全 文 ：第 ws卷 第 x期
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林 业 科 学
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华山松大小蠹和共生真菌分泌酶组成分析
陈 辉 唐 明 朱长俊 胡景江
k西北农林科技大学 杨凌 ztutssl
摘 要 } 对华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白和酶类组成分析的结果表明 o华山松大小蠹消化道和共生
真菌胞外均可分泌多种酶类 o其中华山松大小蠹消化道具自身分泌纤维素酶 !酯酶 !蛋白酶和淀粉酶的能力 o但不
具分泌漆酶等木质素分解酶的能力 o因此 o其虽然可以直接利用寄主华山松韧皮部和木质部边材组织内的纤维素 !
淀粉 !多糖 !酯类和蛋白等营养物质 o但不能分解利用木质素类营养 ∀而共生真菌除具有胞外分泌纤维素酶 !酯酶 !
蛋白酶和淀粉酶的能力外 o还能够在寄主华山松组织内木质素的诱导下分泌漆酶 o以充分利用华山松韧皮部和木
质部内纤维素 !木质素 !淀粉和脂类物质 ∀此外 o华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外分泌的纤维素酶 !酯酶 !淀粉
酶和蛋白酶还存在结构和营养利用方面的差异 ∀
关键词 } 华山松大小蠹 o共生真菌 o消化道 o胞外酶
中图分类号 }≥zyv1v{ 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlsx p stuv p sw
收稿日期 }ussu p ts p ux ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kvsszsyu{l ∀
Τηε Ενζψµεσιν τηε Σεχρετιονσ οφ ∆ενδροχτονυσ αρµανδι kΣχολψτιδαεl
ανδ Τηειρ Σψµ βιοτιχ Φυνγυσ οφ Λεπτογραπηιυµ θινλινγενσισ
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k Νορτηωεστ Σχι2Τεχη Υνιϖερσιτψοφ Αγριχυλτυρε ανδ Φορεστρψ Ψανγλινγztutssl
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Κεψ ωορδσ} ∆ενδροχτονυσ αρµανδι o≥¼°¥¬²·¬¦©∏±ª∏¶oŠ∏·o∞¬·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ ±¨½¼°¨
华山松大小蠹k ∆ενδροχτονυσ αρµανδιl是秦岭巴山林区优质针叶树种华山松的毁灭性害虫 o在入侵 !定居
和繁殖的整个生命过程中不仅需要共生真菌的参与 o以有效克服健康华山松组织结构和生理生化等多元抗
性 o而且与共生真菌在生理生化代谢上具有相互的协调性 o使华山松大小蠹和共生真菌能够充分地利用寄主
树木组织中各种营养物质k陈辉等 ousss ~唐明等 ot|||l ∀ Šµ¤«¤°kt|yzl认为小蠹虫与真菌的共生是小蠹虫与
真菌充分利用森林生态系统内寄主树木纤维素 !半纤维素和木质素等营养物质的适应性进化结果 ∀ ≥·¤µ®
kt|yxl !Šµ¤«¤°kt|yzl !• «¬·±¨ ¼kt|{ul !°¤¬±¨ kt||zl和陈辉等kusssl的研究表明 o小蠹虫 !共生真菌和寄主树木
间相互适应而进行的协同进化 o不仅表现在小蠹虫和真菌的形态学 !生物学 !生理学 !生态学和行为学等方
