全 文 ：第 wt卷 第 t期
u s s x年 t 月
林 业 科 学
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利用 Œ≥≥• ⁄‘„标记鉴定主要银杏栽培品种
沈永宝t 施季森t 赵洪亮u
kt1 南京林业大学 国家林业局南方林木种子检验中心 南京 utssvz ~ u1江苏省邳州市林业局 邳州 uutwssl
关键词 } 银杏 ~Œ≥≥• 标记 ~鉴定
中图分类号 }≥zt{1w| ~≥zt{1wy 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlst p susu p sv
收稿日期 }ussv p tu p uw ∀
Ιδεντιφιχατιον ον τηε Μαιν Χυλτιϖατεδ ς αριετιεσ οφ Γινκγο βιλοβα
Υσινγ ΙΣΣΡ ∆ΝΑ Μαρκερ
≥«¨ ± ≠²±ª¥¤²t ≥«¬¬¶¨±t «¤² ‹²±ª¯¬¤±ªu
kt1 Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Σουτηερν Τρεε Σεεδ Ινσπεχτιον Χεντερ Νανϕινγ utssvz ~ u1 Πιζηου Φορεστ Αδµινιστρατιον o ϑιανγσυ Προϖινχε Πιζηουuutwssl
Αβστραχτ} Γινκγο βιλοβα ¬¶²±¨ ²© °²¶·©¤°²∏¶²©©¬¦¬±¤¯ ³¯¤±·¬± ≤«¬±¤qŒ± ·«¨ ³¤¶·o °¤±¼ √¤µ¬¨·¬¨¶ º¨ µ¨ ¶¨¯¨ ¦·¨§¤±§
³¯¤±·¨§o¥∏··«¨µ¨¬¶±²·¶·¬¯¯ ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±¶¼¶·¨°©²µ·«¨¶¨ √¤µ¬¨·¬¨¶q׫¬¶³¤³¨µ¶·∏§¬¨§⁄‘„©¬±ª¨µ³µ¬±·¶²©·«¨ °¤¬± Γ q βιλοβα
√¤µ¬¨·¬¨¶¦∏¯·¬√¤·¨§¤¯¯ ²√¨ µ·«¨ ¦²∏±·µ¼ ∏¶¬±ªŒ≥≥• ⁄‘„ °¤µ®¨µq ׫¨ µ¨¶∏¯·¶¬±§¬¦¤·¨§Œ≥≥• °¤µ®¨µº¤¶ ©¨©¨¦·¬√¨ «¬ª«¯¼ ©²µ
¬§¨±·¬©¼¬±ªtv √¤µ¬¨·¬¨¶q’±¯¼ ∏¶¬±ª³µ¬°¨ µŒ≥≥•wy ¤±§Œ≥≥•ww otv √¤µ¬¨·¬¨¶º¨ µ¨ ¤¥¯¨·²¥¨ ¬§¨±·¬©¬¨§¥¤¶¨§²±tt ³²¯¼°²µ³«¬¦
²¯¦¬kŒ≥≥•wy p xxs oŒ≥≥•wy p yzs oŒ≥≥•wy p zws oŒ≥≥•wy p tsss oŒ≥≥•wy p ttx| oŒ≥≥•wy p tvx| oŒ≥≥•wy p tyss oŒ≥≥•ww p
xus oŒ≥≥•ww p x{s oŒ≥≥•ww p yys oŒ≥≥•ww p tzxsl qŒ± ¤§§¬·¬²±o º¨ ©²∏±§Œ≥≥• °¤µ®¨µº¤¶¶·¤¥¯¨ ¤±§µ¨³¨¤·¤¥¯¨ «¬ª«¯¼
¦²°³¤µ¨§º¬·« • „°⁄ °¤µ®¨µq
Κεψ ωορδσ} Γινκγο βιλοβα~Œ≥≥• °¤µ®¨µ~¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±
银杏k Γινκγο βιλοβαl是我国特有树种 o我国劳动人民自古就有栽植银杏的习惯 ∀在长期栽培过程中 o已
逐渐形成了一些农家品种 ∀由于品种间形态差异k非果期l较小 o用常规方法无法鉴别各个品种 o特别是早期
k苗期l鉴定 ∀us世纪 |s年代以来 o⁄‘„分子标记技术的不断发展和完善 o为品种鉴定提供了新的技术手
段 o如 • „°⁄! „ƒ° !Œ≥≥• !≥≥• 等 ∀这些标记也逐步被用于植物种或品种的鉴定研究 o如 • „°⁄标记鉴定桂
花k Οσµαντηυσφραγρανσl品种k赵小兰等 ot|||l !„ƒ°标记鉴定苹果k Μαλυσ πυµιλαl品种k祝军等 ousssl和美洲
黑杨k Ποπυλυσ δελτοιδεσl无性系k尹佟明等 ot||{l等 ∀本文利用 Œ≥≥• ⁄‘„标记 o分析我国银杏主要栽培品种
Œ≥≥• 标记的多态性 o寻找这些品种的鉴定指纹 ∀
1 材料与方法
t qt 试验样品采集 样品的冬芽采于江苏省邳州市国家林业局银杏种质资源收集圃 ∀共采集 tv个优良
品种 }tl泰兴 u号 ~ul尖顶佛手 ~vl龙眼 ~wl叶子银杏 ~xl金坠子 ~yl洞庭皇 ~zl梅核 ~{l鸭尾 ~|l邳州曹 u
号 ~tsl邳州亚甜 ~ttl泰兴 t号 ~tul邳州芋香 ~tvl小圆子 ∀ ⁄‘„的提取采用沈永宝等kusstl方法 ∀
