全 文 ：第 wu卷 第 t期
u s s y年 t 月
林 业 科 学
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∂²¯1wu o‘²1t
¤±qou s s y
油茶种子 ∞≥×文库构建及主要表达基因的分析
谭晓风t ou 胡芳名t ou 谢禄山t 石明旺t ou 张党权t ou 乌云塔娜t ou
kt1 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 wtsssw ~ u1中南林业科技大学资源与环境学院 长沙 wtssswl
摘 要 } 为研究油茶种子在油脂转化高峰期的基因表达并分离克隆与油脂合成等有关的重要基因 o以油茶优良
无性系湘林 t号和湘林 w号近成熟种子为材料构建 ¦⁄‘„文库 ~随机挑取 u vuz个克隆进行 vχ端测序构建 ∞≥× 文
库 ∀将数据完整并无 ÷ !‘的 t |z|条 ¦⁄‘„序列与 ‘≤…Œ核酸数据库的非冗余序列进行同源性比较 o确认 zyv条
¦⁄‘„序列与核酸数据库中其他物种的 ⁄‘„序列具有很高或较高的同源性 o可确认 uyy种基因 ~有 t uty个克隆序
列为未知功能的基因序列 ∀各类基因表现出不同的表达丰度 o其中贮藏蛋白基因 !与基因表达调控相关的基因 !抗
逆相关基因 !种子成熟和胚胎发育相关的基因等为高丰度表达 o与脂肪酸代谢相关的基因等为中丰度表达 o另外还
有大量的其他基因和未知功能基因在种子中表达 ∀各类基因表达的数量和趋势与种子接近发育成熟阶段相吻合 ∀
关键词 } 油茶 ~¦⁄‘„ ~∞≥× ~文库 ~表达基因
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylst p sswv p sy
收稿日期 }ussw p tu p s| ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助课题/油茶 ∞≥×文库构建及重要基因的分离克隆0 kvsvztt{wl和教育部骨干教师资助课题/油茶¦⁄‘„文
库构建及探针筛选0项目的部分内容 ∀
Χονστρυχτιον οφ ΕΣΤ Λιβραρψ ανδ Αναλψσισ οφ Μαιν Εξπρεσσεδ Γενεσ οφ Χαµελλια ολειφερα Σεεδσ
פ± ÷¬¤²©¨ ±ªtou ‹∏ƒ¤±ª°¬±ªtou ÷¬¨ ∏¶«¤±t ≥«¬¬±ªº¤±ªtou «¤±ª⁄¤±ª´ ∏¤±tou • ∏¼∏± פ±¤tou
kt1 ΚεψΛαβ οφ ΝονpΩοοδ Φορεστ Προδυχτ οφ Στατε Αδµινιστρατιον οφ Φορεστρψ ΧεντραλpΣουτη Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Χηανγσηαwtsssw ~
u1 Χολλεγε οφ Ρεσουρχεσ ανδ Ενϖιρονµεντo ΧεντραλpΣουτη Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Χηανγσηαwtssswl
Αβστραχτ } ײ¬±√¨ ¶·¬ª¤·¨·«¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¤±§·²¶¨³¤µ¤·¨ ¦¯²±¨ ¶º«¬¦«¤µ¨¬°³²µ·¤±·ª¨ ±¨ ¶µ¨ ¤¯·¨§·²²¬¯¶¼±·«¨¶¬¶¤±§¶²²±
§∏µ¬±ª·µ¤±¶©²µ°¬±ª³¨¤®²©¶¨ §¨²¬¯¬± Χαµελλια ολειφεραo¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼ º¤¶¦²±¶·µ∏¦·¨§∏¶¬±ª·«¨ ±¨ ¤µ¯¼ °¤·∏µ¨§¶¨ §¨¶²©·º²
¦¯²±¨ ¶o¬q¨ q ÷pt ¤±§ ÷pw o¤±§u vuz ¦¯²±¨ ¶ º¨ µ¨ µ¤±§²°¯¼ ¶¨¯¨ ¦·¨§©²µ¶¨ ∏´¨±¦¬±ª²± ·«¨ vχp¨ ±§·² ¦²±¶·µ∏¦··«¨ ∞≥×
¬¯¥µ¤µ¼o¤±§t |z| ¶¨ ∏´¨±¦¨¶º«¬¦«¤µ¨ ∏±¤¥µ¬§ª¨§¤±§º¬·«²∏·÷ ²µ‘º¨ µ¨ ³¨µ©²µ°¨ §«²°²¯²ª¼ ¦²°³¤µ¬¶²± º¬·«±∏¦¯¨ ¬¦¤¦¬§
‘• §¤·¤¥¤¶¨ qzyv ¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶º¨ µ¨ «¬ª«¯¼ «²°²¯²ª¬¦¤¯ ·²¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²©²·«¨µ³¯¤±·¶³¨¦¬¨¶¬±§¤·¤¥¤¶¨ ²©‘≤…Œouyy
®¬±§¶²©ª¨ ±¨ ¶«¤√¨ ¥¨ ±¨¬§¨±·¬©¬¨§¤±§t uty ¦¯²±¨ ¶²©¦⁄‘„ º¨ µ¨ ∏±®±²º±©∏±¦·¬²±²©ª¨ ±¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶qŒ±·«¨ ¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼²©
