全 文 ：第 wv卷 第 z期
u s s z年 z 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1wv o‘²1z
∏¯ qou s s z
毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2
的克隆与表达分析 3
周 洲 张德强 卢孟柱
k中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 tsss|tl
摘 要 } 以毛白杨为材料 o结合生物信息学和分子生物学技术 o利用现有的杨树基因组 ∞≥×序列库资源 o通过同
源序列搜索 o经过多次拼接合并 o获得了理论的杨树油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 ¦⁄‘„序列 ~首次利用 • ×2°≤• 方法
从杨树这个物种中成功克隆得到毛白杨 ΠτΦΑ∆2 全长编码序列¦⁄‘„ kŠ¨ ±…¤±®注册号 }⁄±vtyz{{l o该¦⁄‘„长 t uzy
¥³o开放阅读框编码 v{{个氨基酸 ∀ • ×2°≤• 半定量研究表明 }ΠτΦΑ∆2 在叶片 !茎 !根不同组织中的表达量基本一
致 o并且在 w ε 低温处理过程中转录表达量没有变化 o说明短时间内该基因表达不受低温诱导 ∀
关键词 } 毛白杨 ~油酸去饱和酶基因 ~克隆 ~反转录 °≤• ~表达分析
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlsz p ssty p sy
收稿日期 }ussy p sx p ty ∀
基金项目 }/ |w{0国家引进国际先进农业科学技术资助项目/调控树木脂肪酸组成的基因工程技术0kussx p w p xul和国家自然科学基金项
目kvswztws|l资助 ∀
3 卢孟柱为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Εξπρεσσιον Αναλψσισ οφ ΠτΦΑ∆2 Γενε Ενχοδινγ
τηε Ενδοπλασµιχ Ρετιχυλυµ Φαττψ Αχιδ t{Βt ∆εσατυρασειν Ποπυλυστοµεντοσα
«²∏«²∏ «¤±ª ⁄¨ ¬´¤±ª ∏ ±¨ª½«∏
k ΚεψΛαβορατορψοφ Τρεε Βρεεδινγ ανδ Χυλτιϖατιον οφ Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ ΦορεστρψoΧΑΦ Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ } ׫¨ ±¨§²³¯¤¶°¬¦µ¨·¬¦∏¯∏° t{Βt ©¤·¼ ¤¦¬§§¨¶¤·∏µ¤¶¨ kƒ„⁄ul¬¶·²³µ²√¬§¨ t{Βu ©¤·¼ ¤¦¬§µ¨ ∏´¬µ¨§©²µ·«¨ ¦²µµ¨¦·
¤¶¶¨°¥¯¼ ²© ¦¨¯¯∏¯¤µ °¨ °¥µ¤±¨ ¶·«µ²∏ª«²∏··«¨ ³¯¤±·qŒ± ·«¬¶¶·∏§¼o¤©∏¯¯ 2¯ ±¨ª·«¦⁄‘„ ¦¯²±¨ ²© ΠτΦΑ∆2 ª¨ ±¨ k Š¨ ±…¤±®
¤¦¦¨¶¶¬²± ±∏°¥¨µ}⁄±vtyz{{l º¤¶©¬µ¶·¯¼¬¶²¯¤·¨§∏¶¬±ª·«¨ ιν σιλιχο ¦¯²±¬±ª °¨ ·«²§¬± ΠοπυλυστοµεντοσαqŒ·¬¶t uzy ¥³¬±
¯¨ ±ª·«¤±§·«¨ ²³¨ ± µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ±¨¦²§¨¶¤ ³¨ ³·¬§¨ ²©v{{ ¤°¬±² ¤¦¬§¶o º«¬¦« °¤·¦«·«¨ ®±²º± ³¨ ³·¬§¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶q ׫¨
³µ¨§¬¦·¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ¶«²º¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·«²°²¯²ª¼ º¬·«·«²¶¨ ²©²·«¨µ³¯¤±·¶³¨¦¬¨¶oº«¬¦«¦²±·¤¬±·¼³¬¦¤¯ §²°¤¬±¶²º±¨ §