t qu °≤• 扩增 °≤• 扩增在 °∞|yss基因扩增仪上进行 ∀优化的 °≤• 扩增条件 }|w ε 预变性 u °¬±后进入
vx个循环 o每个循环 |w ε 变性 vs ¶ oxx ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 t1x °¬±∀所有循环完成后延伸 z °¬±o最后于
w ε 保存 ∀优化的反应体系 }总反应体积 us ˏo其中 x ±ª左右模板 ⁄‘„ ~ts ³°²¯ 引物 ~§‘×°量各为 tss Λ°²¯
#pt ou ˏts ≅反应缓冲液≈tss Λ°²¯#pt ×µ¬¶p ‹≤¯ k³‹ {1vl oxss Λ°²¯#pt Ž≤¯ ou1s °°²¯#pt ª≤¯ u os1st h
明胶 ox1s ª#pt …≥„  ot ˜ פª⁄‘„聚合酶 ~扩增产物在 u h含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离 o最后在紫
外灯下用 °²¯¤µ²¬§摄像系统记录结果 ∀
t qv Œ≥≥• 引物 试验使用的 tss条 Œ≥≥• 引物购自上海生物技术工程公司 ∀
2 结果
通过对 tss条 Œ≥≥• 引物的筛选 o最终筛选出 x条产物清晰 !多态性高的引物用于 tv个银杏品种的 °≤•
扩增 ∀ Œ≥≥• v }„≤„≤„≤„≤„≤„≤„≤„≤×× ~ Œ≥≥• ww }„≤„≤„≤„≤„≤„≤„≤„≤Š„ ~ Œ≥≥• wy }„≤„≤„≤„≤„≤„≤„≤„
≤ŠŠ ~Œ≥≥• yz }×≤×≤×≤×≤×≤×≤×≤≤≤ ~Œ≥≥• zx }„Š×Š„Š×Š„Š×Š„Š×Š ∀
图 t tv个银杏栽培品种 °≤• 扩增产物k引物 Œ≥≥• wyl
ƒ¬ªqt °≤• ³µ²§∏¦·¬²± ²©³µ¬° µ¨Œ≥≥• wy ©²µtv Γ q βιλοβα √¤µ¬¨·¬¨¶
t ∗ tv }样品号 ≥¤°³¯¨‘²q~⊥ }多态性片段 °²¯¼°²µ³«¬¦ ²¯¦¬q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
图 u tv个银杏栽培品种 °≤• 扩增产物k引物 Œ≥≥• wwl
ƒ¬ªqu °≤• ³µ²§∏¦·¬²± ²©³µ¬° µ¨Œ≥≥• ww ©²µtv Γ q βιλοβα √¤µ¬¨·¬¨¶
x个引物共扩增多态性位点 v{个 ∀图 t和图 u分别是引物Œ≥≥• wy和Œ≥≥• ww对 tv个银杏品种的扩增结
果 ∀从图 t可看出 o供扩增多态性片段 z条 o不同品种多态性片段差异较大 ∀有些品种间区别比较明显 o具
有特异性片段 o如片段 Œ≥≥• wy p xxs ¥³为 u号样品k尖顶佛手l特有 ~Œ≥≥• wy p yzs ¥³为 tv号k小圆子l特有 ∀
结合引物 Œ≥≥• ww扩增出的 w条多态性片段 Œ≥≥• ww p x{s ¥³ !Œ≥≥• ww p xus ¥³!Œ≥≥• ww p yys ¥³!Œ≥≥• ww p tzxs
¥³o借鉴于常规植物分类方法 o根据各品种某一多态性片段的有或无 o编制 tv个银杏品种检索表 }
t q有 Œ≥≥• wy p xxs ¥³片段 uk尖顶佛手 ¬¤±§¬±ª©²¶«²∏l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
t q无 Œ≥≥• wy p xxs ¥³片段 t !v !w !x !y !z !{ !| !ts !tt !tu !tv, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
u q有 Œ≥≥• wy p yzs ¥³片段 tvk小圆子 ÷¬¤²¼∏¤±½¬l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
u q无 Œ≥≥• wy p yzs ¥³片段 t !v !w !x !y !z !{ !| !ts !tt !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
v q有 Œ≥≥• wy p zws ¥³片段 w !|, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
w q有 Œ≥≥• wy p tyss ¥³片段 |k邳州曹 u号 ‘²qu ²©°¬½«²∏¦¤²l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
w q无 Œ≥≥• wy p tyss ¥³片段 wk叶子银杏 ≠ ½¨¬¼¬±¬¬±ªl, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
