全 文 ：第 wu卷 第 x期
u s s y年 x 月
林 业 科 学
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¤¼ou s s y
杨树溃疡病菌异核体现象的研究
余仲东t 刘莉丽t 曹支敏t 张星耀u
kt1 西北农林科技大学林学院 杨凌 ztutss ~ u1 中国林业科学研究院 北京 tsss|tl
关键词 } 致病力 ~异核体 ~ • ƒ°
中图分类号 }≥zyv1tt 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsx p stwu p sv
收稿日期 }ussw p s| p u| ∀
基金项目 }杨树溃疡病菌营养体亲和性研究k校基金 yxvsutl ∀
Στυδψ ον Ηετεροκαρψοτιχ Πηενοµενον οφ Ποπλαρ Χανκερ Πατηογεν
≠∏«²±ª§²±ªt ¬∏¬¯¬t ≤¤² «¬°¬±t «¤±ª ÷¬±ª¼¤²u
kt1 Χολλεγε οφ ΦορεστρψoΝορτηωεστ Α&Φ Υνιϖερσιτψ Ψανγλινγ ztutss ~ u1 Χηινεσε Αχαδεµψοφ Φορεστρψ Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ} ׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©¬±²¦∏¯¤·¬²± ²± ¤³³¯ ¶¨ º¬·« «¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦¶·µ¤¬±¶¶«²º ·«¤·«¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦³«¨ ±²°¨ ±²± ¬¶²±¨ ²©
¬°³²µ·¤±·µ¨¤¶²±¶²©³²³¯¤µ¦¤±®¨µ³¤·«²ª¨±¬¦¬·¼ √¤µ¬¤·¬²±q׫¨ ³¤·«²ª¨±¬¦¬·¼ ²©«¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦¶·µ¤¬±¶µ¨ ¤¯·¨¶º¬·«·«¨ º¨ ¤® º¬¯§
³¤µ¨±·¤¯ ¶·µ¤¬±¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼q׫¨ ¶·∏§¼ ²©¦¼·²¯²ª¼ °¤±¬©¨¶·¶±∏¦¯¨ ²¯∏¶«¤√¨ ·µ¤±¶©¨µµ¨§¥¨·º¨ ±¨ √¨ ª¨·¤·¬√¨ ¦²°³¤·¬¥¬¯¬·¼ ¶·µ¤¬±¶q
׫¨ º¬¯§³¤µ¨±·¤¯ ¶·µ¤¬± ∏¶∏¤¯ ¼¯ «¤¶²±¯¼ ²±¨ ±∏¦¯¨ ²¯∏¶³¨µ¦¨¯¯ oº«¬¯¨ ·«¨ «¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦¶·µ¤¬± ²©·¨± «¤¶·º²²µ°²µ¨ ±∏¦¯¨ ²¯∏¶
³¨µ¦¨¯¯ q׫¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²©Œ×≥2µ⁄‘„2• ƒ°¬°³¯¬¨¶·«¨ ³¤·«²ª¨±¬¦¬·¼ √¤µ¬¤·¬²± °¤¼ ¥¨ µ¨ ¤¯·¨§º¬·«¦¼·²³¯¤¶° ©¯²º q
Κεψ ωορδσ} ³¤·«²ª¨±¬¦¬·¼~«¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦~• ƒ°