面 o而且表现在小蠹虫与真菌的生理生化和代谢方面 ∀本文通过对华山松大小蠹k ∆ενδροχτονυσ αρµανδιl与主
要真菌间酶分泌的差异性研究 o揭示华山松大小蠹与真菌营养利用的相互依赖性及互惠共生的机制 ∀
t 材料与方法
111 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白及酶的提取
将饥饿 w{ «后的华山松大小蠹成虫 o用 zx h乙醇进行表面消毒 o无菌水冲洗数次后 o取出其消化道 o并
按每个消化道加入 ws ª#pt蔗糖提取液 s1x °o冰浴下匀浆 o低温kw ε l离心 ts °¬±ktu sss µ#°¬±ptl o取上清
液作为成虫消化道测试蛋白和酶源k蒋书楠 ot||yl ∀
将华山松大小蠹共生真菌 Λεπτογραπηιυµ θινλινγενσισ分别接种于纤维素诱导液体培养基 !漆酶诱导液体
培养基和麦芽汁液体培养基k分别记作 „ o…o≤l中 oux ε 培养 { §后用尼龙布过滤 o滤液置于高速离心机离心
ts °¬±ktu sss µ#°¬±ptl ∀取上清液作为共生真菌胞外测试蛋白和酶源k高培基等 ot|{x ~郭杰炎等 ot|{y ~黄镇
亚 ot|{xl ∀
112 华山松大小蠹成虫消化道和共生真菌胞外蛋白及酶的分析
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法进行电泳分析 ∀酯酶同工酶 !淀粉酶同工酶 !纤维素k≤¬酶l同工酶
分离胶浓度 z1x h o浓缩胶浓度 v h o漆酶同工酶分离胶浓度 ts h o浓缩胶浓度 v h o但在纤维素k≤¬酶l同工
酶和蛋白酶工酶分离胶中分别加入 s1{ ª#kts °lpt羧甲基纤维素钠 x °和 s1{ ª#kts °lpt明胶 x °恒
流电泳 o先 t °„#¦°pt vs °¬±o后 u ° „#¦°ptk王中仁 ot||y ~张树政等 ot|{zl ∀
蛋白分析采用硝酸银和考马斯亮蓝 • p uxs染色法 ∀蛋白带迁移率 Ρφ € ξur ξtk ξu 该带存分离胶上的迁
移距离 o¬t 电泳指示剂在胶上的迁移距离lk严东辉等 ot||zl ∀酶分析 }酯酶同工酶用固蓝 …盐 !乙酸 p Αp萘
酯和乙酸 p Βp萘酯显色k陈毓荃 ot|||l ~淀粉酶同工酶用碘 p磺酸钾显色k黄镇亚 ot|{xl ~纤维素k≤¬酶l同
工酶用碘化钾 p碘液染色 oys h硫酸显色k李庆 ot||yl o漆酶同工酶用 ’ p甲氧基苯酚法染色k方自若等 o
t|{x ~刘尚旭等 ousssl ~蛋白酶同工酶用氨基黑 ts…显色k严东辉等 ot||zl ∀
u 结果与分析
211 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白分析
图 t 华山松大小蠹和共生真菌蛋白图谱k考马斯亮蓝 • p uxs染色l
ƒ¬ªqt °µ²·¨¬± ½¼°²ªµ¤° ²© ∆ qαρµανδι ¤±§¶¼°¥¬²·¬¦©∏±ª∏¶ Λqθινλινγενσισ
„ }共生真菌在纤维素诱导培养基上培养 ≥¼°¥¬²·¬¦©∏±ª∏¶¦∏¯·∏µ¨§¬± ·«¨
¦¨¯¯∏¯¤¶¨ ¬±§∏¦¨ °¨ ±·° §¨¬∏° ~…}共生真菌在漆酶诱导培养基上培养 ≥¼°¥¬2
²·¬¦©∏±ª∏¶¦∏¯·∏µ¨§¬±·«¨ ¤¯¦¦¤¶¨ ¬±§∏¦¨° ±¨·° §¨¬∏° ~ ≤ }共生真菌在麦芽汁
培养基上培养 ≥¼°¥¬²·¬¦©∏±ª∏¶¦∏¯·∏µ¨§¬±·«¨ º²µ·°¨ §¬∏° ~⁄}华山松大小蠹
∆ενδροχτονυσ αρµανδι q下同 ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
分析结果表明 }华山松大小蠹消化道凝胶
电泳在银染色中呈现出 tw条蛋白带 o在考马斯