¥¼ ƒ„⁄u ³µ²·¨¬±¶q׫¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¶²© ΠτΦΑ∆2 ¤µ¨ ¨´ ∏¤¯ ¬± ¯¨ ¤√¨ ¶o¶·¨° ¤±§µ²²·¶∏¶¬±ª¶¨°¬2 ∏´¤±·¬·¤·¬√¨ • ×2°≤• q • «¨ ±·«¨
¶«²²·¶º¨ µ¨ ¬¨³¨µ¬¨±¦¨§·«¨ ¦²¯§·µ¨¤·°¨ ±·¶o·«¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¶²© ΠτΦΑ∆2 ¬¶±. ·µ¨§∏¦¨§¬± uw «q׫¬¶¶∏ªª¨¶·¶·«¤··«¨ ΠτΦΑ∆2
°¤¼ ¥¨ ¤¶·µ∏¦·∏µ¤¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³µ²·¨¬±¤±§¬·¬¶±.·¬±§∏¦¨§¥¼ ²¯º·¨°³¨µ¤·∏µ¨ q׫¬¶¶·∏§¼ ³µ²√¬§¨¶·«¨ ¥¤¶¬¶©²µ±²·²±¯¼ ¦¯²±¬±ª
¤±§µ¨¶¨¤µ¦«²©³²³¯¤µ©¤·¼ ¤¦¬§§¨¶¤·∏µ¤¶¨ ª¨ ±¨ o¥∏·¤¯¶²·«¨ ª¨ ±¨·¬¦ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª²©³¯¤±·©¤·¼ ¤¦¬§¬±·«¨ ±¨ ¤µ©∏·∏µ¨ q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυστοµεντοσα~ ΠτΦΑ∆2 ~°²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª~• ×2°≤• ~ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±¤¯¼¶¬¶
脂肪酸都有一个长的烃链和一个羧基末端 o烃链以线性的为主 o不同脂肪酸之间的区别主要在于烃链的
长短 !饱和与否及双键的数目和位置等 ∀根据烃链的饱和程度 o可将脂肪酸分为 }tl饱和脂肪酸k≥ƒ„l o其烃
链是饱和的 o无双键 ~ul单不饱和脂肪酸k˜ƒ„l o含有 t个双键 ~vl多聚不饱和脂肪酸k°˜ƒ„l o含有 u个以上
的双键 ∀饱和脂肪酸在脂肪酸去饱和酶的作用下形成不饱和脂肪酸 o包括棕榈油酸和油酸等单不饱和脂肪
酸 o以及亚油酸和亚麻酸等长链多聚不饱和脂肪酸 ∀植物脂肪酸去饱和作用可在叶绿体和内质网上进行 o一
部分不饱和脂肪酸可以由位于叶绿体的 t{Βt脂肪酸去饱和酶催化而成 o但绝大多数的不饱和脂肪酸由位于
内质网上的 t{Βt脂肪酸去饱和酶催化而来k…µ²º¶¨ ετ αλ1 ot||t ~ ¯´ ∏¨¯ ετ αλ1 ot||u ~ •¤º¶·«²µ±¨ oussu ~
׫¨¯¨ ± ετ αλqoussul ∀多聚不饱和脂肪酸都是生物膜的必要组分 o许多试验表明不饱和脂肪酸在增加膜的流
动性中发挥重要作用k‹∏ª¯¼ ετ αλqot||u ~ ¯´ ∏¨¯ ετ αλqot||vl o质膜中不饱和脂肪酸含量同生物体抗寒耐盐
等抗逆性有直接的相关性k≥¤°¤¯¤ ετ αλqot||{ ~≥∏µ¨¶« ετ αλqoussu ~刘汉梅等 oussx ~毛志滨等 oussyl ∀用基
因工程手段将脂肪酸不饱和酶基因在烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl中超量表达 o结果发现转基因烟草膜脂不饱和
脂肪酸显著增加 o耐低温能力加强kŽ²§¤°¤ ετ αλqot||wl ∀许多高等植物叶部细胞脂肪酸组分中 ot{Βu和
t{Βv两种多聚不饱和脂肪酸大于 zs h o在根等一些非光合作用器官中也要占到 xx h ∗ zs h k‹¤µº²²§ot|{sl ∀
位于内质网上的油酸去饱和酶 ƒ„⁄u是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶k’®∏¯ ¼¨ ετ αλqot||wl o该脂肪
