全 文 ：第 ws卷 第 w期
u s s w年 z 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1ws o‘²1w
∏¯ qou s s w
柑桔酸性转化酶基因家族成员的克隆及特性分析 3
安新民 张上隆 徐昌杰
k浙江大学 杭州 vtssu|l
陶 俊
k扬州大学 扬州 uuxstwl
摘 要 } 分析植物液泡和细胞壁酸性转化酶基因的保守区序列 o设计 u对 °≤• 引物 o以温州蜜柑基因组 ⁄‘„为
模板 o采用 °≤• 方法扩增出长分别为 zwt¥³k„l和 xuw¥³k…l的 u个 ⁄‘„片段 o克隆入 ³˜≤°2×载体测序 o序列已在
Š¨ ±…¤±®中登记k登记号分别为 „≠su|w{t和 „ƒvvu{{tl ∀在 Š¨ ±…¤±®中进行同源性检索 o结果表明片段 „编码的氨
基酸与植物液泡酸性转化酶同源性较高 o与胡萝卜 !马铃薯和番茄同源性分别为 z| h !z| h 和 z{ h ∀片段 …编码
的氨基酸序列与草莓 !拟南芥和豌豆细胞壁转化酶同源性分别为 z{ h !z{ h和 zz h ∀推测 „和 …分别定位于液泡
和细胞壁 ∀运用 ≤¯ ∏¶·¤¯¬和 …¬²¨ §¬·软件包对已获得的柑桔转化酶基因家族的 z个基因序列进行分析 o结果表明 z
个基因分属转化酶基因家族的 w种类型 ∀推测 „ 和 …为 u个新成员 o分别属于柑桔液泡酸性转化酶基因 µ型
k ΧΥΑΙ2l和细胞壁酸性转化酶基因 µ型k ΧΥΧΩΙl ∀≥²∏·«¨µ±杂交结果表明 o ΧΥΧΩΙ和 ΧΣΧΩΙ u个探针有时会出现较
弱的杂交干扰信号 o可采用 ΧΣΧΩΙ与 ΧΥΧΩΙ 同源性较低的另一段序列制作探针进行杂交 o也可通过缩短杂交时
间 !提高杂交和洗膜的温度以及降低洗膜 ≥≥≤ 的浓度等措施来降低 ~其它成员之间无干扰信号产生 ∀
关键词 } 柑桔 o酸性转化酶 o基因家族 o克隆 o特性
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlsw p ssx{ p sx
收稿日期 }ussu p ts p vt ∀
基金项目 }国家自然科学基金kv|zvsvws ovstzsyw{l资助 ∀
3 张上隆为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Χηαραχτεριζατιον οφ Μεµ βερσ οφ Αχιδ Ινϖερτασε Γενε Φαµιλψιν Χιτρυσ
„± ÷¬±°¬± «¤±ª≥«¤±ª¯²±ª ÷∏≤«¤±ª­¬¨
k Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Ηανγζηουvtssu|l
פ²∏±
kΨανγζηου Υνιϖερσιτψ Ψανγζηουuuxstwl
Αβστραχτ } ׺²³¤¬µ¶²©³µ¬°¨ µ¶o§¨¶¬ª±¨ §©µ²°¦²±¶¨µ√¨ §µ¨ª¬²±¶²©³¯¤±·√¤¦∏²¯¤µ¤±§¦¨¯¯ º¤¯¯¥²∏±§¤¦¬§¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ ¶µ¨2
¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ oº¨ µ¨ ∏¶¨§·²¤°³¯¬©¼zwt¥³k„l ¤±§xuw ¥³k…l©µ¤ª°¨ ±·¶©µ²° Χιτρυσυνσηιυ ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ¥¼³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ¦«¤¬±µ¨2
¤¦·¬²± k°≤• l q׫¨ ©µ¤ª°¨ ±·¶º¨ µ¨ ¦¯²±¨ §¬±·²³˜≤°2× o¤±§·«¨ ± ¶¨ ∏´¨±¦¨§q׫¨ §¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©©µ¤ª°¨ ±·„
¬¶z| h oz| h oz{ h ¬§¨±·¬¦¤¯ ·²ª¨ ±¨ ¶©µ²° ∆αυχυσχαροτα k÷zxvxvl o Σολανυµ τυβεροσυµ k÷zsvy{l ¤±§ Λψχοπερσιχον εσχυ2
λεντυµ ktusuxlµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¤±§º¤¶¶∏ªª¨¶·¨§·² ±¨¦²§¨ ¤¶²¯∏¥¯¨¤¦¬§¬±√¨ µ·¤¶¨ ²¯¦¤·¨§¬± √¤¦∏²¯¨oº«¬¯¨ …¬¶z{ h oz{ h o
zz h ¬§¨±·¬¦¤¯ ·²ª¨ ±¨ ¶©µ²° Φραγαρια ανανασσα k„ƒsssxutl o Αραβιδοπσιστηαλιανα k„°sstvszl ¤±§ Πισυµ σατιϖυµ k÷{xvuzl
µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯o¤±§º¤¶¶∏ªª¨¶·¨§·² ±¨¦²§¨ ¤¬±¶²¯∏¥¯¨¤¦¬§¬±√¨ µ·¤¶¨ ¬± ¦¨¯¯ º¤¯¯q²º¨ µ«²°²¯²ª¼ ¤°²±ª „ o ΧΥΑΙ1 o … ¤±§
ΧΣΧΩΙ ¶∏ªª¨¶·¨§·«¤·„ ¤±§… º¨ µ¨ ·º² ±¨ º °¨ °¥¨µ¶²©¤¦¬§¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ ©¤°¬¯¼¬± Χιτρυσoµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ ¥¨ ²¯±ª·² ³∏·¤·¬√¨
ΧΥΑΙ2 ¤±§ ΧΥΧΩΙ q׫¨µ¨ º¤¶±²¬±·¨µ¤¦·¬²±¤°²±ª·«¨¶¨ °¨ °¥¨µ¶k ΧΥΑΙ1 , ΧΥΑΙ2 , ΧΥΧΩΙ ²µΧΣΧΩΙl ¬¨¦¨³·©²µΧΥΧΩΙ
¤±§ ΧΣΧΩΙ¬± ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶q׫¨ ¬±·¨µ¤¦·¬²± ¥¨·º¨ ±¨ ΧΥΧΩΙ ¤±§ ΧΣΧΩΙ ¦²∏¯§¥¨ ¨¯¬°¬±¤·¨§¥¼ ∏¶¬±ª ΧΣΧΩΙ. ¶³¤µ2
·¬¤¯ ¶¨ ∏´¨±¦¨ º«¬¦«º¤¶ ²¯º¨ µ«²°²¯²ª²∏¶·² ΧΥΧΩΙ ¤¶³µ²¥¨ o¤±§º¨ ¤®¨ ±¨ §¥¼ ¶«²µ·¨±¬±ª«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±·¬°¨ o¬±¦µ¨¤¶¬±ª«¼2