¶¨ §¨¶²© Χq ολειφεραo§¬©©¨µ¨±·ª¨ ±¨ ¶ ¬¨³µ¨¶¶¨§§¬©©¨µ¨±·¤¥∏±§¤±¦¨ q ׫¨ ª¨ ±¨ ¶µ¨ ¤¯·¨§·²¶·²µ¤ª¨ ³µ²·¨¬±o·² ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§
µ¨ª∏¯¤·¬²±o·² µ¨¶¬¶·¤±¦¨ o·² ¶¨ §¨ °¤·∏µ¤·¬²± ¤±§·² °¨¥µ¼² §¨√¨ ²¯³°¨ ±·º¨ µ¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§¬± «¬ª«¤¥∏±§¤±¦¨ o º«¬¯¨ ·«¨ ª¨ ±¨ ¶
µ¨ ¤¯·¨§·² °¨ ·¤¥²¯¬¶° ²©©¤·¼ ¤¦¬§¶ ·¨¦qº¨ µ¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§¬± °¨ §¬∏° ¤¥∏±§¤±¦¨ q׫¨ ²·«¨µª¨ ±¨ ¶µ¨¶³²±¶¬¥¯¨©²µ°¤±¼©µ¤ª°¨ ±·¶
¤±§°¤±¼ ª¨ ±¨ ¶∏±®±²º±©∏±¦·¬²±¶º¨ µ¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§¬±§¬©©¨µ¨±·¨¬·¨±·q׫¨ ±∏°¥¨µ¤±§·µ¨±§¶²© ¬¨³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¶¤µ¨ ¶∏¬·¤¥¯¨©²µ
·«¨ ³«¤¶¨ ²© Χq ολειφερα ¶¨ §¨¶±¨ ¤µ·² °¤·∏µ¤·¬²±q
Κεψ ωορδσ} Χαµελλια ολειφερα~¦⁄‘„ ~∞≥× ~¬¥µ¤µ¼~∞¬³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¶
油茶k Χαµελλια ολειφεραl是我国长江流域及以南各省区的重要木本油料树种k中国科学院植物研究所 o
t|ztl o种仁含油率约为 xx h ∀所产茶油富含 |s h的油酸 !亚油酸等不饱和脂肪酸 o是易消化耐贮藏的优质
食用植物油k何方等 ousswl ∀目前国内外对油茶的研究集中在选优栽培方面 o分子水平的研究集中在种质资
源的 • „°⁄分析k陈永忠等 oussx ~黄永芳等 oussx ~ussw ~张云等 oussvl o而关于种子油脂转化的基因研究尚未
见报道 ∀本文以生产上广泛应用的 u个油茶优良无性系湘林 t号和湘林 w号的近成熟种子混合样品为材
料 o构建了 ¦⁄‘„文库k胡芳名等 ousswl o并对油茶种子在油脂转化高峰期有关基因的表达进行了鉴定 o构建
了 ∞≥×文库 o为开发油茶优质基因资源 o分离克隆相关基因及油脂植物的遗传改良奠定了物质和技术基础 ∀
t 材料与方法
111材料
于 ussv年 |月中旬 o从湖南省林业科学研究院油茶采穗圃采集正处油脂转化高峰期的油茶优良无性系
湘林 t号和湘林 w号的近成熟种子 ∀
112 方法
t1u1t 油茶种子的 °• ‘„提取 总 • ‘„提取参照 ≤«¤±ª等kt||vl的方法 ~°• ‘„的分离纯化采用磁珠法 ∀
t1u1u ¦⁄‘„ 文库构建 °• ‘„ 分离纯化后 o在 ≥∏³¨µ≥¦µ¬³·ŒŒp• × 反转录酶和其他酶的作用下合成第一链
¦⁄‘„和第二链 ¦⁄‘„ ~经双链末端补平 !加接头 !酶切后 o回收 ¦⁄‘„ ~然后将 ¦⁄‘„片段与载体 ³…¯ ∏¨¶¦µ¬³·µ
连接 ~最后将重组 ¦⁄‘„转入大肠杆菌k Εσχηεριχηια χολιl菌株 ⁄‹ts…中 o构建成油茶种子 ¦⁄‘„文库k骆蒙等 o
usst ~钟华等 oussv ~裴凌鹏等 oussv ~张光祥等 oussv ~刘长征等 ot||x ~江昌俊 ot||xl ∀
细菌培养和质粒 ⁄‘„抽提参考5分子克隆实验指南6k萨姆布鲁克等 ot|||l的方法进行 ∀随机挑取 u vuz
个克隆 o委托北京华大公司进行 vχ端单向序列测定 ∀
t1u1v 生物信息学分析 采用 ‘≤…Œ的 …„≥×软件对所测核苷酸序列与 Š¨ ±…¤±®中的非冗余数据库k±²±p
µ¨§∏±§¤±·§¤·¤¥¤¶¨ o‘• l比对 ∀这一数据库是去除 Š¨ ±…¤±®!∞…和 ⁄⁄…中所有相同核酸序列整合后获得的
最为全面的已知基因的数据库 o其中还包括部分基因组的序列 o同时参照 ∞≥× !≥×≥ !Š≥≥等数据库 ∀
u 结果与分析
211 油茶 χ∆ΝΑ文库构建
以油茶优良无性系近成熟种子成功地构建了 ¦⁄‘„文库k胡芳名等 ousswl ∀经检测 o其库容量高达 t1{
≅ tsy o重组率为 |{1t h o插入片段的平均长度约为 t tss ¥³o表明构建的油茶种子 ¦⁄‘„文库具有较高的质
量 o能够满足后续的 ∞≥×文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要 ∀
212 油茶种子表达基因分类
在¦⁄‘„文库中 o随机挑取 u vuz个克隆进行 vχ端单向序列测定 ∀并对数据完整无 ‘!÷ 且序列长于 uss
¥³的 t |z|条序列进行比对 o筛选出了 zyv条 uyy种可确认的基因序列k谭晓风等 oussx ~胡芳名等 oussxl o其
