全 文 ：第 wt卷 第 y期
u s s x年 tt 月
林 业 科 学
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毛白杨 ΑΠv同源基因kΠτΑΠv l的克隆及其
在烟草中的正反义转化初报 3
王冬梅 张志毅 安新民 李善文 何承忠
k北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室 北京 tsss{vl
摘 要 } 根据毛果杨 ΑΠv同源基因k ΠΤ∆l设计一对 °≤• 引物 o以毛白杨基因组 ⁄‘„为模板 o通过 °≤• 技术分离
克隆了毛白杨 ΑΠv同源基因 ΠτΑΠv ∀分析表明该基因全长 t {tv ¥³k包括引入的酶切位点l o包括 z个外显子和 y
个内含子 o编码 uv{个氨基酸 ∀在 Š¨ ±…¤±®中进行 ¥¯¤¶·检索 o发现其氨基酸序列与大丁草 !矮牵牛 !百合 !玫瑰 !苹
果 !毛果杨 ΑΠv同源基因的氨基酸序列具有 xu h ∗ {u h的同源性 ∀ ΠτΑΠv蛋白具有非常保守的  „⁄≥2¥²¬序列 o
推测其为转录因子 ∀≥²∏·«¨µ±杂交分析发现 o该基因在毛白杨雄株中为双拷贝 o而在雌株中则为单拷贝 ∀为进行
功能分析 o构建了正反义表达载体 o通过农杆菌介导转化获得了一些转基因烟草植株 ∀
关键词 } 毛白杨 ~ ΑΠv同源基因 ~克隆 ~转化
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsy p ssvx p s{
收稿日期 }ussw p st p tu ∀
基金项目 }国家自然科学基金kvsvzttzxl和中国博士后基金kussusvuswtl资助 ∀
3 张志毅为通讯作者 ∀
Χλονινγ οφ αν ΑΠΕΤΑΛΑv Ηοµολογουσ Γενε kΠτΑΠv l φροµ Ποπυλυστοµεντοσα ανδ
Πρελιµιναρψ Στυδψ ον Ιτσ Σενσε ανδ ΑντιpΣενσε Τρανσφορµατιον ιν Τοβαχχο
• ¤±ª⁄²±ª°¨ ¬ «¤±ª«¬¼¬ „± ÷¬±°¬± ¬≥«¤±º¨ ± ‹¨≤«¨ ±ª½«²±ª
k ΚεψΛαβορατορψφορ Γενετιχσ ανδ Βρεεδινγ οφ Φορεστ Τρεεσ ανδ Ορναµενταλ Πλαντσo Μινιστρψοφ Εδυχατιον o Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtsss{vl
Αβστραχτ } „ ³¤¬µ²©³µ¬°¨ µ¶º¨ µ¨ §¨¶¬ª±¨ §¤¦¦²µ§¬±ª·²³∏¥¯¬¶«¨§ Ποπυλυστριχηοχαρπα ª¨ ±¨ k ΠΤ∆l o¤±§ ΠτΑΠv o¤± ΑΠv
«²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ©µ²° Πq τοµεντοσα º¤¶¬¶²¯¤·¨§¥¼ °≤• ∏¶¬±ªª¨±²°¬¦⁄‘„ ²© °¤¯¨¦¯²±¨ ²© Ποπυλυσ τοµεντοσα kxsl ¤¶
·¨°³¯¤·¨q׫¨ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ º¤¶t {tv ¥³k Βαµ ‹ ´ ¤±§ Σαχ ´ º¨ µ¨ ¬±·µ²§∏¦¨§¤··«¨ x. ¤±§v. ±¨§l
¬±¦¯∏§¬±ªz ¬¨²±¶¤±§y¬±·µ²±¶o¦²§¬±ªuv{ ¤°¬±²¤¦¬§¶qŒ·º¤¶©²∏±§·²«¤√¨ xu h ∗ {u h «²°²¯²ª¼·² ³µ²·¨¬±¶©µ²° Λιλιυµ
ρεγαλε k„ƒxsv|tvl o Πετυνια ηψβριδαk„ƒuvszswl o Γερβερα ηψβριδα k„ss|zuwl o Ροσαρυγοσα k„…sxx|yyl o Μαλυσ δοµεστιχα
k„uxtttyl ¤±§ Πqτριχηοχαρπα k„ƒsxzzs{l ¥¼ ¥¯¤¶·¤±¤¯¼¶¬¶¬± Š¨ ±…¤±®q׫¨µ¨ º¤¶¤«¬ª«¯¼ ¦²±¶¨µ√¨ § „⁄≥2¥²¬ °²·¬©¬±
·«¨ ³µ²·¨¬± ²© ΠτΑΠv o¶²¬·º¤¶³∏·¤·¬√¨ §·² ¥¨ ¤·µ¤±¶¦µ¬³·¬²±©¤¦·²µq׫¨ µ¨¶∏¯·²©≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨µ¨
º¨ µ¨ §²∏¥¯¨¦²³¬¨¶²© ΠτΑΠv ²µ·º² °¨ °¥¨µ¶º«¬¦««¤§¤«¬ª««²°²¯²ª¼·² ¤¨¦«²·«¨µ¬± Πqτοµεντοσα kxs o°¤¯ l¨ ª¨ ±²°¬¦