¥µ¬§¬½¤·¬²± ¤±§º¤¶«¬±ª·¨°³¨µ¤·∏µ¨ oº¤¶«¬±ª °¨ °¥µ¤±¨ ¬± ²¯º¨ µ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©≥≥≤ q
Κεψ ωορδσ} Χιτρυσo„¦¬§¬±√¨ µ·¤¶¨ o Š¨ ±¨ ©¤°¬¯¼o≤¯ ²±¬±ªo≤«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²±
蔗糖是植物光合产物运转和贮藏的主要形式 ∀许多研究证实 o转化酶k蔗糖酶l催化蔗糖水解生成葡萄
糖与果糖 o在蔗糖代谢中起着重要作用 ∀转化酶分为酸性 !中性或碱性 ∀酸性转化酶存在于细胞壁k不溶性l
和液泡k可溶性l中 o中性或碱性转化酶存在于细胞质中 ∀转化酶的活性高低直接决定了组织库强度kŽ¯¤±±
ετ αλqot||ul o从而影响光合产物的运转 o进而影响作物生长发育 ∀有关番茄kΛψχοπερσιχον εσχυλεντυµl和胡萝
卜k ∆αυχυσχαροταl等作物转化酶基因转化植株的研究表明 o转化酶活性的改变影响植株光合能力 !光合产物
的运转分配乃至植株生长 !果实大小 !品质 !产量和育性k’«¼¤°¤ ετ αλqot||x ~t||| ~ Ž¯¤±± ετ αλqot||y ~
≥¦«²¯ ¶¨ ετ αλqot||y ~פ±ª ετ αλqot|||l ∀
转化酶基因的研究也取得较大进展 ∀目前已在甜菜k Βετα ϖυλγαρισl !马铃薯k Σολανυµ τυβεροσυµl !拟南芥
kΑραβιδοπσιστηαλιαναl !烟草k Νιχοτιαναταβαχυµl !玉米k Ζεα µαψσl !胡萝卜 !番茄以及绿豆kςιγνα ραβιαταl等植物
上分离了该基因 o但就果树而言 o只有葡萄kςιτισϖινιφεραlk⁄¤√¬¨¶ετ αλqot||yl !草莓k Φραγαρια ανανασσαlkŠ¨ ±2
…¤±®登记号 „ƒsssxutl ∀安新民等kusstl分离了柑桔k Χιτρυσl转化酶基因家族的 u个成员并在 Š¨ ±…¤±®中登
记k„ƒstw|ux和 „ƒvtwt|zl ∀本文报道了获得该基因家族的另外 u个新成员 ΧΥΑΙu和 ΧΥΧΩΙk登记号分别为
„≠su|w{t和 „ƒvvu{{tl的过程 o并对所获得的 w个成员的序列特性进行分析 ∀这对于进一步研究它们的时
空表达特性 o探讨柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解机理具有重要意义 ∀
t 材料与方法
111 材料
t1t1t 植物材料 以温州蜜柑k Χιτρυσ υνσηιυl幼叶为提取基因组 ⁄‘„的材料 ∀
t1t1u 引物 根据 Š¨ ±…¤±®登记液泡转化酶基因k„ƒwyxytv Λψχοπερσιχον εσχυλεντυµ o „ƒst|ttv Ορψζα σατιϖαo
„≠svz|v{ Ιποµοεα βατατασo ÷zsvy{ Σολανυµ τυβεροσυµ o ˜{z{w| Χαπσιχυµ αννυυµ o ÷zxvxv !÷zxvxu !÷zxvxt !
÷t{zsz ∆αυχυσχαροτα o„uzzwxx Βετα ϖυλγαρισl和细胞壁转化酶基因k„ƒsssuxt Φραγαρια ανανασσα o ÷{xvuz !