酸去饱和酶的重要功能就是催化产生 t{Βu多元不饱和脂肪酸 o在单不饱和脂肪酸中引入第 u个双键 ∀本文
以毛白杨k Ποπυλυστοµεντοσαl为材料 o将生物信息学和分子生物学相结合 o克隆毛白杨油酸去饱和酶 ΠτΦΑ∆2
基因 o不仅具重要的理论意义 o而且还有广泛的应用前景 o为杨树等植物的脂肪酸基因工程研究提供基础 ∀
t 材料和方法
111 材料
t1t1t 生物信息学数据库 °²³∏¯∏¶⁄…o„¶³¨ ±⁄…o°²³¯¤µ⁄…为世界上 v个大型的杨树 ∞≥×数据库 ∀美国国家
生物技术信息中心k‘¤·¬²±¤¯ ≤ ±¨·¨µ©²µ…¬²·¨¦«±²¯²ª¼ Œ±©²µ°¤·¬²±o ‘≤…Œl提供并维护的 …„≥× 数据库k…¯¤¶·
⁄¤·¤¥¤¶¨¶l o网址是 «·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Π…„≥×Π∀
t1t1u 网络服务器和软件 序列比对工具 …„≥×kussxl是一个在庞大的数据库中查找同源序列的在线程
序 ∀在 °²³∏¯∏¶⁄… !„¶³¨ ±⁄… !°²³¯¤µ⁄… v个杨树 ∞≥×数据库和美国国家生物技术信息中心 …„≥×数据库中选
用 …„≥×± !…„≥׬!·…„≥×±等程序进行核苷酸序列和蛋白质序列的在线比对 ∀在本地计算机上用 °µ¬°¨ µ
°µ¨°¬¨µx1ss !≤¯ ∏¶·¤¯ ÷ !⁄‘„°¤±等生物软件做序列转换和同源性分析 ∀
t1t1v 试验材料及其来源 tl植物材料 毛白杨形成层取自 w年生河北省易县毛白杨 ∀所用植物材料取
样后立即液氮速冻 o并于液氮中冷冻保存直至使用 ∀ul菌株 大肠杆菌k Εσχηεριχηια χολιl⁄‹xΑ购自北京天为
时代科技有限公司 ∀vl化学试剂 °©∏ ⁄‘„聚合酶 !×w ⁄‘„连接酶 !³Š∞2×2 ¤¨¶¼载体 !限制性内切酶购自
°µ²°¨ ª¤公司 ~§‘×° !פ´ ⁄‘„聚合酶购自上海生物工程有限公司 ~÷2Š¤¯ !Œ°×Š购自 פŽ¤•¤公司 ~氨苄青霉素
k„°³l购自华美生物工程公司 ~⁄usss ⁄‘„ ¤µ®¨µ!t ®¥⁄‘„ ¤§§¨µ购自北京天为时代科技有限公司 ~°≤• 产
物胶回收试剂盒购自北京博大生物技术有限公司 ∀其他试剂均为国产分析纯试剂 ∀wl寡核苷酸引物 设计
的引物由北京博亚生物技术有限公司合成 ∀
图 t ΠτΦΑ∆2 °≤• 扩增及重组质粒
³Š∞2×2°·ƒ„⁄u Εχο• ´单酶切电泳图
ƒ¬ªqt ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶²©·«¨ ΠτΦΑ∆2 °≤• ³µ²§∏¦·¶¤±§
µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§³Š∞2×2°·ƒ„⁄u ⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§¥¼ Εχο• ´
t1⁄usss ⁄‘„ °¤µ®¨µ~u1 ΠτΦΑ∆2 °≤• 扩增条带 ΠτΦΑ∆2 °≤•
³µ²§∏¦·¶~v1 重组质粒 ³Š∞2×2°·ƒ„⁄u 由 Εχο• ´ 单酶切
• ¦¨²°¥¬±¤±·³Š∞2×2°·ƒ„⁄u ³¯¤¶°¬§⁄‘„ §¬ª¨¶·¨§º¬·« Εχο• ´ ~
w1 重 组 质 粒 ³Š∞2×2°·ƒ„⁄u • ¦¨²°¥¬±¤±· ³Š∞2×2°·ƒ„⁄u
³¯¤¶°¬§⁄‘„ ~x1 t ®¥ ⁄‘„ ¤§§¨µq
112 方法
t1u1t 杨树 ΠτΦΑ∆2 基因 ¦⁄‘„ 的电子克隆 以拟南芥k Αραβιδοπσισ τηαλιαναl油酸去饱和酶 ΦΑ∆2 基因
kŠ¨ ±¨ ¥¤±®注册号 }‘2ttuswzl为信息探针 o在 ⁄¨ ±§µ²°¨ 林木基因组数据库的 °²³∏¯∏¶⁄… !„¶³¨ ±⁄… !°²³¯¤µ⁄… v
个杨树 ∞≥× 数据库中运行·…„≥×±程序 ∀以·…„≥×±搜
索 v个杨树的 ∞≥×数据库 o选择与拟南芥 ΦΑ∆2 相似性最
高的 ∞≥× 序列 o将这条 ∞≥× 序列在杨树的 ∞≥× 数据库和
‘≤…Œ数据库中运行 …„≥×±程序 o选择比对分值最高的