⁄‘„ o¤±§·«¨µ¨ º¤¶¶¬±ª¯¨¦²³¼ ΠτΑΠv ¬± Πqτοµεντοσα kxs{u o©¨ °¤¯ l¨ ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ q ≥¨ ±¶¨ ¤±§¤±·¬2¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±
√¨ ¦·²µ¶²© ΠτΑΠv º¨ µ¨ ¦²±¶·µ∏¦·¨§ ¥¼ °≤• ¤±§ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ ¶§¬ª¨¶·¬²± ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±o ¤±§·µ¤±¶©²µ°¨ §¬±·² ·²¥¤¦¦²
kΝιχοτιανα ταβαχυµ l ¥¼ Αγροβαχτεριυµ Š∂vtst ¤±§ …„wwsw1 ≥²°¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦·²¥¤¦¦² ³¯¤±·¯¨·¶ º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ § ¥¼ °≤•
¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¤¥²√¨ °¨ ±·¬²±¨ §«¤√¨ ³µ²√¬§¨§¬°³²µ·¤±·§¤·¤·²∏±§¨µ¶·¤±§·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¨ ¦«¤±¬¶° ²© °¤¯¨©¯²º¨ µ
§¨ √¨ ²¯³°¨ ±·²© Πqτοµεντοσαo¤±§¤¯¶²¦²±·µ¬¥∏·¨§·²¶·∏§¼ ²±¦²±·µ²¯ ¬¯±ª©¯²º¨ µ¬±ª²© Πqτοµεντοσα ¥¼ ª¨ ±¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ªq
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυστοµεντοσα~ ΑΠΕΤΑΛΑv «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ~¦¯²±¬±ª~·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
高等植物的开花发育一直是研究的热点 o近年来 o有关花分生组织特征基因和花器官特征基因在拟南芥
kΑραβιδοπσισl !金鱼草kΑντιρρηινυµl等植物中相继得到分离 ∀这些基因的发现 o使得人们对植物的成花和花器
官的发生与发育机制的认识进入到分子水平 ∀目前已在拟南芥和金鱼草中建立了/ „…≤0模型k≤²¨ ± ετ αλqo
t||t ~≤«¤¶¤±ot||tl o该模型认为 o控制拟南芥花器官特征的基因可分为 „ !… !≤ v 类 } „ 类基因包括
ΑΠΕΤΑΛΑt kΑΠt l和 ΑΠΕΤΑΛΑu k ΑΠu l ~…类基因包括 ΑΠΕΤΑΛΑv k ΑΠv l和 ΠΙΣΤΙΛΛΑk ΠΙl ~ ≤ 类基因有
ΑΓΑΜΟΥΣkΑΓl ∀每类基因均在相邻 u轮花器官中起作用 o这些基因单独或相互作用决定花器官的特征 o其
中 ΑΠu单独决定萼片的形成 oΑΠv或 ΠΙ与 ΑΠu共同作用决定花瓣的形成 o而 ΑΠv或 ΠΙ与 ΑΓ的作用决定
雄蕊的特征 oΑΓ的单独作用决定心皮的特征 ∀此外 „类基因与 ≤ 类基因之间存在拮抗作用 ∀这些基因编
码的蛋白为转录因子 o其中大多数含有非常保守的 „⁄≥p¥²¬o称为 „⁄≥p¥²¬基因k≠¤±²©¶®¼ ετ αλqot||sl ∀
另外 u个 „⁄≥p¥²¬基因系 }⁄类基因参与了胚珠特征的决定k„±ª¨ ±¨ ±·ετ αλqot||x ~≤²¯²°¥² ετ αλqot||xl o∞
类基因在  „⁄≥p¥²¬蛋白复合物的形成中起着关键的作用k°¨ ¤¯½ ετ αλqousss ~ ‹²±°¤ ετ αλqousssl ∀
毛白杨k Ποπυλυστοµεντοσαl是我国特有的白杨派树种 o雌雄异株 o但偶见雌雄同株现象 o雌株较少k张志毅
等 ot||ul ∀杨树的花不同于拟南芥等模式植物的 w轮花器官结构 o仅由苞片和雄蕊Π雌蕊 u轮结构组成
k≥«¨ ³³¤µ§ ετ αλqousssl ∀这种结构差异的分子机制尚不清楚 ∀早在 us世纪 {s年代 o董源kt|{u ~t|{wl就进
行了毛白杨的胚胎学观察研究 o之后朱大保kt||sl对毛白杨的有性生殖能力进行了研究 o张志毅等kt||u ~
usssl先后对毛白杨开花结实特性和三倍体毛白杨的有性生殖能力进行了研究 ∀近年来 o国外对杨树开花及
花器官发育的分子生物学的研究进展很快 ∀≥«¨ ³³¤µ§等kusssl分离了毛果杨k Ποπυλυστριχηοχαρπαl ΑΠΕΤΑΛΑv
同源基因k ΠΤ∆l o并对其时空表达进行了研究 ∀与毛果杨开花及花器官发育相关的拟南芥 ΛΦΨ!ΑΓ !