中 ut|条序列与 ‘≤…Œ的 ‘• 库和 §¥∞≥×库中的其他物种 ¦⁄‘„同源性很高k分值 ∴uss o相似性 ∴z{ h o同源
序列长 txs ¥³以上l ouux条序列同源性较高k分值 ∴tss o相似性 ∴z{ h o同源序列长 tss ¥³以上l ovt|条序
列的分值介于 xs ∗ tss之间 o还有 t uty条的同源性较低或为未知名基因序列 ∀对 u vuz个克隆的序列分析
结果见表 t ∀
表 1 油茶种子中主要表达基因分类
Ταβ .1 ∆ιστριβυτιον οφ µ αιν εξπρεσσεδ σεθυενχεσιν Χ . ολειφερα σεεδσ
基因类别 ≥²µ·¶²©ª¨ ±¨ 条数‘∏°¥¨µ 基因类别 ≥²µ·¶²©ª¨ ±¨
条数
‘∏°¥¨µ
基因表达调控基因
Š¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§µ¨ª∏¯¤·¬²± ª¨ ±¨ ¶ tuu
抗性基因 • ¶¨¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ¶ ts{
油体蛋白基因 ’¬¯ ¥²§¼ ³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ¶ tsx
贮藏蛋白基因 ≥·²µ¤ª¨ ³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ¶ |z
胚胎发育 !种子成熟基因
∞°¥µ¼² §¨ √¨ ²¯³° ±¨·¤±§¶¨ §¨ °¤·∏µ¤·¬²± ª¨ ±¨ ¶ x{
氨基酸合成基因 „°¬±²¤¦¬§¶¼±·«¨¶¬¶ª¨ ±¨ ¶ u|
脂肪酸合成基因 ƒ¤·¼ ¤¦¬§¶¼±·«¨¶¬¶ª¨ ±¨ ¶ t{
三羧酸循环与氧化磷酸化基因
×≤„ ¤±§²¬¬§¤·¬√¨ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ª¨ ±¨ ¶ tu
蛋白质降解基因
°µ²·¨¬± §¬¶¤¶¶¨°¥¯¨ª¨ ±¨ ¶ ts
叶绿体基因 ≤«¯²µ²³¯¤¶·ª¨ ±¨ ¶ |
信号转导基因 ≥¬ª±¤¯ ·µ¤±¶§∏¦·¬²± ª¨ ±¨ ¶ z
维生素合成基因
∂¬·¤°¬± ¶¼±·«¨¶¬¶ª¨ ±¨ ¶ y
蜡质基因 • ¤¬¼ ª¨ ±¨ t
其他基因 ’·«¨µª¨ ±¨ ¶ t{t
未知功能基因 ˜±®±²º±©∏±¦·¬²± ª¨ ±¨ ¶ t uty
不同类型的基因其
表达丰度不同 o其中贮
藏蛋白相关基因 !基因
表达相关基因 !抗性相
关基因 !与发育相关的
基因在种子中有高丰度
表达 ∀脂肪酸合成相关
的基因属中丰度表达 ∀
有的基因只测到一个序
列 o属低丰度表达 ∀油
茶油脂转化高峰期与脂
肪酸合成有关的代谢酶
基因有 t{条序列 o贮藏蛋白 !油体蛋白基因有 usu条序列 o抗病 !抗逆性基因有 ts{条序列等 o未知功能的基
因序列达 t uty条 ∀
213 与脂肪酸合成相关的基因
在油脂转化高峰期 o检测到与脂肪酸合成代谢相关的酶基因共有 |种 o分别为硬脂酰 „≤°脱饱和酶
k≥„⁄l基因 !油酸脱饱和酶 ƒ„⁄u基因 !ƒ„⁄{基因 !脂酰 „≤°硫酯酶kƒ¤·…tl基因 !„≤°基因 !丙酰 ≤²„合成酶
基因 !烯酰 ≤²„水化酶基因 !乙酰 ≤²„转乙酰基酶基因 !长链脂肪酸浓缩酶基因等 ∀
长链饱和脂肪酸是由乙酰 ≤²„在脂肪酸合成酶kƒ„≥l系作用下合成的k卢善发 ousssl ∀该酶系以含泛
酰巯基乙胺残基的酰基载体蛋白k¤¦¼¯ ¦¤µµ¬¨µ³µ²·¨¬±o„≤°l作为脂酰基载体 ∀植物体内存在多个 „≤°同工酶
ww 林 业 科 学 wu卷
(Ηεατη ετ αλqot||xl o如大麦k Ηορδευµ ϖυλγαρεl有 v个 o分别为 „≤° p ´ !„≤° p µ和 „≤° p ¶ ∀ „≤°含有两类
≥‹基团 o分别由泛酰基巯基乙胺及半胱氨酰k≤¼¶l残基提供 ∀软脂酰 „≤°水解后生成软脂酸ktyΒsl o软脂酸
是长链饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸的前体 o在叶绿体中合成后运到胞质中 o在内质网和线粒体内的脂肪酸延
长体系作用下 o分别与丙二酰 ≤²„和乙酰 ≤²„的残基连接而使碳链延长 o生成硬脂酸kt{Βsl或更长碳链的饱
和脂肪酸 ∀在油茶种子 ¦⁄‘„文库中测到相关基因序列 t条kµ½²·¶s ) sszsyu1¼t1¶¦©l o为低丰度表达 ∀与木麻
黄k Χασυαρινα γλαυχαl的 „≤°序列比对分值为 tzs o期望值 u¨p v| o相似性系数 {z h ktxuΠtzwl o具有很高的同
源性 ~可以认为所测的基因序列为油茶 „≤°基因序列 ∀
硬脂酰 p „≤°脱饱和酶k¶·¨¤µ²¼tp¤¦³§¨¶¤·∏µ¤¶¨ o≥„⁄l的主要作用是将硬脂酸脱氢后形成油酸kt{Βtl o是
不饱和脂肪酸形成的关键酶之一k≠∏®¤º¤ ετ αλqot||yl ∀油茶 ¦⁄‘„文库测序获得了 v条硬脂酰 „≤°脱饱和
酶基因相关序列kµ½²·¶s ) ssst{x1¼t1¶¦©!µ½²·¶s ) ssswy{1¼t1¶¦©!µ½²·¶s ) sswwyt1¼t1¶¦©l o属中丰度表达 ∀以µ½²·¶s )