∞≥×序列 o找出序列一致的部分 o人工拼接合并 ∞≥× o从而
将原 ∞≥×分别向 p vχ端和 p xχ端进行延伸 ~将延伸的 ∞≥×
序列再次用 …„≥×±程序在杨树的 ∞≥× 数据库中进行比
对 o多次延伸最终拼接得到杨树油酸去饱和酶 ΠτΦΑ∆2 基
因¦⁄‘„理论序列 ∀
t1u1u 毛白杨 • ‘„提取和 ¦⁄‘„第一链的合成 毛白杨
形成层总 • ‘„ 的提取使用 ±ŒŠ∞‘公司试剂盒k±¬¤ª¨±
• ‘¨¤¶¼ °¯¤±·¬±¬Ž¬·l ~¦⁄‘„ 第一链的反转录合成使用
≤¯ ²±¨ ·¨¦«公司试剂盒 k…⁄ ≥„• ×א °• ‘„ „°³¯¬©¬¦¤·¬²±
Ž¬·l o操作按照试剂盒的说明 ∀
t1u1v 毛白杨 ΠτΦΑ∆2全长¦⁄‘„编码序列的分子克隆
根据拼接的序列设计 °≤• 引物 °·ƒ„⁄u ƒµ}xχ2≤„≤×≤
≤≤×××≤×≤≤≤×ׄ×≤2vχ o°·ƒ„⁄u •¨}xχ2×≤„„≤„„Š„≤„ŠŠŠ
„ŠŠ≤ׄ2vχ ∀以毛白杨 ¦⁄‘„ 一链为模板 o用 °©∏高保真
⁄‘„聚合酶进行 °≤• 扩增 o°≤• 扩增的条件为 }|w ε w
°¬±预变性后 o|w ε vs ¶ox| ε vs ¶ozu ε |s ¶o共 vs个循
zt 第 z期 周 洲等 }毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 的克隆与表达分析
环 o最后 zu ε 延伸 z °¬±∀扩增得到的目的条带经电泳割胶回收后与 ³Š∞2×2 ¤¨¶¼载体连接 ow ε 连接过夜 ~
连接产物转化大肠杆菌 ⁄‹xΑo根据 Œ°×Š !÷2ª¤¯ 蓝白显色反应筛选阳性克隆 o获得重组质粒 ∀重组质粒分别
用 Εχο• ´酶切和 °≤• 方法进行验证 o证明重组子中含有目的片段 o得到重组子 ³Š∞2×2°·ƒ„⁄u o然后由北京
博亚公司完成序列测定 o得到毛白杨 ΠτΦΑ∆2基因序列 ∀
图 u ΠτΦΑ∆2 基因 ¦⁄‘„序列及推导的氨基酸序列
ƒ¬ªqu ׫¨ ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±§§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ©²µΠτΦΑ∆2
星号标示终止密码子 ≥·²³¦²§²±¬¶¬±§¬¦¤·¨§¥¼ ¤¶·¨µ¬¶®k 3 l q
t1u1w 毛白杨 ΠτΦΑ∆2 的序列
分析 用 ⁄‘„¶·¤µ!°µ¬°¨ µ°µ¨°¬¨µ
x1ss !¤·¦«¦²§¨ 软件对毛白杨
ΠτΦΑ∆2基因 ¦⁄‘„ 编码氨基酸
序列进行分析 ~并在 ‘≤…Œ提供
并维护的 …„≥× 数据库中进行
序列同源性比对和相似性搜索 o
多序列比对采用 ≤¯ ∏¶·¤¯ ÷ 软件 ~
用 ⁄‘„°¤±软件分析同源基因
间的进化关系 o并构建系统关系
聚类图 ∀
t1u1x 毛白杨 ΠτΦΑ∆2 的组织
表达分析 采用 • ×2°≤• 半定
量法对 ΠτΦΑ∆2 基因在毛白杨
组培苗叶 !茎 !根中的表达进行
分析 ∀毛白杨组培苗约 ts ¦°
高 o具 tu 片叶 o培养基为 tΠu
≥ o附加激素 ‘„„ s1sx °ª#pt
n Œ…„ s1sx °ª#pt o生长条件
ux ε otyΠ{ 光周期 ∀并且将生
长在 ux ε 的毛白杨组培苗突然
移入到 w ε 进行低温处理 o在处
理的 ts °¬±ovs °¬±ot «ou «oy
«otu «ouw «分别取叶片 o分析
该基因表达对低温诱导的反应 ∀
在表达模式分析的 • ×2°≤• 反
应中 o从毛白杨形成层细胞中提
取 °• ‘„反转录的第一链 ¦⁄‘„
为模板 o扩增 ΠτΦΑ∆2 用引物
°·ƒ„⁄u ƒµ}xχ2≤„≤×≤≤≤×××≤×≤≤≤×ׄ×≤2vχ o°·ƒ„⁄u •¨}xχ2×≤„ „≤„„Š„≤„ŠŠŠ„ŠŠ≤ׄ2vχ o以肌动蛋白基因
kαχτιν l 为 扩 增 内 部 参 照 o αχτιν 引 物 为 ¤¦·¬± ƒµ}xχ2ŠŠŠ×„Š„≤≤„„Š„≤„≤„≤׊Š2vχ o¤¦·¬± •¨}xχ2
ŠŠ„׊Š≤„׊׊Š„„Š ŠŠ≤„×2vχ ∀°≤• 扩增的条件为 }|w ε w °¬±预变性后 o|w ε vs ¶oys ε vs ¶ozu ε vs