„ƒsyvuwy Πισυµ σατιϖυµ o vxtyv ςιχια φαβα o „ƒs|txw| Ηαµαµελισ ϖιργινιανα o „ƒwvwzuz Φορτυνελλα χρασσιφολιαo
„°sstvsz !÷zwxtw !÷zwxtx !„≠swxzzy Αραβιδοπσιστηαλιαναl序列的保守区分别设计下列 u对引物 }
ƒ° „ }xχ ŠŠ„׊Š×„≤≤„×≤׊××≤ׄ×≤ vχ ~ • ° „ }xχ ׊„≤××≤Š„׊≤„ׄŠ×„×≤×≤ vχ ~
ƒ° …}xχ ׄ≤≤„×≤ׄ××≤ׄ≤≤„Š×„≤„„ vχ ~ • ° …}xχ „„„„„„×≤„ŠŠ„≤„≤×≤≤≤„≤„× vχ ∀
t1t1v ≥²∏·«¨µ±杂交试剂盒 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k购自 •²¦«¨ 公司l ∀
112 方法
t1u1t 基因组 ⁄‘„提取 参照陈大明等kt||zl的方法 ∀
t1u1u °≤• 反应 在 ‹≠…„Œ⁄ °≤• ∞÷°• ∞≥≥中进行 ∀反应 „ }xs ˏ°≤• 反应体系包括 xs ±ª温州蜜柑基因
组 ⁄‘„ o各 s1u Λ°²¯#pt上游引物 „ 和下游引物 „ ot ≅ °≤• 反应缓冲液 ou °°²¯ #pt ª≤¯ u ouss Λ°²¯ #pt
§‘×°¶和 u单位 פ´ ⁄‘„聚合酶k购自上海生工l ∀°≤• 循环条件为 |w ε 预变性 v °¬±o最后 zu ε 延伸 ts °¬±o
|w ε 变性 wx ¶ow{ ε 退火 |s ¶ozu ε 延伸 |s ¶o共进行 vx轮循环 ∀反应 …}xs ˏ°≤• 反应体系包括 xs ±ª温州
蜜柑基因组 ⁄‘„ os1u Λ°²¯#pt上游引物 …和下游引物 …ot ≅ °≤• 反应缓冲液 ou °°²¯#pt ª≤¯ u ouss Λ°²¯#
pt §‘×°¶和 u单位 פ´ ⁄‘„聚合酶k购自上海生工l ∀°≤• 循环条件为 |w ε 预变性 x °¬±o最后 zu ε 延伸 ts
°¬±o|w ε 变性 ws ¶oxs ε 退火 ws ¶ozu ε 延伸 t °¬±o共进行 vx轮循环 ∀
t1u1v ⁄‘„片段重组入质粒载体 °≤• 产物 „和产物 …经纯化后分别与 ³˜≤°2×k购自上海生工l载体连
接 o连接产物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o通过蓝白斑筛选 !质粒长度和酶切k采用 Πστ ´进行酶切l
鉴定获得重组质粒k≥¤°¥µ²²® ετ αλqot|{|l ∀
t1u1w ⁄‘„序列测定 由上海基因有限公司晶泰测序部测定 ∀
t1u1x 序列分析 采用 ≥¨ ¤´¬§ µ !≤¯ ∏¶·¤¯¬和 …¬²¨ §¬·等软件进行分析 ∀
t1u1y ≥²∏·«¨µ± …¯²·¶分析 按照 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k•²¦«¨ l 说明书进行 ∀
u 结果与分析
211 °≤• 产物的扩增和克隆
以温州蜜柑基因组 ⁄‘„为模板 o用所设计的 u对引物进行 °≤• 反应 o得到长度分别大约为 zws ¥³和
xvs ¥³的 u条带 o将 °≤• 产物 „和 …经纯化后分别与 ³˜≤°2×载体连接 o连接产物分别转化大肠杆菌 ׊t菌
株感受态细胞 o在含氨苄青霉素 !÷2ª¤¯ 及 Œ°×Š的 …平板上涂布获得白色菌落 o挑取这些菌落培养 !提取质
粒 o经长度和酶切k Πστ´l鉴定获得重组质粒 „和 …∀
212 基因序列与同源性分析
测定重组质粒 „和 …的序列 o表明 u个基因片段长分别为 zwt ¥³和 xuw ¥³o在 Š¨ ±…¤±®中进行 …¯¤¶·结
果表明 ou片段分别属于温州蜜柑液泡酸性转化酶基因 !细胞壁酸性转化酶基因 ∀基因片段 „长 zwt ¥³o属
|x 第 w期 安新民等 }柑桔酸性转化酶基因家族成员的克隆及特性分析
图 t 温州蜜柑液泡酸性转化酶基因部分序列k划线部分为引物序列l
ƒ¬ªqt °¤µ·¬¤¯ ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¤±§§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Χq υνσηιυ √¤¦∏²¯¤µ
¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ k ΧΥΑΙ2l k≥¨´ ∏¨ ±¦¨¶«²°²¯²ª²∏¶·²·«¨ ²¯¬ª²±∏¦¯ ²¨·¬§¨
³µ¬°¨ µ¶∏¶¨§©²µ°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ¤µ¨ ∏±§¨µ¯¬±¨ §l
于温州蜜柑液泡酸性转化酶基因开放阅读
框的一部分 o不含内含子 ∀其序列如图 t ∀
在 Š¨ ±…¤±®中进行同源性检索 o结果表明 o
该基因片段序列与番茄k„ƒwyxytvl !水稻
k Ορψζα σατιϖαo „ƒst|ttvl !马铃薯k÷zsvy{l
液泡转化酶基因的同源性分别为 {s h !