v q无 Œ≥≥• wy p zws ¥³片段 t !v !x !y !z !{ !ts !tt !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
w q有 Œ≥≥• wy p ttx| ¥³片段 zk梅核  ¬¨«¨ l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
w q无 Œ≥≥• wy p ttx| ¥³片段 t !v !x !y !{ !ts !tt !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
x q有 Œ≥≥• wy p tvxs ¥³片段 ttk泰兴 t号 ‘²qt ²©×¤¬¬¬±ªl, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
x q无 Œ≥≥• wy p tvxs ¥³片段 t !v !x !y !{ !ts !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
y q无 Œ≥≥• wy p tsss ¥³片段 t !ts, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
z q有 Œ≥≥• ww p x{s ¥³ tk泰兴 u号 ‘²qu ²©×¤¬¬¬±ªl, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
z q无 Œ≥≥• ww p x{s ¥³ tsk邳州亚甜 °¬½«²∏¼¤·¬¤±l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
y q有 Œ≥≥• wy p tsss ¥³片段 v !x !y !{ !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
z q有 Œ≥≥• ww p yys ¥³片段 xk金坠子 ¬±½«∏¬½¬l, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
z q无 Œ≥≥• ww p yys ¥³片段 v !y !{ !tu, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
vsu 第 t期 沈永宝等 }利用 Œ≥≥• ⁄‘„标记鉴定主要银杏栽培品种
{ q无 Œ≥≥• ww p x{s ¥³片段 tuk邳州芋香 o°¬½«²∏¼∏¬¬¤±ªl, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
{ q有 Œ≥≥• ww p x{s ¥³片段 v !y !{, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
| q有 Œ≥≥• ww p tzxs ¥³片段 v !y, , , , , , , , , , , , , , , , ,
ts q有 Œ≥≥• ww p xus ¥³片段 yk洞庭皇 ⁄²±ª·¬±ª«∏¤±ªl, , , , , , , , , , , , , , ,
ts q无 Œ≥≥• ww p xus ¥³片段 vk龙眼 ²±ª¼¤±l, , , , , , , , , , , , , , ,
| q无 Œ≥≥• ww p tzxs ¥³片段 {k鸭尾 ≠¤º ¬¨l, , , , , , , , , , , , , , , , ,
根据以上检索表 o可逐步鉴别这些品种 ∀当然这种方法对于少数品种鉴定较为直观 o简单易行 ∀
3 讨论
简单序列重复区间扩增多态性k¬±·¨µp¶¬°³¯¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ µ¨³¨ ¤·oŒ≥≥• l是一种新型 ⁄‘„ 分子标记技术
k¬¨·®¬¨º¬¦½ot||wl ∀它是根据基因组内广泛存在的微卫星基序设计单一引物 o对基因组 ⁄‘„进行扩增 o扩增
的指纹图同时提供基因组内多个位点序列信息 ∀Œ≥≥• 标记结合了 ≥≥• 标记技术和 • „°⁄标记技术的特点 o
除了根据微卫星区域设计引物和 °≤• 的退火温度比 • „°⁄高外 o与 • „°⁄标记的检测过程基本一致 ∀由于
Œ≥≥• 引物长度在 tx ∗ uw ¥³左右 o°≤• 反应的退火温度较高 o引物 p模板复合物比较稳定等因素 o表现出较
好稳定性 ∀钱韦等kusssl和 ²±¶¶²±等kt||yl的研究也认为 Œ≥≥• 的稳定性明显优于 • „°⁄o保持了微卫星标
