o来协调脱水 o避免形成冰晶 o保护细胞膜不受损伤 o才能使超低温保存达到良好的效果 ∀
参 考 文 献
陈建勋 o谢治芳 qt||| q板栗贮藏过程中的生理生化变化初探 q华南农业大学学报 ouskwl }zs p zw
陈礼光 o郑郁善 o邱尔发 o等 qusst q米槠和苦槠超低温保存材料细胞膜代谢特征研究 q林业科学 ovzk¶³qtl }tvz p twu
傅家瑞 qt|{x q种子生理 q北京 }科学出版社 ov|z p v|{
傅家瑞 qt||t q顽拗性种子 q植物生理学通讯 ouzkyl }wsu p wsy
国际种子检验协会kŒ≥ׄl编 q浙江大学种子科学中心译 qt||| qt||y国际种子检验规程 q北京 }中国农业出版社 otx p t{
洪 伟 qt||t q林业试验设计技术与方法 q北京 }科学技术出版社
黄学林 o陈润政 qt||s q种子生理实验手册 q北京 }农业出版社 otux p tuz
陆旺金 o金剑平 o向 旭 o等 qt||{ q黄皮种子的保湿贮藏及胚轴的超低温保存 q华南农业大学学报 ot|ktl }z p tt
彭幼芬 o王文章 qt||w q种子生理学 q湖南 }中南工业大学出版社 otx{ p t{v
宋松泉 o …¨ µ­¤® ° o°¤°° ±¨·¨µ‘qussw q Τριχηιλια δρεγεανα胚轴的脱水敏感性与抗坏血酸的抗氧化作用 q植物学报 owykzl }{sv p {ts
宋松泉 o陈 玲 o傅家瑞 qt||| q种子脱水耐性与 ∞„蛋白 q植物生理学通讯 ovxkxl }wuw p wvu
吴永杰 o赵艳华 o周明德 qt||| q苹果休眠茎尖的超低温保存研究 q华北农学报 otwktl }tu| p tvv
徐刚标 o陈良昌 qt||{ q植物种质超低温保存 q经济林研究 otykul }xt p xv
徐刚标 qusss q植物种质资源离体保存研究进展 q中南林学院学报 ouskwl }{t p {s
殷晓辉 o舒理慧 qt||y q植物种质资源的保存研究进展 q热带亚热带植物学报 owkvl }zx p {u
张保恩 o黄学林 qt||| q种子吸胀期间的泄漏物与活力的关系 q植物生理学通讯 ovxkvl }uvt p uvx
郑光华 qt|{x q国外应用种子活力测定的概况 q种子 okyl }u{ p vs
郑郁善 o陈礼光 o李庆荣 o等 qussu q板栗种子超低温保存研究 q林业科学 ov{kul }twy p tw|
郑郁善 o陈礼光 o邱尔发 qusst q超低温保存锥栗种子的生理生化特性研究 q林业科学 ovzkyl }v| p ww
郑郁善 qt|{| q电导法测定林木种子活力的研究 q福建林学院学报 o|kul }t|| p usu
周 丹 o孙传清 o屠乃美 qussw q谷类种子休眠性的研究进展 q湖南农业大学学报k自然科学版l ovskyl }x{{ p x|u
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°¨ ±¦¨ ∂ ≤ qt||u q ⁄¨ ¶¬¦¦¤·¬²± ¤±§¤±§·«¨ ¶∏µ√¬√¤¯ ²© Αεσχυλυσo Χαστανεα ¤±§ Θυερχυσ °¨¥µ¼²¤¬¨¶·«µ²∏ª«¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±q≤µ¼²¥¬²¯²ª¼ou| }v|t p v||
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•∏«¯ Š o⁄¤°¥µ²·«  o…¬¨«¯ …qt|{{ qŒ±√¨ ¶·¬ª¤·¬²±¶²±·«¨ ¦¤∏¶¨¶²©¶¨±¶¬·¬√¬·¼·²¦²¯§¤±§§µ¼¬±ª²©·µ²³¬¦¤¯ ¶¨ §¨¶º¬·«¦²¦²¤¤¶¤± ¬¨¤°³¯¨ µ q ⁄¨ «¼§µ¤·¬²±
³¤µ¤°¨ ·¨µ¶¤±§ ¬¨∏§¤·¬²± ²©§µ¼¬±ª¦²¦²¤¶¨ §¨¶¤±§¶¨ §¨²µª¤±¶q≥¨ §¨≥¦¬¤±§× ¦¨«±²ov{kvl }uvx p uxt
׫µ²±¨ ¥¨µµ¼ Š ’ o≥°¬·«ƒ Š qt|xx q • ¨¯¤·¬²± ²©µ¨¶³¬µ¤·¬²± ¤±§ ±¨½¼°¤·¬¦¤¦·¬√¬·¼·²¦²µ± ¶¨ §¨√¬¤¥¬¯¬·¼q°¯ °«¼¶¬²¯ ovs }vvz p vwv
ww 林 业 科 学 wt卷