异核体现象是真菌遗传变异和基因流动的基础 o在小麦条锈菌毒性变异中起着重要的作用k康振生等 o
t||vl ∀真菌中广泛存在的营养体亲和现象 o使异核体现象在真菌的进化 !适应性 !致病性变异中更具重大意
义k余仲东等 oussul ∀本文研究杨树溃疡病菌异核体现象的细胞学及分子生物学证据 o及异核体现象在病菌
致病性变异中的作用 ∀
t 材料与方法
t1t 供试材料 菌株 „ o从陕西杨凌的北京杨k Ποπυλυσ βειϕινγενσισl上分离获得 ∀菌株 …来自辽宁铁岭 o从箭
杆杨≈ Πq νιγρο √¤µq τηεϖεστιναk⁄²§¨l 上分离获得 ∀
t1u 异核体菌株的培养及培养特性 用打孔器k5 s1x ¦°l取 °⁄„上培养 x §的 „ !…菌落 o在基本培养基上
对峙培养 o待形成稳定的生长配接线后 o取配接线菌丝体单独培养 o获得单一菌落后 o取菌丝顶端培养 o直到
获得稳定的异核体菌落 o并记录菌株生长时的菌落特征 ∀
t1v 细胞核染色 采用 ƒ∏¯ª¨ ±染色法对亲本 !异核体菌株菌丝体细胞核染色 o染色方法参照郑若立kt|z{l ∀
t1w 致病性测定 将 „ !…菌株 !异核体株系分别接种在红富士苹果上k5 | ¦°l o每苹果接 u孔k孔深 s1x
¦°l o每孔 t个菌饼 ∀设 t个对照孔 o不接菌饼 ∀保湿培养 o逐日记录垂直 u方向病斑大小 o取均值并减去对
照孔直径作为病斑发病大小 ∀每接种重复 u次 ∀将所得数据用软件 ≥°≥≥k∂ µ¨¶¬²±tt1x o„°¨ µ¬¦¤±l进行单因素
方差分析和多重比较 ∀
t1x Œ×≥ pµ⁄‘„ p • ƒ°分析 按 «∏等kt||vl方法提取 ⁄‘„ ∀采用通用引物 Œ×≥t !Œ×≥w对核糖体基因转录
间隔区进行扩增 ∀引物序列为 }Œ×≥t xχ  ×≤≤Š×„ŠŠ×Š„„≤≤׊≤Š  vχ !Œ×≥w xχ  ×≤≤×≤≤Š≤×ׄ×׊„×„× 
vχ ∀ פ´ 多聚酶为鼎国生物工程公司生产 ∀
反应体系 xs ˏ∀包括 §§‹u ’ uz ˏots ≅ …∏©©¨µx ˏoªun kux Λ°²¯#ptlv ˏow§‘×°¶kts °°²¯#ptl t
ˏoŒ×≥tkts Λ°²¯#ptl u1x ˏoŒ×≥wkts Λ°²¯#ptl u1x ˏoפ´ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨kt ˜#ˏptl w ˏo⁄‘„ x ˏo共计 xs
ˏ∀反应条件 }|w ε 预变性 u °¬±oxx ε 停留 ws ¶ o|v ε 变性 t °¬±oxt ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 t °¬± vs¶ovx个
循环 ow ε 终止反应 ∀°≤• 产物用 Ηηα´k识别序列 }Š≤ŠΠ≤l和 Ηπαµk识别序列 ≤Π≤ŠŠl酶解 o反应条件按说
明书 ∀酶解产物采用 { h °„Š∞电泳 o成像系统成像并分析结果 ∀
u 结果与分析
u1t 异核菌株及 „ !…菌株培养生物学特性比较 将 „ !…菌株对峙培养后 ou菌落边缘菌丝相互交织 o形成
隆起的 !气生菌丝发达的白色生长配接线 o配接线的基部有显著的色素沉积 ∀取配接线菌丝培养获得 v株系
k„…t !„…u !„…vl ∀菌落k„…l均具有菌落 „和 …的培养特征 ov株系菌丝尖端培养形成的菌落 o其培养特征
近同k图 tl ∀