sswwyt1¼t1¶¦©序列比对分析的结果 o与蓖麻k Ριχινυσ χοµ µυνισl的 ≥„⁄基因序列最为接近 o分值 v{v o期望值
¨p tsv o相似性 {w h kwt{Πw|vl ∀该序列经 u次测序 o确定为油茶种子的 ≥„⁄基因序列 ∀
油酸脱饱和酶kƒ„⁄ul是植物产生多不饱和脂肪酸的关键酶 oƒ„⁄u是专一的加氧酶k²¬¼ª¨ ±¤¶¨l系统 o它
存在于内质网膜上 o以 t p酰基 p u p油酰基 p ¶± p甘油 p v p磷酸胆碱为底物 o在需氧条件下 o以 ‘„⁄°n为
辅酶生成多不饱和脂肪酸 p亚油酸k¦¬¶| otu p二烯酸l和亚麻酸k¦¬¶| otu otx p三烯酸l o该基因已经在拟南
芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl !落花生kΑραχηισ ηψπογαεαl !油菜k Βρασσιχσ ναπυσl等植物中克隆出来k≥²°¨ µ√¬¯¯¨ ετ αλqo
t||y ~• ¤§¤ ετ αλqot||u ~פ¶¤®¤ ετ αλqot||yl ∀油茶¦⁄‘„序列测定中获得 v条油酸脱饱和酶相关基因序列 o
与 ƒ„⁄uΞpy脂肪酸脱饱和酶基因相关序列kµ½²·¶s ) sst|vw1¼t1¶¦©lt 条 !ƒ„⁄{Ξpv 脱饱和酶基因相关序列
kµ½²·¶s ) sstzw|1¼t1¶¦©lt条 !ƒ„⁄u ∆ptu脱饱和酶基因相关序列 kµ½²·¶s ) sszvwu1¼t1¶¦©lt条 ∀其中 ƒ„⁄uΞpy脂
肪酸脱饱和酶基因与芝麻kΣεσαµυµ ινδιχυµlƒ„⁄u的序列同源性很高 o分值为 tzy o期望值为 w¨p wt o序列相
似性 {x h kt{{Πuutl ∀该序列经 u次测序确认为油茶 ƒ„⁄u基因序列 ∀
脂酰 „≤°硫酯酶kƒ¤·…tl是催化脂肪酸合成的关键酶之一 o主要作用是终止脂肪酸链的延长k‹ ¤¨·« ετ
αλqot||xl ∀脂酰 „≤°硫酯酶基因序列的获得对研究油茶脂肪酸合成 ƒ„≥循环的终止 o会起到积极的作用 ∀
所测油茶 ¦⁄‘„序列中共获得 v条与 ƒ¤·…t基因相关序列kµ½²·¶s ) ssstxs1¼t1¶¦©oµ½²·¶s ) sssws|1¼t1¶¦©oµ½²·¶s )
sszsxy1 ¼t1¶¦©l o属中丰度表达 ∀ …„≥× 比对结果表明 o与拟南芥等植物的 ƒ¤·…t基因的比对最好分值为
tu{ o期望值 ¨p uy o同源性 {t h ∀所测序列是否为脂酰 „≤°硫酯酶基因序列需进一步测定 ∀
乙酰 ≤²„转乙酰基酶k¤¦¨·¼¯ ≤²„ ¤¦¨·¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨l催化 u分子乙酰 ≤²„转化成乙酰乙酰 ≤²„ o是一种硫解
酶 o参与类异戊二烯活体的合成k⁄¤±¬¨¯ ετ αλqot||tl o是类固醇合成的启动步骤 ∀在油茶 ¦⁄‘„中获得 u条
序列 kµ½²·¶s ) sswwtu1¼t1¶¦©oµ½²·¶s ) ssytxx1¼t1¶¦©l o对后 t 条序列进行 …„≥× 比对 o与巴西橡胶 k Ηεϖεα
βρασιλιενσισl的乙酰 ≤²„转乙酰基酶基因的相似性 {{ h kws{Πwytl o分值 w|w o期望值 ¨p tvy o相似性很高 o可确
认所测序列为油茶种子乙酰 ≤²„转乙酰基酶基因序列 ∀
长链脂肪酸缩合酶k√¨ µ¼p¯²±ªp¦«¤¬±©¤·¼¤¦¬§¦²±§¨±¶¬±ª ±¨½¼°¨ l是涉及长链脂肪酸生物合成的微粒体脂肪
酸延长酶中 w种活性酶的第一种 o是决定长链脂肪酸的酰基链长度的延长酶中的主要活性酶k¬¯¯¤µετ αλqo
t||zl ∀测得油茶 ¦⁄‘„序列 t条kµ½²·¶s ) ssuzuw1¼t1¶¦©l o属低丰度表达 ∀ …„≥×比对结果 o与拟南芥长链脂
肪酸缩合酶基因的相似性 {t h kut|Πuzsl o分值 tuv o期望值 x¨p ux o可认为所测序列为长链脂肪酸缩合酶基
因序列 ∀长链脂肪酸缩合酶具有种质特异性 o其表达和特异性控制长链脂肪酸的生物合成 ∀该酶基因的获
得对研究油茶长链脂肪酸的合成 o将会起到重要的作用 ∀
214 蜡质基因
蜡质基因是编码直链淀粉合成酶的关键基因 o与种子中淀粉含量及直链淀粉与支链淀粉的比例有很大
关系k耿俊丽等 oussxl o也与长链脂肪酸和高级醇的形成有关 ∀在油茶种子 ¦⁄‘„文库中测序得到 t条蜡质
基因序列kµ½²·¶s ) ssswxs1¼t1 ¶¦©l o属低丰度表达 ∀经与 Š¨ ±…¤±®中核酸库比对 o与金缕梅k Ηαµαµελισϖερναλισl
等植物的蜡质基因比对分值为 ts| o期望值 v¨p ut o同源性 {| h k{xΠ|xl ∀由于比对分值较低 o所得序列需做
进一步研究 o以确认是否为蜡质基因 ∀
215 油体蛋白基因
植物种子中的油脂主要贮藏在亚细胞微粒形式的油体中 ∀油体内部为液态的三酰甘油酯 o外面覆盖着
xw 第 t期 谭晓风等 }油茶种子 ∞≥×文库构建及主要表达基因的分析
单层的磷脂分子和镶嵌蛋白质构成的半单位膜 ∀膜中镶嵌的蛋白为油体相关蛋白 o有 ²¯ ²¨¶¬± !¦¤¯ ²¨¶¬± !