亮蓝 • p uxs染色中仅显示 y条蛋白带 ~共生真
菌在银染色中显示出 |条蛋白带 o在考马斯亮
蓝 • p uxs染色中仅显示 v条蛋白带 o且在不同
培养基上呈现出不同的蛋白带 ∀同时 o华山松
大小蠹成虫消化道蛋白带与共生真菌胞外蛋白
带迁移率也存在明显差异 o表明培养基内容物
对共生真菌胞外蛋白的分泌有极大的影响 ∀由
此可见 o华山松大小蠹消化道和真菌可向体外
和胞外分泌多种可溶性蛋白 o但两者分泌蛋白
的组成和含量不同k图 t p ¤!¥l ∀
212 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外酶
组成分析
u1u1t 纤维素酶 在相同加样量的情况下 o共
生真菌能显示出纤维素酶带 o且不同培养诱导
条件下 o酶带迁移率也有差异 o其中纤维素诱导
培养基培养的显示出 w条酶带 o而麦芽汁培养
基培养的则不显示纤维素酶带 o表明共生真菌
胞外纤维素酶具有很强的底物诱导性 ∀华山松
大小蠹消化道也具有分泌纤维素酶的能力 o在
凝胶电泳板上显示出 v条酶带 o其中一条最大
迁移率达 Ρ© € s1| o远大于共生真菌k图 ul o说明华山松大小蠹消化道诱导分泌的纤维素酶与共生真菌胞外
诱导的纤维素酶在分子结构上具有明显的差异 ∀
u1u1u 淀粉酶 华山松大小蠹消化道具有较为丰富的淀粉酶同工酶 o凝胶电泳中呈现 w条酶带 o且各酶带
wut 林 业 科 学 ws卷

图 u 华山松大小蠹和共生真菌
纤维素酶酶谱
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²© ∆ qαρµανδι ¤±§¶¼°¥¬²·¬¦©∏±ª∏¶
Λqθινλινγενσισ
相对迁移率均较大 o最大迁移率达 Ρ© € s1{u ∀而由纤维素诱导培养基培养的共
生真菌呈现出 v条酶带 o麦芽汁培养基培养的只显示 t条酶带k图 v p ¤l ∀并且
共生真菌胞外淀粉酶的迁移率与华山松大小蠹消化道淀粉酶的迁移率具有显
著差异 o表明华山松大小蠹消化道分泌的淀粉酶与真菌胞外淀粉酶在结构上具
有差异 ∀
u1u1v 酯酶 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外均能分泌酯酶同工酶 o且种
类较多 ∀华山松大小蠹消化道显示 | 条酯酶同工酶酶带 o最大迁移率 Ρ© €
s1zy ~而在 v种培养基上培养的共生真菌均显示出酯酶酶带 o其中在纤维素诱导
培养基培养的酯酶同工酶带最多达 |条 o在漆酶诱导培养基上培养的显示出 x
条酯酶同工酶酶带 o而在麦芽汁培养基上培养的仅显示出 w条酯酶酶带k图 v p
¥l ∀这说明华山松大小蠹消化道分泌的酯酶与共生真菌向胞外分泌的酯酶在
结构上有明显的差异 ∀
u1u1w 蛋白酶 华山松大小蠹消化道及共生真菌胞外蛋白酶的电泳染色结果表
明 o华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外均能分泌大量的蛋白酶 ∀可能由于蛋白
酶分子结构较大 o其电泳迁移率较小 ∀同时 o由于蛋白酶在泳动过程中与胶板底
物明胶相互作用 o导致染色结果出现整条亮带 o而无法分清酶带数 ∀但仍可看出
华山松大小蠹消化道蛋白酶迁移率较高 Ρ© € s1xw o而共生真菌胞外蛋白酶迁移率
较低k最大迁移率仅 Ρ© € s1wul∀这也说明共生真菌胞外分泌的蛋白酶与华山松
大小蠹消化道分泌的蛋白酶在结构上不完全相同k图 v p¦l∀
u1u1x 漆酶 漆酶为一类典型的诱导酶 o在培养液中加入底物愈创木酚时 o可以诱导共生真菌分泌漆酶 o明
显可见发酵液变成红色 o但在华山松大小蠹消化道粗酶液中加入底物时 o未见出现红色 ∀在加样量相同的情
况下 o仅在漆酶诱导培养基上培养的共生真菌呈现出漆酶单一酶带 o这表明共生真菌具有胞外诱导分泌漆酶
