全 文 ：第 wv卷 第 u期
u s s z年 u 月
林 业 科 学
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松材线虫纤维素酶的免疫学分析 3
张 奇t 李海燕u 白 钢t 熊惠龙u 杨文博t
kt1 南开大学生命科学学院 天津 vssszt ~ u1 国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 ttssvwl
摘 要 } 制备松材线虫特定纤维素酶的多克隆抗体k„±·¬p…÷≤ysl o通过 ≥⁄≥p°„Š∞ !纤维素酶酶染分析 !免疫印迹
以及 ∞Œ≥„方法考察该抗血清的特异性 ∀进一步利用抗松材线虫全蛋白抗体k„±·¬p…÷l和 „±·¬p…÷≤ys抗体 o建立线
虫分泌性蛋白在 °∂⁄ƒ膜上双重染色的方法 ∀双重染色分析的结果表明 }松材线虫主要通过分泌孔向体外分泌大
量的分泌蛋白 o而纤维素酶的分泌方式与其他植物线虫相似 o是通过口针向外分泌 ∀
关键词 } 松材线虫 ~纤维素酶 ~双重染色
中图分类号 }≥wvu1wn x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlsu p ssyw p sw
收稿日期 }ussx p sz p u{ ∀
Ιµ µ υνολογιχαλ Αναλψσισ οφ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ Πατηογενουσ Χελλυλασε
«¤±ª ±¬t ¬‹¤¬¼¤±u …¤¬Š¤±ªt ÷¬²±ª ‹∏¬¯²±ªu ≠¤±ª • ±¨¥²t
kt1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o Νανκαι Υνιϖερσιτψ Τιανϕιν vssszt ~ u1 ΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ Χοντρολo
Στατε Αδµινιστρατιον οφ Φορεστρψ Σηενψανγ ttssvwl
Αβστραχτ } „©·¨µ³µ²§∏¦¬±ª°²∏¶¨ ¤±·¬p¦¨¯¯∏¯¤¶¨ …÷≤ys ³²¯¼¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¼ k¤±·¬p…÷≤ysl o·«¨ ¶³¨¦¬©¬¦¬·¼ ²©„±·¬p…÷≤ys º¤¶
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º¬·«µ¤¥¥¬·¤±·¬pΒυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ ¶¨µ∏° k„±·¬p…÷l ¤±§ „±·¬p…÷≤ys o º«¬¦«¦²∏¯§ ¥¨ ∏¶¨§©²µ¤±¤¯¼½¬±ª ¶¨¦µ¨·²µ¼
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³µ²·¨¬±¶·«µ²∏ª«¶¨¦µ¨·¬²± ³²µ¨ o¤±§¦¨¯¯∏¯¤¶¨ º¤¶¶¨¦µ¨·¨§©µ²° ¶·¼¯ ·¨·«¤·º¤¶·«¨ ¶¤°¨ ¤¶²·«¨µ³¯¤±·±¨ °¤·²§¨¶q