ΑΠΕΤΑΛΑt同源基因 ΠΤΛΦ!ΠΤΑΓ !ΠΤΑΠt相继得到分离k•²·°¤±± ετ αλqousss ~  ¬¨¯¤± ετ αλqousstl ∀毛白
杨在我国分布广 !面积大 o在生态防护林和工业用材林建设中发挥着重要的作用 o但长期以来存在育种周期
较长和开花污染严重的环境问题 ∀然而迄今为止 o在国内关于毛白杨开花发育相关基因的研究还未见报道 ∀
为此开展了毛白杨 ΑΠv同源基因的分离等相关研究工作 o这对揭示毛白杨开花的分子机理具有重要的理论
意义 o并为通过基因工程手段缩短育种年限和抑制开花污染的研究奠定基础 ∀
t 材料与方法
111 材料
毛白杨试材取自北京林业大学苗圃 o在春季分别取毛白杨的雌性无性系kxs{ul和雄性无性系kxsl的幼
叶用于提取基因组 ⁄‘„ o进行 °≤• 和 ≥²∏·«¨µ±杂交分析 ∀
112 方法
t1u1t 植物基因组 ⁄‘„的制备 按照王关林等kussul所述方法提取 ∀
t1u1u °≤• 反应 根据毛果杨 ΑΠv同源基因k ΠΤ∆l的核酸序列 o设计合成了 x. 端引物kx. p×׊Š„×≤≤
„׊ŠŠ×≤Š×ŠŠ„„„Š„pv. l和 v. 端引物kx. p„„Š„Š≤×≤×≤„„ŠŠ„„ŠŠ≤Š„„Š××pv. l ∀以毛白杨雄株基因组
⁄‘„为模板 o用上述引物进行 °≤• 扩增 ∀xs ˏ°≤• 反应体系包括 t ≅ °≤• ¥∏©©¨µk×µ¬¶ts °°²¯#pt o³‹{1v o
Ž≤¯ xs °°²¯#pt o ª≤¯ u u1x °°²¯#ptl中 o含毛白杨雄株基因组 ⁄‘„ xs ±ªo各 t ˏts ³°²¯# ˏpt的 x.端引
物和 v.端引物 ou1x单位的 פ´ ⁄‘„聚合酶 ∀反应先在 |w ε 预变性 x °¬±o然后在 |w ε 变性 ws¶!ys ε 复性
ws ¶!zu ε 延伸 u °¬±条件下进行 vs轮循环 o最后在 zu ε 延伸 ts °¬±ow ε 保存 ∀
t1u1v °≤• 产物重组入 ³Š∞ ο• p× ¤¨¶¼载体 回收凝胶中的 °≤• 产物 o采用 ±Œ„ ∏´¬¦®ο• Š¨ ¯ ∞¬·µ¤¦·¬²± Ž¬·
k±Œ„Š∞‘l纯化 o然后与 ³Š∞ ο• 2× ¤¨¶¼载体k°µ²°¨ ª¤l连接 ∀连接产物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o在
…Π„°³ΠŒ°×ŠΠ÷pª¤¯ 平板上筛选重组质粒 ∀重组质粒进行 °≤• !质粒长度和限制性内切酶酶切鉴定 ∀
t1u1w ⁄‘„序列测定及分析 采用双脱氧终止法 o°∞公司 vzz型自动测序仪测定重组质粒 ⁄‘„序列 ∀所
得序列采用 Š¨ ±…¤±®上的 …¯¤¶·进行同源性检索 o并运用 ≥¨ ¤´¬§ µ !≤¯ ∏·¤¯¬!…¬²¨ §¬·和 ⁄‘„„‘等软件进行翻
译 !比较和作图分析 ∀
t1u1x 探针制备与 ≥²∏·«¨µ±杂交分析 将上述 °≤• 产物进行纯化 o在 vz ε 下用 ⁄ŒŠ p tt p §˜×°标记 us «o
制备成杂交探针 ∀分别以毛白杨雌 !雄植株的幼叶为材料 o按照王关林等kussul所述方法分别提取基因组
⁄‘„ ∀取 ts Λª雌雄株基因组 ⁄‘„ o分别用 Βαµ ‹ ´ !Εχο• ´ !ηιν§¶酶切 o然后在 s1{ h 琼脂糖凝胶电泳分
离 o通过 us ≅ ≥≥≤转移到带正电荷的尼龙膜上 ∀在 wu ε 预杂交 vs °¬±o然后加入探针在 xx ε 杂交 tw ∗
ty «∀在 us ∗ ux ε 下用 u ≅ ≥≥≤Πs1t h ≥⁄≥k ωΠϖl洗膜ku ≅ x °¬±l o然后在 yx ε 下用 s1x ≅ ≥≥≤Πs1t h ≥⁄≥k ωΠ
ϖl洗膜ku ≅ tx °¬±l ∀最后按照 ⁄ŒŠ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·k•²¦«¨ l说明书进行免疫检测 ∀
t1u1y 正反义植物表达载体的构建 分别用 Βαµ ‹ ´ΠΣαχ´和 Βαµ ‹ ´ΠΞβα´对上述阳性重组质粒 ⁄‘„和
³…Œtut质粒 ⁄‘„双酶切 o分别回收释放出的目的基因及基因片段和 ³…Œtut o在 ×wp⁄‘„连接酶作用下分别进
行连接 o连接产物分别转化大肠杆菌 ׊t感受态细胞 o在含 Ž¤±的 …平板上筛选重组质粒 o并进行 °≤• k正
yv 林 业 科 学 wt卷
义载体引物和反应条件同上述 °≤• ∀反义载体引物为 }x. 端引物 x. pŠŠ„×׊„׊׊„ׄ×≤×≤≤„≤׊pv. 和 v.