{v h和 {t h ∀该基因编码的氨基酸序列与
胡萝卜k÷zxvxvl !马铃薯k÷zsvy{l和番茄
ktusuxl液泡酸性转化酶基因编码的氨基
酸同源性分别为 z| h !z| h 和 z{ h ∀推测
该基因定位于液泡 ∀基因片段 …长 xuw ¥³o
属温州蜜柑细胞壁酸性转化酶基因开放阅
读框的一部分 o不含内含子 ∀其序列如图
u ∀在 Š¨ ±…¤±®中进行同源性检索 o结果表
明 o该基因片段序列与甜橙k Χιτρυσσινενσισo
„ƒvtwt|zl !Λοτυσϕαπονιχυσ k„°sswxutl 和金
缕梅k Ηαµαµελισ ϖιργινιανα o„ƒs|txxsl 细胞
壁转化酶基因的同源性分别为 {s h !{s h
和 {s h o 该基因氨基酸序列与草莓
k„ƒsssxutl !拟南芥k„°sstvszl和豌豆k Πι2
συµ σατιϖυµ o„ƒsyvuwyl细胞壁转化酶基因编
码的同源性分别为 z{ h !z{ h 和 zz h ∀推
图 u 温州蜜柑细胞壁酸性转化酶基因部分序列k划线部分为引物序列l
ƒ¬ªqu °¤µ·¬¤¯ ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¤±§§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© Χq υνσηιυ ¦¨¯¯ º¤¯¯¤¦¬§
¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ k ΧΥΧΩΙl k≥¨´ ∏¨±¦¨¶«²°²¯²ª²∏¶·²·«¨ ²¯¬ª²±∏¦¯ ²¨·¬§¨
³µ¬°¨ µ¶∏¶¨§©²µ°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ¤µ¨ ∏±§¨µ¯¬±¨ §l
测该基因定位于细胞壁 ∀
运用 ≤¯ ∏¶·¤¯¬和 …¬²¨ §¬·软件包将获得
的 z 个柑桔酸性转化酶基因k„ƒstw|ux o
„ƒwvwzu{ o„≠su|w{t o„ƒwvvywv o„ƒvvu{{t o
„ƒvtwt|z o„ƒwvwzuzl推导的氨基酸序列进
行聚类和同源性分析 o结果表明 z个基因序
列分 属 w 种 酸 性 转 化 酶 基 因 类 型 o
„ƒstw|uxk温州蜜柑l和 „ƒwvwzu{k代代酸
橙 Χq αυραντιυµl属液泡 ´型 o„≠su|w{tk温
州蜜柑l和 „ƒwvvywvk甜橙l属液泡 µ型 o
„ƒvvu{{t k温州蜜柑l属细胞壁 ´ 型 o
„ƒvtwt|zk甜橙l和 „ƒwvwzuzk金柑 Φορτυνελ2
λα χρασσιφολιαl属细胞壁 µ型k图 vl ∀同源性
分析结果表明基因片段 „和 …不同于已经
获得的柑桔转化酶基因家族的 u 个成员
kΧΥΑΙ1和 ΧΣΧΩΙlk安新民等 ousstl ∀ „ 与
ΧΥΑΙ1 和 ΧΣΧΩΙ 核酸序列同源性分别为