¶·¨µ²¯ ²¨¶¬±等 k仇键等 oussxl ∀油茶种子 ¦⁄‘„ 文库中测得油茶油质蛋白 k²¯ ²¨¶¬±l基因序列 kµ½²·¶s )
ssx|uz1¼t1¶¦©oµ½²·¶s ) ssvxxu1 ¼t1¶¦©等l{w条 o脂体膜蛋白k ¬¯³¬§¥²§¼ °¨ °¥µ¤±¨ ³µ²·¨¬±l基因kµ½²·¶s ) ssw|sx1
¼t1¶¦©等ltz条 o油体钙蛋白k¦¤¯ ²¨¶¬±l v条kµ½²·¶s ) sstu{t1¼t1¶¦©等l及油体甾醇蛋白k¶·¨µ²¯ ²¨¶¬±p…lt条等 ∀其
中油质蛋白与芝麻油质蛋白相似性最高 o比对分值 tvx o期望值 ¨p u{ o相似性系数 {w h ktxuΠt{sl ~脂体膜蛋
白与胡萝卜k ∆αυχυσχαρτα √¤µqσατιϖαl的比对分值为 tut o期望值 u¨p uw o相似性系数 {z h kts|Πtuxl ~油体钙蛋
白与芝麻的比对分值为 x{1s o期望值 u¨p sx o相似性系数 z| h ktt|Πtw|l ~油体甾醇蛋白与芝麻的比对分值
tv| o期望值 ¨p vs o相似性系数 {s h kuztΠvv{l ∀以上高分值序列已进行 u次测序 o并确认所得序列为相应的
基因序列 ∀
216 贮藏蛋白基因
不同类型的植物种子 o贮藏物的种类和数量有所不同 o贮藏物主要作为供应种子发芽及幼苗生长时所需
养分及能量来源 ∀测序获得油茶贮藏蛋白kΒpª¯²¥∏¯¬± …l基因相关序列kµ½²·¶s ) ssswuw1¼t1¶¦©等lww条 ~豆球蛋
白k¯ ª¨∏°¬±l基因相关序列kµ½²·¶s ) ssy|uy1¼t1¶¦©等lvy条 ~清蛋白k¤¯¥∏°¬±ltx条kµ½²·¶s ) ssstwx1¼t1¶¦©等l ~谷
蛋白kª¯∏·¨¯¬±lu条kµ½²·¶s ) sstvvw1¼t1¶¦©oµ½²·¶s ) ssuwxv1¼t1¶¦©l ∀ …„≥× 的结果表明 o油茶种子的贮藏蛋白基
因与棉花的 ¥¨·¤pª¯²¥∏¯¬± …基因的匹配分值都在 xs分以上 o期望值  ¨p w o相似性系数 {y h kxvΠytl ∀油茶
种子中的豆球蛋白基因与紫苏k Περιλλαφρυτεσχενσl !棉花 !欧洲栎k Θυερχυσροβυρl等植物的 ¯¨ ª∏°¬± …基因的匹配
分值都在 ys分以上 o期望值  ¨p { o相似性系数 {| h kxvΠx|l ∀油茶种子中清蛋白的基因序列与 Βερτηολλετια
εξχελσια的比对分值为 xu1s o期望值 s1ssu o相似性 tss h kuyΠuyl ∀比对结果 o总体分值较低 o但局部相似性高 o
这与贮藏蛋白是小分子蛋白有关 o贮藏蛋白的两端为高变区而中心为较小的保守区 ∀
普通油茶种子油脂含量为 us h ∗ u{ h o种仁油脂含量 ws h ∗ x| h o富含不饱和脂肪酸和一定数量的蛋
白质 o为营养良好的蛋白质及油脂来源 o油茶树被称为东方油橄榄 o茶油可和橄榄油相媲美kפ± ετ αλqo
usswl o其中贮藏蛋白基因中豆球蛋白是其主要蛋白之一kפ± ετ αλqoussxl ∀在植物种子中贮藏蛋白质及油
脂的细胞器分别为蛋白质体k³µ²·¨¬± ¥²§¼l和油体k²¬¯ ¥²§¼l ∀油茶种子 ∞≥×中贮藏蛋白质基因 !油脂贮藏基
因的表达都是极高丰度的 o同时检测到与脂肪运输相关的脂质转移蛋白基因 kµ½²·¶s ) ssvvt{1¼t1¶¦©l ∀这一
结果与油茶种子正处油脂转化高峰期的生理特征是相吻合的 ∀对这些基因进行研究 o将对油茶种子脂类物
质的产生 !储存等过程有更深入的诠解 ∀
217 基因表达调控相关的基因
核糖体是蛋白质合成的场所 o真核生物的核糖体由 ys≥的大亚基和 ws≥的小亚基组成 ∀ws≥的小亚基由
t{≥的µ• ‘„分子和 vs种不同的核糖体蛋白质组成 oys≥大亚基由各一分子的 x≥ µ• ‘„ ox1{≥ µ• ‘„ ou{≥
µ• ‘„和约 wx种蛋白质组成 ∀核糖体常常分布在细胞蛋白质合成旺盛的区域 o其数量和蛋白质合成强度有
关 ∀测序获得了 uy条核糖体结构基因如 ys≥大亚基基因序列kµ½²·¶s ) ssx|y{1 ¼t1¶¦©等l !ws≥小亚基基因序