端引物 x. p≤≤„≤„Š××××≤Š≤Š„×≤≤„Š„≤×pv. o反应条件同上述 °≤• l !酶切和测序鉴定 o获得毛白杨 ΠτΑΠv
的正反义表达载体 ∀
t1u1z 烟草的转化及转基因烟草的 °≤• 检测 挑取含有目标载体的农杆菌 Š∂vtst单菌斑于含有链霉素
和卡那霉素的 …中 o在 u{ ε 下培养 uw «∀将无菌普通烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl叶片切成 t ∗ u ¦°u 小块 o预
培养 u §后 o在上述菌液的 ts倍稀释液中浸泡 x °¬±o转入含羧苄青霉素k≤¥oxss °ª#ptl和卡那霉素kŽ¤±o
tss °ª#ptl的 ≥培养基上进行筛选 ∀待转化的烟草叶盘出现抗性芽后 o将抗性芽切下并置于生根培养基
≥µk≤¥ouxs °ª#pt ~Ž¤±otss °ª#ptl中生根 o使其长成完整植株 ∀提取转基因烟草植株和对照植株的基因
组 ⁄‘„作为 °≤• 反应的模板 o°≤• 引物和反应条件同上述表达载体构建时相同 ∀
u 结果与分析
211 毛白杨 ΑΠ3同源基因的分离克隆
为了从毛白杨中分离 ΑΠv同源基因 o首先根据毛果杨 ΑΠv同源基因k ΠΤ∆l设计合成了一对 °≤• 引物 o
利用 °≤• 技术从毛白杨雄性植株基因组 ⁄‘„中分离 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l ∀°≤• 结果如图 t„所示 o扩增
出一条长度大约为 t1{ ®¥的 ⁄‘„ 条带 ∀将该条带回收纯化 o并与 ³Š∞ ο• 2× ¤¨¶¼载体连接 o转化大肠杆菌
׊t感受态细胞 o通过 „°³和蓝白斑筛选 o获得重组质粒 °×„°v÷„2t和 °×„°v÷„2u ∀进一步进行 °≤• 检测
表明 o以重组质粒 ⁄‘„为模板 o可扩增出与毛白杨雄株基因组 ⁄‘„的 °≤• 产物大小完全一致的 ⁄‘„条带
k图 t…l ∀质粒长度检测表明 o重组质粒比 ³…≥的长度明显变长k图 t≤l o用 Βαµ ‹ ´和 Σαχ´双酶切后释放出
一条与 °≤• 产物长度一致的 ⁄‘„片段k图 t⁄l ∀说明 °≤• 产物已经克隆入 ³Š∞ ο• 2× ¤¨¶¼载体中 ∀
图 t 毛白杨雄株 ΑΠv同源基因的克隆
ƒ¬ªqt ≤¯ ²±¬±ª²© ΑΠv «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ©µ²° °¤¯¨¦¯²±¨ ²© Πq τοµεντοσα
 q⁄2usss °¤µ®¨µ~t1 °≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·²©ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ~u ov q°·„°v÷„2t和 °·„°v÷„2
u的 °≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·¶²©°·„°v÷„2t ¤±§°·„°v÷„2u ~w1 质粒 ³…≥ ׫¨ ³¯¤¶°¬§³…≥ ~x1
重组质粒 ׫¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§~y1 重组质粒用 Βαµ ‹ ´ 和 Σαχ´双酶切 ׫¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·
³¯¤¶°¬§§¬ª¨¶·¨§º¬·« Βαµ ‹ ´ ¤±§ Σαχ´ ~„ q°≤• 扩增产物 °≤• ³µ²§∏¦·²©ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ~…q
重组质粒的 °≤• 检测 °≤• ·¨¶·¶²©·«¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§~ ≤ q重组质粒长度检测 × ¶¨·²©
¯¨ ±ª·«²©·«¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§~⁄q重组质粒的双酶切鉴定 ׫¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§§¬ª¨¶·¨§
º¬·«µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨§²±∏¦¯ ¤¨¶¨¶q
212 序列分析
测定重组质粒的 ⁄‘„ 序列 o表明
克隆的 °≤• 产物长t {tv ¥³k包括引入
的 x.和 v. 端的酶切位点l ∀结合真核
生物基因组 ⁄‘„ 内含子的一般剪切
规律 o并运用 …≤ Š¨ ±¨ ƒ¬±§¨µ主页
k«·³}ΠΠ§²·q¬°ª¨±q¥¦°q·°¦q¨ §∏}|vvŒΠ
ª¨ ±¨ 2©¬±§¨µΠª©q«·°¯ l 上的 ≥°k¶¨¤µ¦«
©²µ³²·¨±·¬¤¯ ¶³¯¬¦¨ ¶¬·¨¶l程序对该序列
进行拼接分析 o结果表明该基因序列
包括 z个外显子和 y个内含子kt¶· ¬¨²±