yz1ut h和 x{1x| h o氨基酸序列同源性分别为 zs1vv h和 xu1vs h k表 tl ∀推测该基因属于柑桔液泡酸性转
化酶基因 µ型k ΧΥΑΙ2) ∀ …与 ΧΥΑΙ1和 ΧΣΧΩΙ核酸序列同源性分别为 xy1vs h和 {s1|u h o氨基酸序列同源
性分别为 xt1tx h和 zw1zt h k表 tl o推测该基因属于柑桔细胞壁酸性转化酶基因 µ型k ΧΥΧΩΙl ∀以上结果
表明已经获得了柑桔转化酶基因家族成员的 w种类型 ∀
213 Σουτηερν杂交分析
sy 林 业 科 学 ws卷
图 v z个柑桔酸性转化酶氨基酸
序列的系统聚类树状图
ƒ¬ªqv °«¼¯²ª¨ ±¬¦¤±¤¯¼¶¬¶²©¶¨√¨ ± ¤¦¬§
¬±√ µ¨·¤¶¨ ª¨ ±¨ ¶²© Χιτρυ󤦦²µ§¬±ª
·²³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
u1v1t 探针标记效率的检测 将经过 ⁄ŒŠ标记 us «的对照 ⁄‘„和 w个成
员的探针分别按 tΒtsu otΒvvs otΒtsv otΒtsw otΒtsx otΒtsy 进行梯度稀释 o
按浓度梯度各取 t ˏ依次点样于尼龙膜上进行 ⁄ŒŠ标记效率检测 ∀检测
结果表明 o ΧΥΑΙ1 ! ΧΥΑΙ2 ! ΧΥΧΩΙ和 ΧΣΧΩΙ均获得了较理想的标记效率 o
与对照 ⁄‘„的标记效率为同一数量级 o达 vs ±ª#ˏptk图 wl o用于 ≥²∏·«¨µ±
杂交分析时可获得理想的印迹效果 ∀
u1v1u ≥²∏·«¨µ±杂交分析 分别按照 ΧΥΑΙ1 !ΧΥΑΙ2 !ΧΥΧΩΙ 和 ΧΣΧΩΙ w个
成员的顺序各取 s1x Λª相应的重组质粒 ⁄‘„依次点样于每条尼龙膜上 o用
混有 ⁄ŒŠ标记的 ΧΥΑΙ1 !ΧΥΑΙ2 !ΧΥΧΩΙ和 ΧΣΧΩΙ w个成员 ⁄‘„探针的杂交
液分别杂交 w条尼龙膜 ∀结果表明 oΧΥΑΙ1 和 ΧΥΑΙ2 两个探针分别只与相
应的重组质粒 ⁄‘„出现杂交印迹 o而 ΧΥΧΩΙ 和 ΧΣΧΩΙ 两个探针则除各自
与相应的重组质粒 ⁄‘„出现杂交主信号外 o同时由于二者 {s1|u h的核苷
酸同源性出现杂交次信号k图 xl ∀说明 v个探针间k ΧΥΑΙ1 !ΧΥΑΙ2 以及
ΧΥΧΩΙ和 ΧΣΧΩΙ二者之一l不会出现杂交干扰现象 o而 ΧΥΧΩΙ 和 ΧΣΧΩ两
个探针杂交有时会出现次信号 o可通过改用 ΧΣΧΩΙ序列的上游或下游部分
制作探针来消除干扰信号 ∀经过试验后表明 o适当地提高杂交温度和洗膜
的严紧度也可降低甚至消除 ΧΥΧΩΙ和 ΧΣΧΩΙ的杂交干扰 ∀
表 1 柑桔转化酶基因家族 4 个成员核酸(ΝΑ)序列和相应的氨基酸(ΑΑ)序列的同源性
Ταβ . 1 Ηοµολογουσ περχενταγε οφ νυχλεοτιδε αχιδ(ΝΑ) σεθυενχεσ ανδ χορρεσπονδινγ αµινο αχιδ(ΑΑ) σεθυενχεσ