¶o¤¦·¬±扩增 uy个循环 oΠτΦΑ∆2扩增 vt个循环 o最后 zu ε 延伸 z °¬±∀
u 结果与分析
211 毛白杨 ΠτΦΑ∆2基因 χ∆ΝΑ编码序列全长克隆
根据拼接好的序列 o两端设计 °≤• 引物 o通过 • ×2°≤• 的方法得到了毛白杨 ΠτΦΑ∆2 基因的 ¦⁄‘„克隆
kŠ¨ ±…¤±®注册号 }⁄±vtyz{{l ∀该克隆的¦⁄‘„长 t uzy ¥³oΠτΦΑ∆2重组质粒为 ³Š∞2×2°·ƒ„⁄uk图 tl ∀该序
列k图 ul包括起始密码子 „׊和 vv ¥³的 xχ末端非编码区kxχ˜×• l o终止密码子 ׊„和 zy ¥³的 vχ末端非编
码区kvχ˜×• l ∀经过 ⁄‘„≥·¤µ软件的序列分析 o发现其完整的开放读码框k’• ƒl共编码 v{{个氨基酸 ∀
{t 林 业 科 学 wv卷
图 v 毛白杨 ΠτΦΑ∆2 推导氨基酸序列与其他植物 ΦΑ∆2 氨基酸序列的比较
ƒ¬ªqv „¯¬ª±°¨ ±·²©·«¨ §¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Πq τοµεντοσα. ¶ ΠτΦΑ∆2 ¤±§·«¨ ΦΑ∆2 ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©²·«¨µ³¯¤±·¶
树种kŠ¨ ±…¤±®收录号l ×µ¨¨¶³¨¦¬¨¶kŠ¨ ±…¤±® ‘²ql } „·}拟南芥 Αραβιδοπσισ τηαλιαναk‘ p ttuswzl ~ …±}甘蓝型油菜 Βρασσιχα ναπυσ
k„ƒuwvswxl ~Š«}陆地棉 Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµk≠tsttul ~Š° }大豆 Γλψχινε µαξkwv|utl ~‘·}烟草 Νιχοτιανα ταβαχυµk„≠yyssuwl ~ ∂©}油桐
ςερνιχια φορδιιk„ƒxuxxvwl ~…²}玻璃苣 Βοραγο οφφιχιναλισk„ƒszwvuwl ~°·}毛白杨 Ποπυλυστοµεντοσα q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨ ¥¨ ²¯º q相同的氨基酸
用/ 3 0表示 ~/ }0或者/ #0表示相似的氨基酸 ~/ p 0表示空位 ∀ / 3 0º¤¶∏¶¨§·²¬±§¬¦¤·¨·«¨ ¬§¨±·¬¦¤¯ ¤°¬±²¤¦¬§¶o·«¨ / }0 ²µ/ #0 ° ¤¨±··«¤·
·«¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶º µ¨¨ ¶¬°¬¯¤µo/ p 0 ° ¤¨±··«¨ ª¤³q
212 毛白杨 ΠτΦΑ∆2基因序列同源性比较及聚类分析
推断克隆基因的编码蛋白氨基酸序列 o利用基因数据库资源进行同源性比较是判定基因功能的常用手
段 ∀通过同源性分析 o可以判断基因编码蛋白的功能 ∀将推测得到的 ΠτΦΑ∆2 氨基酸序列用 ‘≤…Œ的
…„≥×÷ 软件进行同源性搜寻 o结果显示与其同源的序列全部是脂肪酸去饱和酶 ΦΑ∆2 基因 o因而有理由相
信根据保守性区段克隆到的基因就是杨树脂肪酸去饱和酶基因 o按通用命名原则命名为 ΠτΦΑ∆2 ∀利用
≤¯ ∏¶·¤¯ ÷ 软件将推测的杨树 ΠτΦΑ∆2氨基酸序列同这些已知基因序列进行多序列同源比较 o部分区域可达完
全一致k图 vl ∀在进一步的比对分析后发现 o毛白杨与油桐kςερνιχια φορδιιl的油酸去饱和酶基因近缘的相似
性高达 {x h o与拟南芥k Αραβιδοπσισ τηαλιαναl !甘蓝型油菜k Βρασσιχα ναπυσl !陆地棉k Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµl !大豆
k Γλψχινε µαξl !烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl !玻璃苣k Βοραγο οφφιχιναλισl多种植物的 ΦΑ∆2 基因编码的氨基酸序列