| , ,t|y ~ t¶·¬±·µ²± t|z , ,vvt ~ u±§
¬¨²± vvu , ,v|{ ~ u±§ ¬±·µ²± v|| , ,
w|t ~vµ§ ¬¨²± w|u, ,xxv ~vµ§¬±·µ²± xxw
, ,yyw ~w·« ¬¨²±yyx, ,zyw ~w·«¬±·µ²±
zyx , ,tvuv ~x·« ¬¨²± tvuw , ,tvyx ~
x·« ¬±·µ²± tvyy , ,twwy ~y·« ¬¨²± twwz
, ,tw|t ~y·«¬±·µ²± tw|u, ,tx|u ~z·« ¬¨²± tx|v , ,t{sxl o编码 uv{个氨基酸k采用 ≥¨ ¤´¬§ŒŒ推导lk图 ul ∀
在第 t个外显子中包括有 „⁄≥2¥²¬基因所特有的非常保守的序列k图 u划线部分l o推测该基因为 „⁄≥2
¥²¬基因家族的一个成员 o其编码的蛋白可能具有转录因子的功能 ∀
采用 ⁄‘„„‘软件绘制了毛白杨 ΑΠv同源基因的结构和酶切图谱k图 vl o其中第 t !u !v !w个外显子分
布于该基因序列中的前 tΠu段 o而第 x !y !z个外显子则分布于该基因序列的后 tΠv段 o第 w个内含子是该序
列中最大的内含子kxx| ¥³l ∀除在 °≤• 扩增时 x. 和 v. 端引入的 Βαµ ‹ ´和 Σαχ ´位点外 o在 xty ¥³!zt| ¥³
和 {yu ¥³处分别存在有 Εχο• ∏ !Νδε ´和 Ξβα´酶切位点 o这为进一步进行 ≥²∏·«¨µ±和 ‘²µ·«¨µ±杂交分析制
备探针 !基因组 ⁄‘„酶消化和功能研究提供了重要的信息 ∀
zv 第 y期 王冬梅等 }毛白杨 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l的克隆及其在烟草中的正反义转化初报
图 u 毛白杨雄株 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l全长序列和推导的氨基酸序列
ƒ¬ªqu ׫¨ ©∏¯¯ ±∏¨¦¯²·¬§¨ ¤±§§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©³∏·¤·¬√¨ ΑΠv «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ k ΠτΑΠv l ©µ²° °¤¯¨¦¯²±¨ ²© Πq τοµεντοσα
小写字母为非编码序列 o大写字母为编码序列 ∀ ׫¨ ¶°¤¯¯¯¨ ·¨µ¶¥¨ ²¯±ª·² ±²±p¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ o¤±§·«¨ ¦¤³¬·¤¯ ¯¨ ·¨µ¥¨ ²¯±ª·²¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ q
图 v 毛白杨雄株 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l结构和酶切图谱
ƒ¬ªqv ≥·µ∏¦·∏µ¤¯ ¤±§µ¨¶·µ¬¦·¬²± °¤³²© ΑΠv «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ©µ²° °¤¯¨¦¯²±¨ ²© Πq τοµεντοσα k ΠτΑΠv l
在 Š¨ ±…¤±®进行 …¯¤¶·检索 o结果表明毛白杨与毛果杨k Ποπυλυσ τριχηοχαρπα o „ƒsxzzs{l ΑΠv同源基因编
码的氨基酸序列具有 {u h 同源性 o而与苹果k Μαλυσ δοµεστιχαo „uxttty o„…s{ts|vl !玫瑰k Ροσα ρυγοσα o
„…sxx|yyl !百合kΛιλιυµ ρεγαλε o „ƒxsv|tv o „…sztvz{l !矮牵牛k Πετυνια ηψβριδα o„ƒuvszswl和大丁草k Γερβερα
ηψβριδα o„ss|zuwl的同源性则分别为 ys h !ys h !xx h !xu h和 xu h ∀采用 …¬²¨ §¬·和 ≤¯ ∏¶·¤¯¬软件对分别来自
毛白杨 !毛果杨 !苹果 !玫瑰 !大丁草 !矮牵牛 !百合和萱草k Ηεµεροχαλλισ «¼¥µ¬§¦∏¯·¬√¤µo„ƒus|zu|l的 ΑΠv同源
基因的氨基酸序列进行比较分析 o发现来自不同植物的 ΑΠv同源基因其编码的氨基酸序列在近 x. 端有较
高的同源性k图 wl o而该区域属于高等植物非常保守的 „⁄≥p¥²¬基序k°²·¬©l o是转录因子的一个重要特
征 ∀因此 o推测本研究获得的毛白杨 ΑΠv同源基因可能具有转录因子的功能 ∀
213 Σουτηερν杂交分析
为证实获得的毛白杨雄性植株 ΑΠv同源基因的真实性 o用 ⁄ŒŠ标记的 ΠτΑΠv制作探针 o杂交转有经
Βαµ ‹ ´ !Εχο• ´和 ηιν§¶ 酶切过的雄 !雌株基因组 ⁄‘„的尼龙膜 o结果表明 } 在较高严谨度的洗膜条件
{v 林 业 科 学 wt卷
图 w 几种植物 ΑΠv同源基因编码的氨基酸同源性比较