Κεψ ωορδσ} Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ~¦¨¯¯∏¯¤¶¨ ~§²∏¥¯¨¶·¤¬±¬±ª
松树枯萎病是由松材线虫k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl引起的重大森林病害 o其传播宿主为松墨天牛
k Μονοχηαµυσ αλτερνατυσl ∀当松树感染松材线虫后 o树脂道中的薄壁细胞的胞质首先会颗粒化 o并且发生褐变
kŽ∏¶∏±²®¬ot|{zl ∀随后树脂道 !木射线和形成层甚至木质部和皮层细胞形成空穴化 o从而导致组织死亡
kƒ∏®∏§¤ ετ αλqot||ul ∀目前关于松材线虫病的致病机制有毒素学说 !酶学说和空洞化学说 v种理论k’§¤±¬ετ
αλqot|{x ~Ž∏µ²§¤ot|{| ~’®∏ ετ αλqot|z|l ∀其中酶学说认为 }松材线虫会分泌高活力的纤维素酶 o该酶可以破
坏松树薄壁细胞管胞的细胞壁和细胞膜系统 o致使树脂分泌到管胞中并阻止水分的运输 o从而导致了松树的
枯萎 ∀ ’§¤±¬等kt|{xl首次初步分离了松材线虫高活力的纤维素酶 o并应用该酶和其他的商品化的具有水解
纤维素能力的酶类进行病理研究 o发现这一类酶均可以使正常松树死亡 o认为松材线虫纤维素酶是导致松树
枯萎病早期病症的主要因素 ∀ Ž²­¬°¤等kt||wl通过纤维素酶的酶染电泳验证了松材线虫纤维素酶具有水解
纤维素的能力 o并进一步证明了该酶通过水解细胞壁中纤维素导致宿主松树的死亡 ∀ Ž¬®∏¦«¬等kusswl克隆
了松材线虫的纤维素酶基因 o认为该基因可能来源于真菌 o松材线虫通过基因的水平漂移获得该基因 ∀
尽管松材线虫纤维素酶的作用已经被确认 o但有关它的表达 !分泌的过程却极少报道 ∀本文采用免疫学
的方法对松材线虫的纤维素酶分泌侵染过程进行了研究 o为确定致病因子纤维素酶在早期感染中的重要作
用提供有力证据 ∀
t 材料与方法
111 材料
试剂 }弗氏佐剂kŠŒ…≤’…•l o辣根过氧化物酶k‹• °l标记羊抗兔 ŒªŠ o辣根过氧化物酶k‹• °l标记的羊
抗鼠 ŒªŠ o邻苯二胺k’°⁄l ow p氯萘酚kwp≤‘l o羧甲基纤维素钠k≤≤l o羊血清及牛血清白蛋白k…≥„l均购于
北京 ׅ⁄生物工程有限责任公司 ~⁄„…显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司 ~兔抗松材线虫全蛋
白血清k„±·¬p…÷l为本实验室保存k白钢等 oussxl ~其他试剂均为分析纯 ∀
主要仪器 }酶标仪k…Œ’×∞≤‹ o∞÷{ssl o冷冻干燥机k≤«µ¬¶·o„°‹„t2wl o高速冷冻离心机k…¨ ¦®°¤±o
us• °xu⁄l o超声波细胞粉碎仪k国产l ∀
112 纤维素酶抗体的制备及特异性分析
取 tss Λª纯化的抗原性纤维素酶 …÷≤ysk张奇等 oussyl与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后 o腹腔注射
于 w周龄的雌性 …„…Π¦小鼠 ∀每隔 u周加强注射 t次 o采用 ∞Œ≥„法定期测定抗血清效价 o待获得最高效
价后 o收集血清 o作为抗松材线虫纤维素酶血清k„±·¬p…÷≤ysl op us ε 保存备用 ∀以不同种类的抗原为固相 o
采用直接 ∞Œ≥„方法分别分析 „±·¬p…÷≤ys以及 „±·¬p…÷ 的特异性k白钢等 oussxl ∀