列kµ½²·¶s ) sstsux1¼t1¶¦©等l o属高丰度表达 ∀经比对 o大亚基基因序列与黄瓜k Χυχυµισσατιϖυσl的比对分值为
vux o期望值为 y1ss¨p {y o相似性系数 {v h kwtzΠxssl ~小亚基基因序列与鹰嘴豆k Χιχερ αριετινυµl的比对分值
达 vs| o期望值为 v1ss¨p {t o相似性系数 {x h kvtxΠvy{l ∀可确定所得序列为相应的基因序列 ∀
转录因子是基因表达必需的元件 o对基因的表达起调控作用 ∀所测序列中有 „⁄≥盒的转录因子基因
kµ½²·¶s ) ssztz{1¼t1¶¦©l o„°u包含域转录因子基因kµ½²·¶s ) ssvvvt1¼t1¶¦©等l o⁄• ∞捆绑转录因子基因kµ½²·¶s )
ssstwv1¼t1¶¦©l o„Š p基序捆绑蛋白基因kµ½²·¶s ) sswuvx1¼t1¶¦©l !ƒp¥²¬家族蛋白基因kµ½²·¶s ) sss|ty1¼t1¶¦©l及
翻译起始因子基因kµ½²·¶s ) sst|wt1¼t1¶¦©等l o这些因子对基因的表达起重要作用 ∀
218 发育有关基因
油茶种子的生长 !发育与成熟过程受多种基因的调节控制 ∀在油茶种子¦⁄‘„文库中获得 ty种 x{条与
油茶种子生长 !胚胎发育及成熟相关的基因序列 o这些序列与核酸数据库中其他物种相关序列有很高或较高
的同源性 ∀其中脱落酸应答蛋白k¤¥¶¦¬¶¬¦¤¦¬§µ¨¶³²±¶¨ ³µ²·¨¬±l基因序列 uu 条 o成熟控制蛋白kµ¬³¨ ±¬±ª
µ¨ª∏¯¤·¨§³µ²·¨¬±l和翻译控制肿瘤蛋白k·µ¤±¶¯¤·¬²±¤¯ ¼¯ ¦²±·µ²¯¯¨ §·∏°²µ³µ²·¨¬±o×≤×°l基因序列各 y条 o胚胎特化
蛋白k °¨¥µ¼²p¶³¨¦¬©¬¦³µ²·¨¬±l和乙烯应答因子包含域蛋白k„°uΠ∞• ƒp§²°¤¬± ³µ²·¨¬±l基因序列各 w条 o为高丰度
yw 林 业 科 学 wu卷
表达 ~乙烯应答因子k ·¨«¼¯ ±¨¨ µ¨¶³²±¶¨ ©¤¦·²µl基因序列 v条 o种子成熟蛋白k¶¨ §¨ °¤·∏µ¤·¬²± ³µ²·¨¬±l !细胞分化
蛋白k¦¨¯¯ §¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ³µ²·¨¬±l及脱水素k§¨«¼§µ¬±l基因序列各 u 条 o属中等丰度表达 ~而成熟相关蛋白
kµ¬³¨ ±¬±ªpµ¨ ¤¯·¨§³µ²·¨¬±l !胚珠发育蛋白k²√∏¯¨§¨ √¨ ²¯³°¨ ±·³µ²·¨¬±l !生长控制因子kªµ²º·«pµ¨ª∏¯¤·¬±ª©¤¦·²µl !休眠
相关蛋白k§²µ°¤±¦¼ µ¨ ¤¯·¨§³µ²·¨¬±l !衰老相关蛋白k¶¨±¨ ¶¦¨±¦¨p¤¶¶²¦¬¤·¨§³∏·¤·¬√¨ ³µ²·¨¬±l和脱水应答蛋白等基
因序列各测到 t条 o属低丰度表达k谭晓风等 oussxl ∀
以上所测 ¦⁄‘„序列分析 o基本反映出油茶种子与胚胎发育和种子成熟相关基因的阶段性表达情况 o油
茶种子的发育已进入到种子成熟和衰老状态 o与成熟和衰老关系极为密切的植物激素脱落酸 !乙烯进入快速
形成期 o脱水素基因及与衰老和休眠相关的基因也已表达 ∀相关分析另文发表 ∀
219 抗逆相关基因
植物体内存在着抵御外界不良环境 !外源病虫害等生物侵袭的抗性基因 o它能加强和改善植物自身的防
御系统 o有效地抵御病虫害的侵袭 o增强对逆境的适应能力 ∀在油茶种子¦⁄‘„文库中获得 uv种 ts{条与油
茶种子抗性相关的基因序列 o其中核糖体灭活蛋白kµ¬¥²¶²°¨ p¬±¤¦·¬√¤·¬±ª³µ²·¨¬±l基因 vx条 !类金属硫蛋白
k°¨ ·¤¯ ²¯·«¬²±¨ ¬±p¯¬®¨ ³µ²·¨¬±l 基因 t{条 !过氧化物酶 k³¨µ²¬¬§¤¶¨l 基因 tt条 !热激蛋白 k«¨¤·¶«²¦® ³µ²·¨¬±l 基
因 |条 !查尔酮合酶 k¦«¤¯¦²±¨ ¶¼±·«¤¶¨l基因 x条 o属高丰度表达 ~铜锌超氧化物歧化酶 k¦²³³¨µΠ½¬±¦p¶∏³¨µ²¬¬§¨
§¬¶°∏·¤¶¨l 基因 !植物外源凝集素k¯ ¦¨·¬±¶l基因及富含甘氨酸蛋白kª¯¼¦¬±¨ µ¬¦«³µ²·¨¬±l基因序列各 v条 o过氧