ƒ¬ªqw ≥¬°¬¯¤µ¬·¼ ²©¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨¶¦²§¨§¥¼ ΑΠv «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ²©¶¨√¨ µ¤¯ ³¯¤±·¶
采用 ≤¯ ∏¶·¤¯¬软件引入k p p l以达到最大的同源性 ~保守的  „⁄≥2¥²¬序列用下划线表示 o完全保守和适当替代的氨基酸分别用/ 3 0 !/ }0
和/ q0表示 ∀ ׫¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨¶«¤√¨ ¥¨ ±¨ ¤¯¬ª±¨ §¥¼¬±·µ²§∏¦¬±ªª¤³¶k p p l ·² °¤¬¬°¬½¨ «²°²¯²ª¼ k≤¯ ∏¶·¤¯ • ¶²©·º¤µ¨l q ≤²±¶¨µ√¨ §  „⁄≥2¥²¬
°²·¬©¤µ¨ ∏±§¨µ¯¬±¨ §o¤±§·²·¤¯ ¼¯ ¦²±¶¨µ√¨ §¤±§¦²±¶¨µ√¤·¬√¨ ¼¯ µ¨³¯¤¦¨§¤°¬±² ¤¦¬§¶¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§¥¼ ¤¶·¨µ¬¶®¶¤±§§²·¶oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q „ƒsxzzs{ }毛果杨
Ποπυλυστριχηοχαρπα ~ „uxttty ¤±§ „…s{ts|v }苹果 Μαλυσ δοµεστιχα ~„…sxx|yy }玫瑰 Ροσα ρυγοσα ~ „ss|zuw }大丁草 Γερβερα ηψβριδα ~ „ƒuvszsw }
矮牵牛 Πετυνια ηψβριδα ~ „ƒxsv|tv }百合 Λιλιυµ ρεγαλε ~„ƒus|zu| }萱草 Ηεµεροχαλλισ «¼¥µ¬§¦∏¯·¬√¤µq
图 x 毛白杨雄雌株基因组 ⁄‘„的
≥²∏·«¨µ±印迹分析
ƒ¬ªqx ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶²© ⁄‘„ ©µ²° °¤¯¨¤±§
©¨ °¤¯¨¦¯²±¨ ¶²© Πq τοµεντοσα ∏¶¬±ª³µ²¥¨ ²© ΠτΑΠv
 }⁄tx sss °¤µ®¨µ~…} Βαµ ‹ ´ ~ ∞} Εχο• ´ ~
‹ } ηιν§¶ q
下 o获得了理想的杂交信号 o说明 ΠτΑΠv的确来自毛白杨基因组 ~
毛白杨雄 !雌性植株基因组 ⁄‘„杂交印迹显著不同 o其中在雄株
基因组 ⁄‘„中存在双拷贝 ΑΠv同源基因或者说存在同源性极高
的 u个成员 o而在雌株基因组 ⁄‘„中则只有单拷贝的 ΑΠv同源
基因 k图 xl ∀
214 正反义植物表达载体的构建
为了进一步研究毛白杨 ΑΠv同源基因 ΠτΑΠv在雄蕊发育中
的功能 o将重组质粒 ³Š∞2 ΠτΑΠv与 ³…Œtut分别用 Βαµ ‹ ´ΠΣαχ
´和 Βαµ ‹ ´ΠΞβα´进行消化 o然后回收相应条带 o在 ×w2⁄‘„连
接酶作用下进行连接 o构建成正反义植物表达载体k图 yl ∀经抗
Ž¤±筛选获得重组质粒 ³…Œtut2 ΠτΑΠv和 ³…Œtut2 Πταπ v ∀ °≤• 检
测表明 o分别以 ³…Œtut2 ΠτΑΠv和 ³…Œtut2 Πταπ v为模板 o能够扩增
出 t1{ ®¥和约 t1t ®¥k包括 {zs ¥³的目的序列及大约 uvs ¥³的
vx≥启动子和 Š˜≥基因序列l的条带 o与插入片段的长度一致k图
z„ o…l ∀进一步的酶切试验表明 o分别用 Βαµ ‹ ´ΠΣαχ´和 Βαµ ‹
|v 第 y期 王冬梅等 }毛白杨 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l的克隆及其在烟草中的正反义转化初报
´ΠΞβα´对 ³…Œtut2 ΠτΑΠv与 ³…Œtut2 Πταπ v进行消化 o可释放出 t1{ ®¥和 {zs ¥³的条带k图 z≤ o⁄l ∀以上试
验证明已经成功构建了毛白杨 ΠτΑΠv的正反义表达载体 ∀
图 y 毛白杨 ΠτΑΠv正反义表达载体的构建
ƒ¬ªqy ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©¶¨±¶¨ ¤±§¤±·¬2¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ¶²© ΠτΑΠv
„ q毛白杨 ΠτΑΠv正义表达载体构建 ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ²© ΠτΑΠv ~
…q毛白杨 ΠτΑΠv反义表达载体构建 ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©¤±·¬2¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ²© ΠτΑΠv q
图 z 毛白杨 ΠτΑΠv正反义表达载体的 °≤• 和酶切鉴定