的能力 o但含量较低 ~而华山松大小蠹消化道不具有分解木质素漆酶的能力k图 v p §l ∀出现上述情况可能
与诱导底物非华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外漆酶最适底物有关 o也可能与华山松天然木质素存在较
大差异有关 ∀
图 v 华山松林蠹和共生真菌淀粉酶酶谱
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xut 第 x期 陈 辉等 }华山松大小蠹和共生真菌分泌酶组成分析
v 结论与讨论
华山松大小蠹和共生真菌酶代谢的差异性是二者利用寄主华山松韧皮部和木质部组织营养和协同进化
的基础 ∀华山松大小蠹主要依靠其消化道分泌的纤维素酶 !淀粉酶 !酯酶 !蛋白酶等 o直接利用寄主华山松韧
皮部和木质部边材组织内的纤维素 !半纤维素 !淀粉 !多糖 !脂类和蛋白等营养物质 ∀而共生真菌则依靠胞外
分泌的纤维素酶 !淀粉酶 !酯酶 !蛋白酶和漆酶等 o分解利用 !酯酶 !蛋白酶 o直接利用华山松木质部管胞细胞
间和细胞内 !薄壁细胞和树脂道泌脂细胞内和细胞间的营养成分 ∀同时 o华山松大小蠹和共生真菌由于酶结
构的差异性 o使二者在利用寄主树木营养成分上表现出分化与协作 o华山松大小蠹依靠共生真菌分解寄主华
山松韧皮部和木质部边材组织内纤维素 !半纤维素 !木质素 !淀粉 !酯类物质 o使健康寄主华山松韧皮部和木
质部内难以直接利用的高分子物质被分解为小分子物质 o从而使华山松大小蠹对寄主树木营养的利用率大
大提高 ∀
华山松大小蠹共生真菌胞外纤维素酶和漆酶的底物诱导性 o使共生真菌在华山松大小蠹成虫携带入侵
健康寄主华山松后 o在寄主华山松韧皮部和木质部纤维素和木质素底物的诱导下 o迅速合成和分泌纤维素酶
和漆酶 o不仅有效克服寄主华山松韧皮部和木质部组织结构抗性 o而且为华山松大小蠹提供了间接利用寄主
华山松纤维素 !半纤维素和木质素营养的途径 o也使华山松大小蠹与共生真菌的互惠共生关系将更加紧密 ∀
参 考 文 献
陈 辉 o袁 锋 1 华山松大小蠹带菌部位及贮菌器结构研究 1 林业科学 ousss ovyktl }xv p xz
陈毓荃主编 1 生物化学实验方法和技术 1 西安 }世界图书出版公司 ot|||
方自若 o侯文英 o郑美媛 1 几种担子菌胞外漆酶同工酶谱的研究 1 真菌学报 ot|{x owkvl }tzw p tz|
高培基 o刘垂 1 研究纤维素酶活性时测定还原糖方法的选择 1 植物生理学通讯 ot|{x okul }xt p xw
郭杰炎 o蔡武城 1 微生物酶 1 北京 }科学出版社 ot|{y
黄镇亚 1木材微生物及其利用 1 北京 }中国林业出版社 ot|{x
蒋书楠 o殷幼平 o王中康 1 几种天牛纤维素酶的来源 1 林业科学 ot||y ovukxl }wwt p wwy
李 庆 1天牛科纤维素酶同工酶研究 1林业科学 ot||y ovukul }tws p twv
唐 明 o陈 辉 1 华山松大小蠹共生真菌对寄主树木的影响 1 林业科学 ot||| ovxkyl }yv p yy
王中仁 1植物等位酶分析 1北京 }科学出版社 ot||y
严东辉 o杨宝君 1 松材线虫体外酶组成分析 1 林业科学研究 ot||z otskvl }uxy p uy|
张树政 o孟广震 o何忠效 1 酶学技术研究 1 北京 }科学出版社 ot|{z
刘尚旭 o董佳里 o张义正 1 糙皮侧耳菌漆酶同工酶谱分析 1四川大学学报k自然科学版l ousss ovzkxl }zy{ p zzt
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更 正
本刊 ussw年第 w期5竹笋万纹象综合防治技术研究6一文中 o第 usz页倒数第 u行/从低到高0应为/从高
到低0 ∀特此更正 ∀
作者 }朱建华
yut 林 业 科 学 ws卷