记的特点 ∀杜生明kt|||ltl比较 • „°⁄标记和Œ≥≥• 标记对美洲黑杨和欧美杨k Ποπυλυσευραµεριχαναl基因组的
分析 o有扩增产物的 Œ≥≥• 引物 |s h以上能检测到分离位点 o可靠性更高 ∀不过退火温度与 Œ≥≥• 指纹的稳定
性至关重要 ∀退火温度不仅影响指纹的丰富度 o而且直接影响指纹的识别 ∀在较低的退火温度下增加了非
特异扩增的可能 o导致一些假带的产生k≥¤±¦«¨½ ετ αλqot||yl ∀在本试验过程中也同样发现这一现象 ∀
与微卫星k≥≥• l相比 oŒ≥≥• 不要求已知基因组序列信息 o大大减少多态分析的前期工作 o引物具有广泛
的通用性 ∀尽管 Œ≥≥• 是一种显性遗传标记 o不能检测显性纯合基因型和杂合基因型 o但作为种或品种鉴定
的分子标记 o并不受其影响 ∀本文的研究发现 Œ≥≥• 标记能更好揭示品种间的差异 o仅用 u个 Œ≥≥• 引物就能
区分 tv个银杏品种 o鉴定效率和稳定性也明显优于 • „°⁄标记 ∀
由于本文鉴别的银杏品种只有 tv个 o通过类似于植物常规分类方法 o编制各个品种的指纹检索表 ∀由
于每个引物扩增多态位点的数量和特异性不同 o选择哪个引物扩增结果作为检索表的起始点 o存在很大人为
因素 ∀不同分析者使用同样资料 o编制的检索表可能不同 o不过 o最终都能达到鉴别目的 ∀此外 o当品种数量
较多时 o由于所牵扯多态性位点多 o编制检索表的方法很难有效 o只有通过建立数据指纹图谱 o进行聚类分
析 o才能达到鉴别各品种的目的 ∀
就品种鉴定而言 o包含 u个层面 }一是鉴定已知特定材料的真实性 o另一是鉴定未知材料 ∀本文所研究
的 tv个银杏品种的 Œ≥≥• 指纹 o只能用于已知特定材料的真实性鉴定 o即鉴定某一已知特定品种的可靠性
k比较鉴定l ∀如果待鉴定品种不属于这 tv个品种之一 o也无法进行鉴定 ∀对未知材料的鉴定是极其困难
的 o有时根本无法做到 ∀只有不断扩大研究品种的数量来增加对未知品种鉴定的可能性 ∀
tl杜生明 qt||| q美洲黑杨和欧美杨分子标记连锁图谱构建及其重要性状相关基因定位研究 q南京林业大学博士论文
参 考 文 献
钱 韦 o葛 颂 o洪德元 qusss q采用 • „°⁄和 Œ≥≥• 标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性 q植物学报 owukzl }zwt p zxs
沈永宝 o施季森 qusst q银杏 !板栗不同组织 ⁄‘„的提取 q南京林业大学学报 ouxktl }{s p {u
尹佟明 o王明庥 o黄敏仁 o等 qt||{ q美洲黑杨无性系 „ƒ°指纹分析 q植物学报 owsk{l }zz{ p z{s
赵小兰 o姚崇怀 qt||| q桂花部分品种的 • „°⁄分析 q华中农业大学学报 ot{kxl }{| p |t
祝 军 o王 涛 o赵玉军 o等 qusss q利用 „ƒ°标记鉴定苹果品种 q园艺学报 ouzkul }tsu p tsy
²±¶¶²± … ’ o²±¶§²·¬µŒ ≥ o≤µ²±¥¨µª‘qt||y q≤²±¤¯ §¬√ µ¨¶¬·¼ ¤±§¤¯ ²¯½¼°¨√¤µ¬¤·¬²±¬±·«¨ ³²³∏¯¤·¬²± ²©·«¨ ¤µ·¬¦ Χαρεξ βιγελουιι k≤¼³¨µ¤¦¨¤¨ l q∞¦²¯ o{w }
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≥¤±¦«¨½ §¨ ¤¯  ° o⁄¤√¬¯¤o²¤µ¦¨ ≠ o ετ αλqt||y q≥¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·³µ¬°¨ µ¶∏¶¨§¬± ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²± ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±·²¶·∏§¼ ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼
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¬¨·®¬¨º¬¦½ ∞qt||w q Š¨ ±²°¨©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª¥¼ ¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ k≥≥• l2¤±¦«²µ¨§³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²±q Š¨ ±²°¨ ous }tz{ p t{v
wsu 林 业 科 学 wt卷