ƒ¬ªqz ׫¨ ·¨¶·¶²©°≤• ¤±§§¬ª¨¶·¬²± ²©¥²·«¶¨±¶¨ ¤±§¤±·¬2¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ¶²© ΠτΑΠv
„ q正义表达载体 ³…Œtut2 ΠτΑΠv的 °≤• 检测 ׫¨ ·¨¶·²©°≤• ²©³…Œtut2 ΠτΑΠv ~…q反义表达载体 ³…Œtut2 Πταπ v的 °≤• 检测 ׫¨ ·¨¶·²©°≤•
²©³…Œtut2 Πταπ v ~≤ q³…Œtut2 ΠτΑΠv的酶切鉴定 ׫¨ ·¨¶·²©§¬ª¨¶·¬²± ²©³…Œtut2 ΠτΑΠv ~⁄q³…Œtut2 Πταπ v的酶切鉴定 ׫¨ ·¨¶·²©§¬ª¨¶·¬²± ²©
³…Œtut2 Πταπ v 1  q⁄2usss ¤µ®¨µ~t1 ³…Œtut2 ΠτΑΠv的 °≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·²©³…Œtut2 ΠτΑΠv ~u1 ³…Œtut2 Πταπ v的 °≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·
²©³…Œtut2 Πταπ v ~v1 ³…Œtut2 ΠτΑΠv的酶切产物 ³…Œtut2 ΠτΑΠv §¬ª¨¶·¨§º¬·« Βαµ ‹ ´ ¤±§ Σαχ ´ ~w1 ³…Œtut2 Πταπ v的酶切产物 ³…Œtut2 Πταπ v
§¬ª¨¶·¨§º¬·« Βαµ ‹ ´ ¤±§ Ξβα´ q
215 转 ΠτΑΠ3基因烟草的获得
用含有正反义植物表达载体的农杆菌 Š∂vtst与烟草叶片共培养k图 {„ o}正义 o• }反义l o待分化出抗
性芽后 o将抗性芽切下在含羧苄青霉素k≤¥oxss °ª#ptl和卡那霉素kŽ¤±otss °ª#ptl的 ≥培养基上进行
培养k图 {…o}正义 o• }反义l o长到适当时机转入生根培养基 ≥µk≤¥ouxs °ª#pt ~Ž¤±otss °ª#ptl中生
根 o使其长成完整植株k图 {≤正义 o⁄反义l ∀然后提取这些抗性苗和对照植株的基因组 ⁄‘„进行 °≤• 检
测 o结果如图 |所示 o表明获得了 t个正义转化的烟草植株k图 |„l和 v个反义转化的烟草植株k图 |…l ∀
v 讨论
迄今为止已从多种草本植物中分离克隆了 ΑΠv同源基因 o如拟南芥 !金鱼草 !矮牵牛 !马铃薯k Σολανυµ
τυβεροσυµl等 ∀对于木本植物而言 o则仅从苹果 !美洲黑杨等分离到 ΑΠv同源基因 ∀本研究通过 °≤• 技术首
次从毛白杨雄株分离克隆了 ΑΠv的同源基因 ΠτΑΠv o表明 ΑΠv同源基因广泛存在于高等植物中 ∀
sw 林 业 科 学 wt卷
图 { 烟草叶盘转化及抗卡那植株的获得
ƒ¬ªq{ Š¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©Ž¤±2µ¨¶¬¶·¤±·³¯¤±·¯¨·¶©µ²°·²¥¤¦¦²¯¨ ¤©§¬¶®¶
„ q叶片与农杆菌共培养 ׫¨ ·²¥¤¦¦²¯¨ ¤©§¬¶®¶¬±©¨¦·¨§¥¼ Αγροβαχτεριυµ ~…q抗性芽培养 Ž¤±2µ¨¶¬¶·¤±·¶«²²·¶©µ²°·²¥¤¦¦²¯¨ ¤©§¬¶®¶~≤ q抗性植株
生根k正义转化l ≤∏¯·∏µ¨ ²©µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§¶«²²·¶k¶¨±¶¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± l ²± ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ° §¨¬∏° ~⁄q抗性植株生根k反义转化l ≤∏¯·∏µ¨ ²©µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§
¶«²²·¶k¤±·¬2¶¨±¶¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± l ²± ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ° §¨¬∏° q
图 | 转基因烟草植株的 °≤• 检测
ƒ¬ªq| ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² ³¯¤±·¯¨·¶√¨ µ¬©¬¨§¥¼ °≤•
„ q正义转化植株的 °≤• 检测 ׫¨ ¶¨±¶¨ ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦ ³¯¤±·
√¨ µ¬©¬¨§¥¼ °≤• ~… q反义转化植株的 °≤• 检测 ׫¨ ¤±·¬¶¨±¶¨
·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶√¨ µ¬©¬¨§¥¼ °≤• q  q⁄2usss ¤µ®¨µ~t1 正义