化氢酶k¦¤·¤¯¤¶¨l基因 !防御蛋白k§¨©¨ ±¶¬± ³µ²·¨¬± tl基因 !抗性基因簇kµ¨¶¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ¦¯∏¶·¨µl !木质素蛋白
k¬¼¯²ª¨ ± ³µ²·¨¬±l基因 !环氧化物水解酶k ³¨²¬¬§¨ «¼§µ²¯¤¶¨l基因序列各 u条 o属中等丰度表达 ~另有 {种抗性基
因二氢黄酮异构酶 kµ¤³¬§¦¼¦¯¬±ª §¬«¼§µ²©¯¤√²±²±¨ ¬¶²°¨ µ¤¶¨ l 基因 !非细胞自主的同源热激蛋白k±²±p¦¨¯¯
¤∏·²±²°²∏¶«¨¤·¶«²¦®¦²ª±¤·¨ ³µ²·¨¬± √¬µ∏¶l !抗病毒基因位点kµ¨¶¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ²¯¦∏¶l !类黄酮转葡萄糖基酶
k¬¶²©¯¤√²±²¬§ª¯∏¦²¶¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨l 基因 !黄酮醇合酶 k©¯¤√²±²¯ ¶¼±·«¤¶¨l 基因 !耐盐蛋白基因k¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ³µ²·¨¬±
tl !伸展蛋白基因k ¬¨·¨±¶¬±l及苯丙氨酸氨基裂解酶 k³«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤p¯¼¤¶¨l基因各 t条序列 o属低丰度
表达 ∀油茶种子中大量抗性基因的表达与其生理过程及受到外源生物的侵袭有密切的关系 ∀
2110 其他表达基因
油茶种子 ¦⁄‘„文库中还有氨基酸合成k¤°¬±²¤¦¬§¶¼±·«¨¶¬¶l基因序列 u|条 o重金属解毒蛋白基因序列
t{条 o三羧酸循环与氧化磷酸化k×≤„ ¤±§ ²¬¬§¤·¬√¨ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²±l基因序列 tu 条 o蛋白质降解k³µ²·¨¬±
§¬¶¤¶¶¨°¥¯ l¨基因 ts条 o叶绿体k¦«¯²µ²³¯¤¶·l基因序列 |条 o信号转导k¶¬ª±¤¯ ·µ¤±¶§∏¦·¬²±l基因序列 z条 o维生素
合成k√¬·¤°¬±¶¼±·«¨¶¬¶l基因序列 y条 o及参与肽链折叠的蛋白因子基因 !肌动蛋白基因 !„≤≤¤¶¨ 基因 !• ≤ Œ×
基因 !׌װ基因 !„• ƒ !˜…≤基因 !钙调素基因等及许多功能未知的基因序列 o在此不一一详述 ∀
v 结论与讨论
不同植物种子合成的油脂种类和数量差异很大 ∀油茶种子能合成大量有利于人类健康的不饱和脂肪酸
k雷治国等 oussvl ∀为开发油茶的优质基因资源 o克隆相关基因并进行遗传改良 o作者利用油茶近成熟种子
为材料建立 ¦⁄‘„文库 o随机对其中的 u vuz个克隆进行测序 o建立了油茶近成熟种子的 ∞≥×文库 ∀
研究发现油茶近成熟的种子中脂肪酸合成代谢较强 o测序获得了 ≥„⁄基因 !ƒ„⁄u基因 !ƒ„⁄{基因 !„≤°
基因 !ƒ¤·…t基因等 |种 t{条序列 ∀基本上反映出近成熟油茶种子脂肪酸合成代谢的主要基因表达情况 ∀
但乙酰 ≤²„羧化酶等关键酶未找到相应的基因序列 o需做进一步研究 ∀
油体蛋白基因 !豆球蛋白基因 !贮藏蛋白基因的 °• ‘„序列数约占总 °• ‘„序列数的 ts1x h o是主要的
表达基因 ∀反映油茶种子正处油脂转化高峰期 ∀在油茶种子中发现有农作物水稻k Ορψζα σατιϖαl等种子胚中
的谷蛋白基因序列 o但没有发现醇溶蛋白基因序列 ∀油茶种子中存在多种核糖体蛋白基因 !核糖体 • ‘„基
因及其他与蛋白翻译有关的基因 o说明在油茶种子的油脂转化过程中同时有大量蛋白质的合成 o而蛋白质降
解基因的表达 o可能与部分蛋白质转化成油脂有关 ∀呼吸作用相关基因的表达与油茶种子正处油脂转化高
峰期相适应 o通过呼吸代谢为油脂合成提供原料 ∀与发育和成熟相关的基因大量表达 o说明油茶种子发育到
这一阶段 o正在为种子成熟进入休眠做准备 ∀
油茶种子中核糖体灭活蛋白基因 !金属硫蛋白基因 !过氧化物酶基因 !热激蛋白基因 !查尔酮合酶基因 !