113 纤维素酶酶谱电泳及免疫印迹分析
采用 ≥⁄≥p°„Š∞电泳kts h分离胶 o浓缩胶 v h l分离松材线虫粗酶液及纤维素酶 …÷≤ys o分离后的凝胶
采用半干式电转移 o分别转移至一块含有 t h ≤≤ 的 ≥⁄≥p°„Š∞凝胶和 °∂⁄ƒ膜上 o前者进行纤维素酶染色
kŠ²µ¨± ετ αλqot|zyl ~后者采用 ts sss倍稀释的 „±·¬p…÷≤ys抗体进行免疫印迹分析k张奇等 oussyl ~并同时进
行考马斯亮蓝染色分析 ∀
114 免疫斑点分析
取活松材线虫的混悬液k约 tss条Π滴l o滴加到 °∂⁄ƒ膜上 o于 ux ε 下培养 u «使之分泌物分泌在膜上 o
然后置于 vz ε 温育 v «以固定抗原 ∀充分清洗后 o以 ts h空白羊血清 w ε 封闭过夜后 o分别置于 x sss倍稀
释的 „±·¬p…÷ 或 ts sss倍稀释的 „±·¬p…÷≤ys血清中室温反应 v «o充分清洗后分别加入 u sss倍稀释的 ‹• °
标记的羊抗兔或鼠ŒªŠ的酶标抗体 o室温反应 t1x «o采用 ⁄„…显色试剂盒显色至适宜后水洗中止反应 o显微
镜下观察并照相 ∀
115 双重染色分析
按上面描述的方法进行抗原的固定和封闭 o随后将 °∂⁄ƒ 膜置于 ts sss倍稀释的 „±·¬p…÷≤ys血清和
x sss倍稀释的 „±·¬p…÷ 血清的混合液中室温反应 v «o随后加入 u sss倍稀释的 ‹• °标记的羊抗鼠 ŒªŠ o室温
反应 t1x «o⁄„…显色试剂盒显色至适宜后水洗中止反应 ~然后再加入 u sss倍稀释的 ‹• °标记的羊抗兔ŒªŠ
酶标抗体 o室温反应 t1x «owp≤‘ks1x °ª#°ptwp≤‘os1stu h ‹u ’u os1t °²¯#pt×µ¬¶p‹≤¯ 缓冲液 o³‹z1wl显色至
适宜水洗中止反应 o显微镜下观察并照相 ∀
 }标准分子量蛋白 ¤µ®¨µ³µ²·¨¬±~t }全蛋白提取物 …÷ ·²·¤¯
³µ²·¨¬±~u }纤维素酶 …÷≤ys ≤¨¯ ∏¯¯¤¶¨ …÷≤ys ~ „ }≥⁄≥p°„Š∞~
…}酶染分析 ≤¨¯ ∏¯¯¤¶¨ ¶·¤¬±¬±ª~≤ }免疫印迹 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·
图 t 松材线虫蛋白的 ≥⁄≥p°„Š∞ !免疫印迹及酶染分析
ƒ¬ªqt ≥⁄≥p°„Š∞ !• ¶¨·¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¨¶¤±§¦¨¯¯∏¯¤¶¨
¶·¤¬±¬±ª²© Β q ξψλοπηιλυσ ³µ²·¨¬±¶
u 结果与分析
211 抗血清的特异性分析
纤维素酶的酶染结果显示 }松材线虫含有 u种可以水
解 ≤ ≤的纤维素酶 }…÷≤ys和 …÷≤vsk图 t o…tl ~但免疫印
迹的结果表明 }„±·¬p…÷≤ys血清针对松材线虫总蛋白提取
物只呈现单一条带k图 t o≤tl o该着色部位与考马斯亮蓝染
色和纤维素酶 …÷≤ys酶染部位相一致k图 t o„u o…ul ∀该结
果表明 }所制备的抗纤维素酶多克隆抗体能够特异性地识
别纤维素酶 …÷≤ys o而与其他的包含 …÷≤vs在内的可溶性
蛋白没有交叉反应 ∀
抗体的特异性分析结果如图 u所示 }在相同浓度的固
相抗原kx Λª#°ptl条件下 o„±·¬p…÷≤ys与 „±·¬p…÷ 相比具
有较好的特异性 ∀ „±·¬p…÷≤ys能够特异性地识别松材线虫