…}气生菌丝不发达 o基内菌丝粗壮 o呈羽毛状辐射生长 o初期菌落有褐黄色素沉积 o后期有黑色小点生成 ∀ „ µ¨¬¤¯ °¼¦¨ ¬¯∏° ¬¶¶³¤µ¶¨ ¤±§ º«¬·¨o
¶·µ²±ª ° §¨¬∏° °¼¦¨ ¬¯∏° ªµ²º o ¬¯®¨ µ¤§¬¤·¨©¨¤·«¨µq°¼¦±¬§¬¤¯ ¬±¬·¬¤¯ ¬¶¼¨ ¯¯²º¬¶«2¥µ²º ¤¨µ¯¼ ¤±§¥¨¦²°¨ ¶¥µ²º±¬¶«2§¤µ®¶³²·²±·«¨ ° §¨¬∏° ¤¯·¨µq„ }气生菌
丝发达 !白色 !纤细 !海绵状 o基内菌丝细密 o初期菌落白色 o后期有橄榄色至黑色色素沉积 ∀ „ µ¨¬¤¯ °¼¦¨ ¬¯∏° ¬¶§¨±¶¨ o¶¯¬° o º«¬·¨ ¤±§¶³²±ª¼q
׫¨ ° §¨¬∏° º¬·«¬± ¶¯ ±¨§¨µ°¼¦¨ ¬¯∏°¬¶·µ¤±¶¯∏¦¨±·¬±·«¨ ¤¨µ¯¼¶·¤ª¨ o¤±§ ¤¯·¨µ²¯¬√¨ ·²§¤µ®¬¶«2ªµ¨ ±¨ ³¬ª° ±¨·¶§¬©©∏¶¨§¬±·«¨ °¨ §¬∏° q„…}气生菌丝发达 o
白色 !纤细 !海绵状 o基内菌丝不发达 !较细弱 o初期菌落有褐黄色素沉积 o后期有黑色小点生成 ∀ „ µ¨¬¤¯ °¼¦¨ ¬¯∏° ¬¶§¨±¶¨ o ¼¨ ¯¯²º¬¶«2º«¬·¨o
¶¯¬°¨ ¤±§¶³²±ª¼o° §¨¬∏° °¼¦¨ ¬¯∏°¬¶¶³¤µ¶¨ ¤±§¶¯¬° oº¬·«¼¨ ¯¯²º¬¶«2¥µ²º ³¬ª°¨ ±·¶¬±·«¨ ° §¨¬∏°¬±·«¨ ¤¨µ¯¼¶·¤ª¨ o¤©·¨µº¤µ§¶o§¤µ®¶³²·³¼¦±¬§¬∏°ªµ²º¶
²±·«¨ °¨ §¬∏° q
图 t 异核体菌株及亲本菌株培养生物学特性
ƒ¬ªqt ׫¨ ¦∏¯·∏µ¨ ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶²©«¨·¨µ²¦¤µ¼·¬¦¶·µ¤¬±¶¤±§·«¨¬µ³¤µ¨±·¤¯ ¶·µ¤¬±¶
u1u 细胞核染色结果 ƒ∏¯ª¨ ±染色结果表明 }„菌株为单核菌株 ~…菌株为单核菌株或双核 o以单核常见 ~
„…为异核体菌株 o具有双核或 v核 o以双核为主k图 ul ∀
„ }单细胞核 ˜±¬±∏¦¯ ¤¨·¨ ¦¨¯¯ ~ …}单细胞核 }˜±¬±∏¦¯ ¤¨·¨ ¦¨¯¯ ~ „…}双细胞核 o左箭头示细胞核 o右箭头示菌丝体隔膜
…¬±∏¦¯ ¤¨·¨ ¦¨¯¯ o¯¨©·¬±§¬¦¤·¨¶±∏¦¯ ²¨¯∏¶oµ¬ª«·¤µµ²º¬±§¬¦¤·¨¶¶¨³·∏°
图 u 菌丝体细胞核染色结果
ƒ¬ªqu ⁄¼¬±ªµ¨¶∏¯·¶²©±∏¦¯ ²¨¯∏¶
u1v 致病性分析 经单因素方差分析表明 o供试菌株致病力大小存在显著差异k表 tl ∀异核体菌株平均致
病力均低于亲本菌株致病力大小 o其中 „…t最小k图 vl ∀差异一致性检验表明 o各菌株差异显著性不一致
k表 ul ∀故采用 פ°«¤±¨ 法进行多重比较 ∀结果表明 }异核体菌株平均致病力大小与亲本 „菌株平均致病
力差异显著 o与 …菌株平均致病力差异不显著 ∀异核体菌株间 o„…t与 „…v平均致病力差异显著 !与 „…u平
均致病力差异不显著 !„…u与 „…v平均致病力差异显著k表 vl ∀
表 1 单因素方差分析
Ταβ . 1 Ονε2ωαψ ανοϖε (Α= 0105)
方差
≥∏° ²©¶´∏¤µ¨
自由度
ک
均方
 ¤¨± §¬©©¨µ¨±¦¨
Φ值
Φ √¤¯∏¨
显著性
≥¬ª±¬©¬¦¤±·
菌株间 Œ±·¨µ2¶·µ¤¬± vuw1zut ts vu1wzu ty1u{v s1sss