相似性也都在 zx h以上 ∀{个序列比较结果如图 v所示 o共比较了 v{{个氨基酸残基 o高度保守的达到 {s h
以上 o其中有 uss个氨基酸残基完全保守 o占 xt1x h k上标 / 3 0者l o另有 zz个氨基酸残基高度保守 o占
t|1{ h k上标/ Β0者l ovu个氨基酸残基较高度保守 o占 {1u h k上标/ #0者l ∀
对毛白杨 !油桐 !拟南芥 !甘蓝型油菜 !陆地棉 !大豆 !烟草 !玻璃苣几种植物的 ΦΑ∆2 基因在氨基酸水平
|t 第 z期 周 洲等 }毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 的克隆与表达分析
图 w 毛白杨 ΠτΦΑ∆2 氨基酸序列与其他植物 ΦΑ∆2
氨基酸序列的聚类分析
ƒ¬ªqw °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²©¤°¬±²¤¦¬§²©§¬©©¨µ¨±·³¯¤±·¶. ΦΑ∆2 ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¥¼ ⁄‘„°¤± ³µ²ªµ¤°
上用 ⁄‘„°¤±软件做聚类分析k图 wl o
发现毛白杨和油桐最先聚合 o在进化
上显示亲源关系最近 o接着与大豆聚
合 o然后再与陆地棉 !烟草聚合 ~拟南
芥与甘蓝型油菜最先聚合 o然后再同
其他类群聚合到一起 ~其中玻璃苣在
聚类中显示其进化属较远分支 ∀
213 ΠτΦΑ∆2基因在不同组织中的表
达以及在低温处理中的表达变化分析
采用半定量 • ×2°≤• 法 o以毛白杨
肌动蛋白基因 αχτιν 为基因表达内部
参照 o对 ΠτΦΑ∆2在根 !茎 !叶片中的表
达以及受低温诱导后的表达情况进行
了分析 ∀结果k图 xl表明 oΠτΦΑ∆2 基
因在根 !茎 !叶片 v 种器官中均有表
图 x 毛白杨 ΠτΦΑ∆2 在叶 !茎 !根不同
组织中及在低温诱导过程中叶部的表达模式分析
ƒ¬ªqx ∞¬³µ¨¶¶¬²± ²© ΠτΦΑ∆2 ¬± ¯¨ ¤©o¶·¨° ¤±§
µ²²·¤±§¬± ²¯º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ·µ¨¤·° ±¨·¬± ¯¨ ¤©
达 o并且 v种器官中的表达量没有发现明显差别 o
说明 ΠτΦΑ∆2表达没有组织特异性 ∀在经 w ε 低温
处理中 o处理时间为 ts °¬±ovs °¬±ot «ou «oy «otu
«和 uw «oΠτΦΑ∆2 叶片中的表达量没有变化 o表明
在短时间的低温处理过程中该基因不受诱导 o这种
情况与拟南芥中的 ΑτΦΑ∆2低温诱导表达模式类似
k’®∏¯ ¼¨ ετ αλqot||wl ∀
v 讨论
将电子克隆与分子生物学手段相结合主要有
以下优点 }只需能够上网的计算机和 °≤• 仪等仪
器即可进行试验 o同源性比较 !∞≥× 拼接等工作在
计算机上完成 o只需 • ×2°≤• 进行序列验证 o试验成
本较低 o所需设备简单 ~试验只涉及到 • ‘„ 提取 !
°• ‘„ 反转录 !°≤• 扩增等分子生物学操作 o技术
难度不大 ∀本方法在实际应用中应该注意基因来源的物种与被研究的物种亲缘关系不宜太远 o基因长度不
要太长k  u ®¥l o否则可能会给数据库基因拼接分析和试验操作带来困难 ∀
ƒ„⁄u是催化产生亚油酸k≤ t{Βu l多元不饱和脂肪酸重要的酶 o在树木中关于这个基因的研究非常少 o
在杨树中还没有研究报道 ∀本试验研究利用现有的杨树基因组 ∞≥×序列库资源 o首先用电子克隆方法通过
同源序列搜索拼接合并获得了杨树油酸去饱和酶基因的 ¦⁄‘„理论序列 o然后运用 • ×2°≤• 等分子生物学手
段成功克隆得到了毛白杨 ΠτΦΑ∆2基因序列全长编码 ¦⁄‘„ o这是有关毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 研
究的首次报道 ∀本研究获得了毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 o为基因工程手段调控杨树等植物中不饱和