纤维素酶 …÷≤ys o而与松材线虫的另一种纤维素酶 …÷≤vs
以及其他的商品酶k蛋白酶 Ž!果胶酶 !中性蛋白酶和商品
纤维素酶l几乎没有交叉反应 ∀由于松材线虫与拟松材线虫同源性较高 o该血清与拟松材线虫总蛋白提取物
k… ·²·¤¯ ³µ²·¨¬±l也呈现了一定的交叉反应k  tx1v h l o信噪比k°Π‘l大于 y o即该血清针对松材线虫纤维素
酶具有较好的特异性 ∀
212 分泌性全蛋白及纤维素酶的免疫斑点分析
以 „±·¬p…÷ 为示踪抗体的免疫斑点分析结果表明 }活的松材线虫会向体外分泌大量的可溶性蛋白 ∀如
xy 第 u期 张 奇等 }松材线虫纤维素酶的免疫学分析
图 u „±·¬p…÷≤ys与 ¤±¬·p…÷ 多克隆抗体的特异性分析
ƒ¬ªqu ≥³¨¦¬©¬¦¬·¼ ¤¶¶¤¼ ²© „±·¬p…÷≤ys ¤±§ „±·¬p…÷ ¶¨µ∏°
图 vp„ !…所示 o全蛋白的抗原染色主要集中在松材
线虫分泌孔附近 o由于体壁有少部分蛋白抗原 o因
此染色后可以看出不明显的虫体轮廓 ∀但经 tss
ε ou °¬±热致死的松材线虫k图 vp≤l则没有任何着
色反应 o即分泌性蛋白均来源于活体的松材线虫 ∀
另一方面 o纤维素酶的染色结果显示 }松材线
虫向体外分泌的纤维素酶零星地分布在各处 o较为
分散 o推测与觅食活动相关 o明显区别于分泌性全
蛋白k图 wp„l ∀同样热致死的松材线虫则没有任何
染色反应k图 wp…l ∀
213 双重染色
双重染色的结果更清晰地表明 }松材线虫分泌
的大量可溶性蛋白分泌物呈蓝黑色染色 o并主要集
中在分泌孔周围 ~而松材线虫分泌的纤维素酶染色
图 v 松材线虫分泌性全蛋白的 ⁄„…染色
ƒ¬ªqv ⁄„…¶·¤¬±¬±ª²© Β q ξψλοπηιλυσ ¶¨¦µ¨·¬²±¶
„ o…}松材线虫分泌的全蛋白染色 ײ·¤¯ ³µ²·¨¬±¶¶·¤¬±¬±ª²©³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨¶~„k ≅ wsl o…k ≅ tssl ~
≤ }负对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯k ≅ tssl ~白色箭头所指处为全蛋白染色
• «¬·¨ ¤µµ²º«¨¤§¶¬±§¬¦¤·¨·²·¤¯ ³µ²·¨¬±¶¶·¤¬±¬±ªq
呈褐色染色 o且零星分布
在松材线虫的口部附近 o
与分泌性蛋白相比两者
之间有明显的差别k图 xp
„ !…l ∀而热处理的松材
线虫对照样品则无任何
着色反应k图 xp≤l ∀据报
道k≥°¤±·ετ αλqot||{l o植
物线虫在其侵入宿主细
胞时先通过其口针刺入
植物的细胞壁 o并向外分
泌纤维素酶 o水解细胞壁
的纤维素 o导致细胞壁软
化 o以便其进入植物细胞
„ }松材线虫分泌的纤维素酶染色k ≅ tssl ≤¨¯ ∏¯¯¤¶¨ ¶·¤¬±¬±ª²©³¬±¨
º²²§±¨ °¤·²§¨ ~…}负对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯k ≅ tssl ~黑色箭头所指处为
纤维素酶染色 …¯¤¦®¤µµ²º«¨¤§¶¬±§¬¦¤·¨ ¦¨¯¯∏¯¤¶¨ ¶·¤¬±¬±ªq
图 w 松材线虫分泌的纤维素酶 ⁄„…染色
ƒ¬ªqw ⁄„… ¶·¤¬±¬±ª²© Β q ξψλοπηιλυσ ¦¨¯¯∏¯¤¶¨