菌株内 Œ±·µ¤2¶·µ¤¬± txv1xxu zz t1||w
总方差 ≥∏° ¶´∏¤µ¨ wz{1uzv {z
表 2 差异一致性检验
Ταβ . 2 Τεστ οφ ηοµ ογενειτψ οφ ϖαριανχεσ(Α= 0105)
¨√¨ ±¨ 统计
¨√¨ ±¨ ¶·¤·¬¶·¬¦
自由度 t
کt
自由度 u
کu
显著性系数
≥¬ª±¬©¬¦¤±·
vt1|wz w vx s1sss
u1w 遗传分析结果 °≤• 扩增 Œ×≥区段获得特异性 yss¥³片段 ∀经 u种 w碱基高频内切酶酶解 o异核体菌
株 „…同亲本菌株 „ !…酶解格局无明显差异k图 wl ∀
v 结论与讨论
杨树溃疡病菌是造成我国北方杨树死亡的重要原因之一k向玉英 ot|{zl ∀该菌致病力的分化早有报道 o
但分化的细胞学基础尚未有人研究 ∀本文研究了病菌营养体自然条件下亲和得到的 v株异核体菌株 o并从
细胞学的基础上证明异核体菌株确实为病菌营养体亲和的结果 ∀通过接种实验和统计分析 o研究了异核体菌
株与亲本菌株致病力差异 o异核体菌株致病力明显低于亲本菌株致病力 o异核体菌株间致病性存在显著分化 ∀
vwt 第 x期 余仲东等 }杨树溃疡病菌异核体现象的研究
图 w Œ×≥ pµ⁄‘„ p °≤• 及 • ƒ°分析
ƒ¬ªqw °µ²§∏¦·¶²©Œ×≥ pµ⁄‘„ p °≤• ¤±§ • ƒ° ¤±¤¯¼¶¬¶
图 v 异核体与亲本菌株平均致病力大小
ƒ¬ªqv  ¤¨± ³¤·«²¯²ª±¬¦¬·¼ ²©«¨·¨µ²®¤µ¼²·¬¦¶·µ¤¬±¶¤±§³¤µ¨±·¤¯
表 3 Ταµ ηανε多重比较 ≠
Ταβ . 3 Ταµ ηανε µ υλτιπλε χοµ παρισονσ οφ τηε τεστεδ στραινσ.
πατηογενιχιτψ (Α= 0105)
菌株kŒl
≥·µ¤¬±kŒl
菌株kl
≥·µ¤¬±kl
平均差异
kŒpl
 ¤¨±
§¬©©¨µ¨±¦¨
标准误差
≥·¤±§¨µ
µ¨µ²µ
显著值
≥¬ª±¬©¬¦¤±·
√¤¯∏¨
下限
²º µ¨
¥²∏±§
上限
˜³³¨µ
¥²∏±§
„…t „…u p s1u{t s1tut s1ws{ s1sss s1w|x
„…v p s1vy{ 3 s1s{x s1su{ s1sss p s1sv{
„ p w1|wv 3 s1{yx s1ssz s1sss p t1wzz
… p u1txy s1ywt s1ttw s1sss s1wtx
„…u „…t s1u{t s1tut s1ws{ s1sss s1zx{
„…v p s1s{z 3 s1twy t1sss s1sss s1wsy
„ p w1yyu 3 s1{zv s1ss| s1sss p t1utv
… p t1{zx s1yxt s1ust s1sss s1yzw
„…v „…t s1vy{ 3 s1s{x s1su{ s1sv{ s1y||
„…u s1s{z 3 s1twy t1sss s1sss s1x{t
„ p w1xzx 3 s1{y| s1stt s1sss p t1ttz
… p t1z{z s1ywz s1uv| s1sss s1zzu
„ „…t w1|wv 3 s1{yx s1ssz t1wzz {1wtt
„…u w1yyu 3 s1{zv s1ss| t1utv {1ttu
„…v w1xzx 3 s1{y| s1stt t1ttz {1svv
… u1z{z t1szy s1usw s1sss y1ws|
… „…t u1txy s1ywt s1ttw s1sss w1zuz