βετωεεν 4 µεµ βερσ οφ αχιδ ινϖερτασε γενε φαµιλψ οφ Χιτρυσ h
Š¨ ±…¤±® ‘²q
液泡 ∂¤¦∏²¯¤µ 细胞壁 ≤¨¯¯ º¤¯¯
温州蜜柑液泡转化酶
基因 ´型 ΧΥΑΙ1
„ƒstw|ux
温州蜜柑液泡转化酶
基因 µ型 ΧΥΑΙ2
„≠su|w{t
温州蜜柑细胞壁转化酶
基因 ´型 ΧΥΧΩΙ
„ƒvvu{{t
甜橙细胞壁转化酶
基因 ´型 ΧΣΧΩΙ
„ƒvtwt|z
‘„ „„ ‘„ „„ ‘„ „„ ‘„ „„
ΧΥΑΙ1 tss tss
ΧΥΑΙ2 yz1ut zs1vv tss tss
ΧΥΧΩΙ xy1vs xt1tx x|1|u xy1vu tss tss
ΧΣΧΩΙ xw1zz xt1zu x{1x| xu1vs {s1|u zw1zt tss tss
图 w 柑桔转化酶基因家族 w个成员
探针 ⁄ŒŠ标记效率的检测
ƒ¬ªqw ⁄¨ ·¨µ°¬±¤·¬²± ²© ⁄ŒŠ2¯ ¤¥¨ ¬¯±ª ©¨©¬¦¬¨±¦¼ ²©w ³µ²¥¨¶©²µw
°¨ °¥¨µ¶²©¤¦¬§¬±√ µ¨·¤¶¨ ª¨ ±¨ ©¤°¬¯¼ ²© Χιτρυσ
图 x 柑桔转化酶基因家族 w个成员的
⁄ŒŠ ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¶分析
ƒ¬ªqx ⁄ŒŠ ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¶²©w ° °¨¥¨µ¶²©¤¦¬§
¬±√¨ µ·¤¶¨ ª¨ ±¨ ©¤°¬¯¼ ²© Χιτρυσ
v 结论与讨论
转化酶水解蔗糖为葡萄糖和果糖 o与蔗糖代谢密切相关 ∀转化酶活性的高低直接影响组织库强 o进而影
响植株的生长发育乃至产量品质的形成 ∀根据转化酶催化的最适 ³‹可将其分为酸性转化酶和碱性转化酶
k包括近中性的转化酶l o酸性转化酶一般定位于细胞壁k不溶性的l及液泡k可溶性的l o而碱性转化酶则定
ty 第 w期 安新民等 }柑桔酸性转化酶基因家族成员的克隆及特性分析
位于细胞质k≥·∏µ° ετ αλqot||sl ∀转化酶基因是一个多成员的基因家族 o不同定位的转化酶同工型由几个不
同的基因成员编码 ∀在玉米中已分离到 w 个不同的细胞壁转化酶基因成员k ΙΝΧΩ1 ˜tzy|x o ΙΝΧΩ2
„ƒsxsyvt o ΙΝΧΩ3 „ƒswvvwy o ΙΝΧΩ4 „ƒswvvwzl和 t个液泡转化酶基因kΙϖρ1 ˜tytuvlkŽ¬° ετ αλqousssl ∀在
胡萝卜转化酶基因家族中 o编码细胞壁酸性转化酶基因的 x个不同成员k÷y|vut o ÷z{wuv o ÷z{wuw o ÷t{zsy o
÷t{zszl和编码液泡酸性转化酶基因的 w个不同成员k÷yztyv o ÷zxvxt o ÷zxvxu o ÷zxvxvl以及编码中性转化
酶的 t个基因均已得到分离k²µ¨±½ ετ αλqot||x ~≥·∏µ°ot||y ~≥·∏µ° ετ αλqot|||l ∀