中 ∀结合图 v !w的结果认为 }松材线虫分泌的纤维素
酶也是通过口部中空的口针向外分泌的 ∀
v 讨论
目前松材线虫病已给自然环境和资源带来了巨大
的灾害 o并且通过国际间的商贸活动跨国传播的现象
也十分严重 o已经成为了亚洲 !欧洲等松林的主要病
害 o已被列入我国生物入侵的主要检疫对象 ∀虽然目
前对松材线虫分泌的纤维素酶的相关酶学性质报道甚
少 o松材线虫与拟松材线虫纤维素酶之间的差异也尚
未定论 o但在寄主松树的早期感染中 o纤维素酶仍被认
为是重要的致病因素之一 ∀
¤º¯ µ¨等kt||v¤~t||v¥l通过松材线虫全蛋白抗血
清来检测松材线虫 o尽管由于交叉反应等原因 o其方法存在着一定的局限性 o但为作者工作提供了一定的参
考 ∀本研究中 o作者利用兔抗松材线虫可溶性全蛋白血清和鼠抗松材线虫纤维素酶 …÷≤ys多克隆抗体 o分
别对松材线虫分泌在 °∂⁄ƒ膜上的包括纤维素酶在内的分泌物进行分析 o旨在阐明纤维素酶的分泌过程及
其分泌部位 ∀
yy 林 业 科 学 wv卷
„ o…}松材线虫分泌物的双重染色 ⁄²∏¥¯¨¶·¤¬±¬±ª²©³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨¶~„k ≅ wsl o…k ≅ tssl ~
≤ }负对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯k ≅ tssl ~白色箭头所指处为全蛋白染色 • «¬·¨ ¤µµ²º«¨¤§¶¬±§¬¦¤·¨·²·¤¯
³µ²·¨¬±¶¶·¤¬±¬±ª~黑色箭头所指处为纤维素酶染色 …¯¤¦®¤µµ²º«¨¤§¶¬±§¬¦¤·¨ ¦¨¯¯∏¤¶¨ ¶·¤¬±¬±ªq
图 x 松材线虫分泌物的双重染色
ƒ¬ªqx ⁄²∏¥¯¨¶·¤¬±¬±ª²© Β q ξψλοπηιλυσ ¶¨¦µ¨·¬²±¶
严东辉等kt||yl曾证
明松材线虫可以向体外
分泌多种酶蛋白 o其中包
括纤维素酶 !过氧化物
酶 !蛋白酶 !淀粉酶等 ∀
Ž¬®∏¦«¬等kusswl克隆了
松材线虫的纤维素酶的
基因 o并通过地高辛标记
的分子探针对线虫进行
了原位杂交实验 o发现纤
维素酶产生于线虫的食
道腺 ∀
本研究建立了线虫
分泌蛋白在 °∂⁄ƒ膜上双
重染色的试验方法 ∀本试验结果表明 }松材线虫主要通过分泌孔分泌大量的蛋白 o而松材线虫的纤维素酶的
分泌方式与其他植物线虫相似 o也是通过口针向体外分泌 ∀该方法为检测松材线虫纤维素酶提供了一个新
的手段 o同时也为开展松材线虫病的病理研究奠定了一定的基础 ∀
参 考 文 献
白 钢 o王玉 o马洪周 o等 qussx1 疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究 q林业科学 owtkul }|t p |x
严东辉 o杨宝君 qt||y1 松材线虫体外酶组成分析 q林业科学研究 otskvl }uyx p uy|
张 奇 o马洪周 o杨文博 o等 qussy1 松材线虫纤维素酶的分离纯化及免疫学检测方法的研究 q南开大学学报 ov|ktl }|x p ||
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³¤µ¤¶¬·¬¦¦¼¶·±¨ °¤·²§¨¶q°‘„≥ o|x }w|sy p w|tt
k责任编辑 朱乾坤l
zy 第 u期 张 奇等 }松材线虫纤维素酶的免疫学分析