„…u t1{zx s1yxu s1ust s1sss w1wuw
„…v t1z{z s1ywz s1uv| s1sss w1vwz
„ p u1z{z t1szy s1usw s1sss s1{vw
≠ 3 }表示差异显著  ¤¨±¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·§¬©©¨µ¨±¦¨ q上k下l限置信水平
|x h ²º µ¨k∏³³¨µl ¥²∏±§¦²±©¬§¨±¦¨ ¬±·¨µ±¤¯ ¬¶|x h q
本研究表明 }异核体现象是造成溃疡病菌致病力分
化的重要原因之一 ∀异核体形成并不产生明显的异核体
优势 o异核体菌株致病力与弱毒亲本菌株毒力相近 o而与
毒力强的亲本毒力差异显著 ∀核糖体 Œ×≥区段是研究真
菌系统发育和群体遗传变异的有效片段k余仲东等 ousssl o对异核体菌株与亲本菌株 Œ×≥ pµ⁄‘„ p • ƒ°分析
表明 o异核体菌株和亲本菌株并无显著核遗传差异 o说明在菌丝融合过程中 o核质因素并不是菌株致病性差
异的主要原因 o弱毒株系胞质流动可能是造成毒性变异的重要因素 ∀在板栗疫病的研究中也发现弱毒株系
细胞质在营养体亲和群体k∂ ≤Š¶l中流动 o尤其是其中 §¶• ‘„ 的传递是造成菌株弱毒的原因k王克荣等 o
t||zl ∀本研究中 u亲本菌株致病力并无统计上的显著差异 o但接种结果表明 o弱毒亲本是影响异核体毒力
显著弱化的原因 ∀异核体菌株k„…l具有明显的双亲本生长特性 o也能正常形成分生孢子 o但尝未发现子囊
壳形成 ∀少部分分生孢子菌落在培养中发生回复突变现象 o表现出 „或 …菌株培养特性 o更多的像 „菌株 o
大部分分生孢子菌落在连续转接培养中表现出稳定的培养生物学特性 ∀这种现象说明 o异核体菌株中细胞
核仍存在重组分化 o其机理和作用尝不清楚 ∀
ƒ∏¯ª¨ ±染色法是将核酸中的五炭糖氧化而显色 o在植物细胞学研究中应用较多 ∀本研究表明该法也是
真菌细胞学研究的良好方法 ∀同 Š¬°¶¤染色法一样 o该法对菌丝体隔膜区分上存在困难k罗信昌 ot||{l o尤
其是对纤细的气生菌丝 ∀在供试菌株Œ×≥ pµ⁄‘„ p • ƒ°分析中 o本研究只使用了 u种高频限制性内切酶 o该
菌是否存在其他位点的变异 o值得进一步研究 ∀
参 考 文 献
康振生 o李振岐 qt||v1 小麦条锈菌异核作用产生的一新菌系 q西北农业大学学报 outktl }|z p ||
罗信昌 qt||{1 木耳和毛木耳的极性研究 q真菌学报 ozktl }xy p yt
王克荣 o成桂英 o刘怡君 o等 qt||z1 栗疫病菌的营养体亲和性基因和对 §¶• „‘病毒传播的影响 q菌物学报 otyktl }vs p vx
向玉英 qt|{z1杨树病害及其防治 q北京 }中国林业出版社
余仲东 o张星耀 o曹支敏 qusss1 真菌核糖体基因间隔区研究概况 q西北林学院学报 oktxlu }tsz p ttt
余仲东 o张刚龙 o曹支敏 qussu1 病原菌种内群体遗传分化研究现状与技术 q西北林学院学报 otzkwl }yy p zu
郑若立 qt|z{1实用细胞学技术 q北京 }科学出版社
«∏ ‹ o ±∏ƒ o«∏‹ qt||v1Œ¶²¯¤·¬²± ²©ª¨ ±²°¬¦⁄‘„¶©µ²° ³¯¤±·¶o©∏±ª¬¤±§¥¤¦·¨µ¬¤∏¶¬±ª¥¨ ±½¼¯ ¦«¯²µ¬§¨ q‘∏¦¯ ¬¨¦„¦¬§¶• ¶¨¨¤µ¦«outkuul }xuz| p xu{s
k责任编辑 朱乾坤l
wwt 林 业 科 学 wu卷