脂肪酸的合成提供了基础 ~虽然短时间内 ΠτΦΑ∆2的表达不受低温的诱导 o但是本研究为调节脂肪酸去饱和
酶基因的转录水平和酶活性提供了可能 ∀由于多元不饱和脂肪酸与植物抗逆性之间的紧密联系k•²∏·¤¥²∏¯
ετ αλqousss ~ ∏µ¤®¤°¬ετ αλqousss ~ ¤µ·½¬ετ αλqoussyl o因此本研究为培育杨树等植物抗逆基因工程研究
提供了基础 ∀
参 考 文 献
刘汉梅 o张怀渝 o谭振波 o等 qussx q植物抗寒基因及其在品种改良中的应用 q四川农业大学学报 ouvktl }ts| p ttw
毛志滨 o谢晓金 o汤庚国 qussy qz种冬青树种耐低温能力比较 q南京林业大学学报 }自然科学版 ovsktl }vv p vy
su 林 业 科 学 wv卷
…µ²º¶¨ o≥²° µ¨√¯ ¯¯¨ ≤ qt||t q Š¯ ¼¦¨µ²¯¬³¬§ °¨ ·¤¥²¯¬¶° o¥¬²¦«¨ °¬¶·µ¼ ¤±§µ¨ª∏¯¤·¬²±q„±±∏ • √¨ °¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ °¯ ¤±·²¬…¬²¯ owu }wyz p xsy
‹¤µº²²§qt|{s q°¯ ¤±·¤¦¼¯ ¬¯³¬§¶}¶·µ∏¦·∏µ¨ o§¬¶·µ¬¥∏·¬²±o¤±§¤±¤¯¼¶¬¶ΠΠ≥·∏°³© ° Žq…¬²¦«¨ °¬¶·µ¼ ²© ³¯¤±·¶}¤¦²°³µ¨«¨ ±¶¬√¨ ·µ¨¤·¬¶¨ o∂²¯ qw q ‘¨ º ≠²µ®}
„¦¤§¨ °¬¦°µ¨¶¶ot p xx
‹∏ª¯¼ ≥ o≥²° µ¨√¬¯¯¨ ≤ qt||u q„ µ²¯¨©²µ° °¨¥µ¤±¨ ¬¯³¬§³²¯¼∏±¶¤·∏µ¤·¬²±¬± ¦«¯²µ²³¯¤¶·¥¬²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤·¯²º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ o||ktl }t|z p usu
Œ‘• „ q°²³¯¤µ⁄…≈⁄…Π’  q≈ussx p tu p tx  q«·³}ΠΠ°¼¦²µq±¤±¦¼q¬±µ¤q©µΠ°²³¯¤µ⁄…Π¬±§¨¬q«·°¯ q
Ž²§¤°¤ ‹ o‹¤°¤§¤× o‹²µ¬ª∏¦«¬Šoετ αλqt||w qŠ¨ ±¨ ·¬¦ ±¨«¤±¦¨° ±¨·²©¦²¯§·²¯ µ¨¤±¦¨ ¥¼ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©¤ª¨ ±¨ ©²µ¦«¯²µ²³¯¤¶·≈²° ª¨¤ 2v©¤·¼¤¦¬§§¨¶¤·∏µ¤¶¨ ¬±
·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ otsxkul }yst p ysx
¤µ·½¬ƒ oŽ¬√¬±¬¨°¬≥ o°¤¯√¤× ∞oετ αλqussy q≤²±·µ¬¥∏·¬²± ²©²° ª¨¤2v ©¤·¼ ¤¦¬§§¨¶¤·∏µ¤¶¨ ¤±§v2®¨·²¤¦¼¯2„≤° ¶¼±·«¤¶¨ µkŽ„≥ µl ª¨ ±¨ ¶¬±·«¨ °²§∏¯¤·¬²± ²©
ª¯¼¦¨µ²¯¬³¬§©¤·¼ ¤¦¬§¦²°³²¶¬·¬²± §∏µ¬±ª¦²¯§¤¦¦¯¬°¤·¬²±¬± ¥¬µ¦«¯¨ ¤√ ¶¨q²∏µ±¤¯ ²© ∞¬³¨µ¬° ±¨·¤¯ …²·¤±¼oxzkwl }{|z p |s|
¯´ ∏¨¯  o…µ²º¶¨ qt||u q Αραβιδοπσισ °∏·¤±·¶§¨©¬¦¬¨±·¬± ³²¯¼∏±¶¤·∏µ¤·¨§©¤·¼ ¤¦¬§¶¼±·«¨¶¬¶o¥¬²¦«¨ °¬¦¤¯ ¤±§ ª¨ ±¨ ·¬¦¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²© ¤ ³¯¤±·²¯ ²¨¼¯2
³«²¶³«¤·¬§¼¯¦«²¯¬±¨ §¨¶¤·∏µ¤¶¨ q…¬²¯ ≤«¨ ° ouyzkvl }txsu p txs|