柑桔转化酶基因也是一个多成员基因家族 o已经报道了 u个转化酶基因成员k柑桔液泡酸性转化酶基因
´型 ΧΥΑΙ1和柑桔细胞壁酸性转化酶基因 µ型 ΧΣΧΩΙ oŠ¨ ±…¤±®登记号分别为 „ƒstw|ux和 „ƒvtwt|zlk安新
民等 ousstl ∀本研究获得了柑桔可溶性酸性转化酶基因家族的另外 u个成员柑桔液泡酸性转化酶基因 µ型
k ΧΥΑΙ2l和柑桔细胞壁酸性转化酶基因 µ型k ΧΥΧΩΙl o已经在 Š¨ ±…¤±®登记k„≠su|w{t和 „ƒvvu{{tl ∀
对已获得的 z个柑桔转化酶基因的聚类和同源性分析表明 }ktl柑桔酸性转化酶基因家族至少有 w个成
员 o而且 u个新成员与 ΧΥΑΙ1和 ΧΣΧΩΙ分属酸性转化酶基因家族的 w个不同的成员 ∀kul柑桔属不同种和
品种之间同一成员差异极小 o因此推测 w个成员的探针通用于柑桔属不同种和品种的 ≥²∏·«¨µ± !‘²µ·«¨µ±和
• ¶¨·¨µ±杂交分析 ∀kvl≥²∏·«¨µ±杂交分析表明 ΧΥΑΙ1 !ΧΥΑΙ2 !ΧΥΧΩΙ v个成员杂交时不会产生相互干扰的信
号 oΧΥΑΙ1 !ΧΥΑΙ2 !ΧΣΧΩΙ v个成员杂交时也不会产生相互干扰的信号 oΧΥΧΩΙ 和 ΧΣΧΩΙ 之间的交叉干扰现
象是由于二者核酸序列具有近 {s h的同源性所致 o为消除干扰信号的产生可采用 ΧΣΧΩΙ 基因与 ΧΥΧΩΙ 同
源性较低的上游或下游区制作探针进行杂交 ∀此外也可通过提高杂交温度和洗膜的严紧度来降低非特异性
的杂交信号k≥¤°¥µ²²® ετ αλqot|{| ~李德葆等 ot||yl o以达到真实反映其中一个探针杂交结果的目的 ∀由于 w
个成员间相对较低的核苷酸和氨基酸同源性使得它们不会在 ‘²µ·«¨µ±和 • ¶¨·¨µ±杂交中干扰主信号的获得 ∀
w个成员的获得有利于研究各成员在不同组织和发育阶段的表达情况 o为探讨它们各自在柑桔果实发育期
间蔗糖的积累和分解中所起的作用 o进而为理解果实发育以及含糖量这一品质性状形成机制打下基础 ∀
植物液泡和细胞壁中存在的酸性转化酶又各有几种同工酶 o柑桔中其它几种酸性转化酶的编码基因仍有
待克隆 ∀我们现已构建了柑桔基因组 ⁄‘„文库 o并从文库中分离出 ΧΣςΙ1和 ≤≥≤ • Œ全长基因 o其中包括启动
子在内的 ΧΣςΙ1全序列测定已完成 oΧΣΧΩΙ全长基因的测序和其它几个全长基因的分离工作正在进行 ∀
参 考 文 献
安新民 o徐昌杰 o张上隆 q柑橘酸性转化酶基因片段的克隆 q果树学报 ousst ot{kwl }t{| p t|u
陈大明 o张上隆 o金勇丰 q一种木本果树基因组 ⁄‘„提取方法研究 q浙江农业大学学报 ot||z ouvkyl }yut p yuw
李德葆 o周雪平 o许建平等编著 q基因工程操作技术 q上海 }上海科学技术出版社 ot||y
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