抗病毒基因 !过氧化物酶基因 !铜锌超氧化物歧化酶基因 !外源凝集素基因 !防御蛋白基因 !干旱应答蛋白基
zw 第 t期 谭晓风等 }油茶种子 ∞≥×文库构建及主要表达基因的分析
因 !胁迫相关蛋白基因 !耐盐蛋白及热激蛋白基因等耐环境胁迫基因均有表达 ∀这与油茶种子具有较强的抗
病和耐环境胁迫的能力相适应 ∀
油茶近成熟种子中 o还有一些新基因特异性表达 o但大多数呈中低丰度状态 o如噻唑生物合成酶基因 ∀
多数只测到 t 条序列 o如 •¤¶p 相关蛋白基因 !°µ²©¬¯¬±基因 !≥¼±³·²¥µ¨√¬±相关蛋白基因 !ƒ¬¥µ¬¯¯¤µ¬±基因 !
• °¨²µ¬±基因等 ∀上述基因序列的获得 o为以后油茶油脂合成代谢过程及各种关键酶基因全序列的进一步研
究 o奠定了物质和技术基础 ∀
参 考 文 献
陈永忠 o张智俊 o谭晓风 qussx q油茶优良无性系的 • „°⁄分子鉴别 q中南林学院学报 ouxkwl }ww p w|
黄永芳 o陈锡沐 o雷治国 o等 qussw q油茶种质资源 • „°⁄分析 Œ}⁄‘„提取和 °≤• 扩增条件建立 q河南农业科学 oktul }uv p uy
黄永芳 o吴雪辉 o陈锡沐 o等 qussx q引物对油菜种质资源聚类分析结果的影响 q河南农业科学 oktsl }v| p wv
何 方 o胡芳名 qussw q经济林栽培学 qu版 q北京 }中国林业出版社 ouz{ p uz|
胡芳名 o谭晓风 o石明旺 o等 qussw q油茶种子 ¦⁄‘„文库构建 q中南林学院学报 ouwkxl }t p w
胡芳名 o谭晓风 o仇 键 o等 qussx q油茶种子中主要表达的储藏蛋白相关基因 q中南林学院学报 ouxkwl }uw p uy
耿俊丽 o胡芳名 o张党权 qussx q蜡质基因研究进展 q中南林学院学报 ouwkxl }tst p tsw
江昌俊 qt||x q欧洲油菜花粉 ¦⁄‘„文库的构建 q安徽农业科学 ouvkvl }w p {
雷治国 o黄永芳 o何会蓉 qussv q油茶及其种质资源研究进展 q经济林研究 outkwl }tuv p tux
刘长征 o张正舫 o张国珍 o等 qt||x q玉米叶片 ¦⁄‘„文库构建及 ≤¤«基因克隆 q山东农业大学学报 ouykwl }wwz p wxu
骆 蒙 o贾继增 qusst q植物基因组表达序列标签k∞≥×l计划研究进展 q生物化学与生物物理进展 ou{kwl }w|w p w|z
卢善发 qusss q植物脂肪酸的生物合成与基因工程 q植物学通报 otzkyl }w{t p w|t
裴凌鹏 o李 伟 o黄勤妮 qussv q∞≥×在植物代谢研究中的应用 q北京联合大学学报 }自然科学版 otz kvl }{v p {y
仇 键 o谭晓风 qussx q植物种子油体及相关蛋白研究综述 q中南林学院学报 ouwkxl }|y p tss
萨姆布鲁克 o拉塞尔 ⁄ • qt||| q分子克隆实验指南 q黄培堂 o等译 qu版 q北京 }科学出版社 ou p ww|
谭晓风 o胡芳名 o谢禄山 o等 qussx q油茶近成熟种子表达的发育相关基因及其分析 q中南林学院学报 ouxkwl }tz p uv
张光祥 o马正强 qussv q目的全长 ¦⁄‘„合成及克隆技术进展 q生物技术通报 otwkxl }t p x
张 云 o黄儒珠 o刘大林 o等 qussv q油茶随机扩增多态 ⁄‘„条件的研究 q福建林业科技 ovskul }{ p tt
钟 华 o谢婷婷 o刘中来 qussv q∞≥×的应用现状与前景 q生物技术 otvktl }vu p vv
中国科学院植物研究所 qt|zt q中国高等植物图鉴 }u册 q北京 }科学出版社 o{xy
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°¨ °¥µ¤±¨ ¬¯³¬§¶¬± ªµ²º·«µ¨¶³¬µ¤·¬²± ¤±§³«²·²¶¼±·«¨¶¬¶q∞…’otxkuvl }ywty p ywux
• ¤§¤ ‹ oŠ²°¥²¶ o≥¤®¤°²·² × oετ αλqt||u1 Š¨ ±¨ ·¬¦°¤±¬³∏¯¤·¬²±²©·«¨ ¬¨·¨±·²©§¨¶¤·∏µ¤·¬²±²©©¤·¼¤¦¬§¬± ° °¨¥µ¤±¨ ¬¯³¬§¶¬±·«¨ Χψανοβαχτεριυµ σψνεχοχψστ
¬¶°≤≤y{sv1 °¯ ¤±·≤¨¯¯ °«¼¶¬²¯ ovvkxl }xvx p xws
≠∏®¤º¤ ≠ oפ®¤¬º¤ƒ o≥«²­¬® Žoετ αλqt||y1 ≥·µ∏¦·∏µ¨ ¤±§ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©·º² ¶¨ §¨p¶³¨¦¬©¬¦¦⁄‘„ ±¨¦²§¬±ª¶·¨¤µ²¼¯p¤¦¼¯¦¤µµ¬¨µ³µ²·¨¬± §¨¶¤·∏µ¤¶¨ ©µ²° ¶¨¶¤°¨o
Σεσαµυµ ινδιχυµ q°¯ ¤±·≤¨¯¯ °«¼¶¬ovzkul }ust p usx
k责任编辑 徐 红l
{w 林 业 科 学 wu卷