¯´ ∏¨¯  o¤°¨ ¶⁄µo⁄²²±¨ µ‹ oετ αλqt||v q Αραβιδοπσισµ¨ ∏´¬µ¨¶³²¯¼∏±¶¤·∏µ¤·¨§ ¬¯³¬§¶©²µ¯²º2·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¶∏µ√¬√¤¯ q°µ²¦‘¤·¯„¦¤§≥¦¬˜≥„ o|sktvl }yus{
p yutu
∏µ¤®¤°¬≠ o׶∏¼¤°¤  oŽ²¥¤¼¤¶«¬≠ oετ αλqusss q×µ¬¨±²¬¦©¤·¼ ¤¦¬§¶¤±§³¯¤±··²¯ µ¨¤±¦¨ ²©«¬ª«·¨°³¨µ¤·∏µ¨ q≥¦¬¨±¦¨ ou{zkul }wzy p wz|
‘¤·¬²±¤¯ ≤ ±¨·¨µ©²µ…¬²·¨¦«±²¯²ª¼ Œ±©²µ°¤·¬²±o˜ q≥ q‘¤·¬²±¤¯ ¬¥µ¤µ¼ ²©  §¨¬¦¬±¨ q…„≥×≈⁄…Π’  q≈ussx p tu p tx  q«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Π…„≥×Π
‘¤·¬²±¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ ƒ²∏±§¤·¬²±k‘≥ƒl o⁄¨ ³¤µ·°¨ ±·²© ∞±¨ µª¼k⁄’∞l o¬¦«¬ª¤± ¬©¨ ≥¦¬¨±¦¨ ≤²µµ¬§²µk ≥≤l q „¶³¨ ±⁄…≈⁄…Π’  q≈ussx p tu p tx  q«·³}ΠΠ
¤¶³¨ ±§¥q°·∏q¨§∏Π
’®∏¯ ¼¨ o¬ª«·±¨ µoƒ¨¯§°¤±± Žoετ αλqt||w q Αραβιδοπσισ ΦΑ∆2 ª¨ ±¨ ±¨¦²§¨¶·«¨ ±¨½¼°¨·«¤·¬¶ ¶¨¶¨±·¬¤¯ ©²µ³²¯¼∏±¶¤·∏µ¤·¨§ ¬¯³¬§¶¼±·«¨¶¬¶q׫¨ °¯ ¤±·≤¨¯¯o
yktl }twz p tx{
•¤º¶·«²µ±¨ ≥ qussu q≤¤µ¥²± ©¯∏¬¤±§©¤·¼ ¤¦¬§¶¼±·«¨¶¬¶¬± ³¯¤±·¶q°µ²ªµ¨¶¶¬± ¬³¬§ • ¶¨¨¤µ¦«owtkul }t{u p t|y
•²∏·¤¥²∏¯   oƒ¬¶¦«¨µ≥ ƒ o…µ²º¶¨ qusss q×µ¬¨±²¬¦©¤·¼ ¤¦¬§¶¤µ¨ µ¨ ∏´¬µ¨§·² °¤¬±·¤¬± ¦«¯²µ²³¯¤¶·©∏±¦·¬²± ¤·¯²º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨¶q °¯¤±·°«¼¶¬²¯²ª¼otuwkwl }
ty|z p tzsx
≥¤°¤¯¤≥ o≠¤±  ≠ o…¤¬µ§ • ∂ qt||{ q≤«¤±ª¨¶¬± ³²¯¤µ¯¬³¬§©¤·¼¤¦¬§¦²°³²¶¬·¬²±§∏µ¬±ª¦²¯§¤¦¦¯¬°¤·¬²±¬± − ¬§¬µ²±. ¤±§−˜v. …¨ µ°∏§¤ªµ¤¶¶q≤µ²³≥¦¬¨±¦¨ o
v{ktl }t{{ p t|x
≥∏µ¨¶« ≤ ≥ o•¤­¨¶«º¤µ° ≥ o⁄²±¤·° ‹ qussu q • ²¯¨²© ¬¯³¬§¶¤±§©¤·¼ ¤¦¬§¶¬± ¶·µ¨¶¶·²¯ µ¨¤±¦¨ ¬± Χψανοβαχτερια q„¦·¤°µ²·²½²²¯ owt }u|z p vs{
׫¨¯¨ ± o’«¯µ²ªª¨ …qussu q  ·¨¤¥²¯¬¦ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª²©©¤·¼ ¤¦¬§¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶¬± ³¯¤±·¶q  ·¨¤¥²¯¬¦∞±ª¬±¨ µ¨¬±ªowktl }tu p ut
˜° …¨°¯ ¤±·≥¦¬¨±¦¨ ≤ ±¨·µ¨ q°²³∏¯∏¶⁄…≈⁄…Π’  q≈ussx p tu p tx  q«·³}ΠΠ³²³³¨¯q©¼¶¥²·q∏°∏q¶¨Π
k责任编辑 徐 红l
作 者 更 正
本刊 ussz年第 y期上发表的论文5关帝山华北落叶松天然林和人工林土壤动物的群落多样
性6 o作者工作单位的署名都应为/山西农业大学林学院 太谷 svs{st0 o刘贤谦为通讯作者 ∀
特此更正 ∀
tu 第 z期 周 洲等 }毛白杨油酸去饱和酶基因 ΠτΦΑ∆2 的克隆与表达分析