转化植株 ׫¨ ¶¨±¶¨ ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¤¯±·~u1 阳性对照 k³…Œtut2
ΠτΑΠv l ׫¨ ³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ k³…Œtut2 ΠτΑΠv l ~v1 非转化植株
׫¨ ±²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·~w ∗ y1 反义转化植株 ׫¨ ¤±·¬¶¨±¶¨
·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶~z1 阳性对照 k³…Œtut2 Πταπ v l ׫¨ ³²¶¬·¬√¨
¦²±·µ²¯ k³…Œtut2 Πταπ v l ~{1 非转化植株 ׫¨ ±²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
³¯¤±·q
ΑΠv 同源基因的突出特点是含有非常保守的 „⁄≥2
¥²¬o一般认为该区域的功能是与 ⁄‘„ 的结合有关 ∀因
„⁄≥2¥²¬具有与 ⁄‘„结合和形成二聚体的功能而参与转录
调控 o故这些基因编码的蛋白属于转录因子 ∀在许多植物中
存在保守的 ŒŽ≤结构k„¯ √¤µ¨½2…∏¼¯ ¤¯ ετ αλqousssl q在 „⁄≥2
¥²¬的下游 o还含有较为保守的氨基酸序列 Ž2¥²¬o „⁄≥2¥²¬
和 Ž2¥²¬间的 Œ区以及 ≤ 末端区域 ∀进一步的研究表明 o
„⁄≥2¥²¬和 Œ区域是与 ⁄‘„结合所必须 oŒ和 Ž区有助于这
些蛋白形成二聚体且影响二聚体的特异性k•¬¨¦«°¤±± ετ αλqo
t||y¤~t||y¥l o而且 „°v蛋白也是以二聚体的形式结合到
⁄‘„上 ∀芯片杂交结果表明受 ΑΠv和 ΠΙ 调节的相关基因
数量较小 o暗示许多在花瓣和雄蕊发育中作用的基因并不具
有组织特异性 o而可能在其他的发育过程中也发挥作用
k²µ¬¼¤« ετ αλqoussvl ∀ ΠτΑΠv与其他几种植物的 ΑΠv同源
基因具有较高的同源性 o尤其是在  „⁄≥2¥²¬区域同源性极
高 o因此 o°·„°v蛋白也应属转录因子 ∀在拟南芥中 ΑΠv是
一个花器官特征基因 o属于/ „…≤0模型的 …类基因 oΑΠv或
ΠΙ与 ΑΓ的作用决定雄蕊的特征k‹²±°¤ ετ αλqousss ~ °¨ ¤¯½
ετ αλqousstl ∀最新的研究结果表明 oΑΠv和 ΠΙ直接调节参
与响应花瓣和雄蕊形态发生基本细胞过程所必需的基因k²µ¬¼¤« ετ αλqoussv ~Žµ¤°¨ µετ αλqoussvl ∀本研
究从毛白杨雄性植株分离克隆了 ΠτΑΠv基因 o该基因可能在毛白杨花器官雄蕊的发育中具有重要的功能 ∀
进一步的 ≥²∏·«¨µ±杂交分析显示 oΠτΑΠv基因在毛白杨雄雌株基因组 ⁄‘„中同时存在 o但有明显差异 o在雄
株中存在双拷贝 ΠτΑΠv或可能存在另一同源性极高的同源基因 o而在雌株中为单拷贝 ΠτΑΠv ∀  ¬¨¯¤±等
kusstl的研究证实了毛果杨 ΑΠv同源基因k ΠΤ∆l除在雄花花原基中强烈表达外 o在雌花花原基中也有强烈
的表达 ∀
有关研究表明 o毛白杨雄株虽多 o但花粉败育现象严重k张志毅等 ot||ul ∀而且毛白杨具有 x ∗ ts年的
童期 o育种周期较长 ∀以上这些特性给毛白杨杂交育种工作带来许多困难 ∀为了克服毛白杨花粉败育 !花量
少等育种中的困难 o同时也为了进一步研究毛白杨 ΑΠv同源基因的功能 o本研究构建了 ΠτΑΠv的正反义表
达载体 o通过农杆菌介导转化烟草并获得了一些正反义的转基因烟草植株 o进一步的分子检测和形态学观测
正在进行 ∀同时 o正在开展毛白杨的遗传转化工作 o未来获得的转化植株将可能减轻花粉的败育而提高其生
活力 o这将为毛白杨杂交育种探索一条新的途径 ∀
另外 o毛白杨作为我国北方城市重要的绿化树种 o在绿化 !美化城市环境的同时 o由于雄株散粉和雌株飞
絮又给城市环境造成一定的/污染0 ∀尤其是育性好的杨树雄性植株飞散花粉 o使周围环境中可吸入颗粒物
tw 第 y期 王冬梅等 }毛白杨 ΑΠv同源基因k ΠτΑΠv l的克隆及其在烟草中的正反义转化初报
的密度增加 o是较为严重的过敏源之一 ~在北方城市中每年春暖花开时节 o雌性杨树飞絮已成为影响环境质
量的重要因子 o受到社会的广泛关注 ∀为此本研究设计了 ΠτΑΠv基因的部分反义序列k包括内含子l o连接
于质粒 ³…Œtut的 vx≥启动子之后 o构建成毛白杨 ΑΠv同源基因的反义表达载体 o用于转化毛白杨以抑制该
基因的表达 ∀由于在反义序列中引入内含子 o可对 ΠτΑΠv基因的表达起到超抑制的效果 ∀希望实现干扰毛
白杨等杨柳科树种的开花及花器官发育 o达到改善环境质量的目的 ∀
本研究分离克隆了毛白杨 ΑΠv同源基因 ΠτΑΠv o同时构建了其正反义表达载体 o用于毛白杨和烟草等
的遗传转化研究 ∀目前 o本实验室正在分离毛白杨 ΛΕΑΦΨ和 ΑΓΑΜΟΥΣ等与开花发育相关的基因 o进而研究
分析这些基因在开花发育过程的时空表达规律 o将有助于从分子水平上理解毛白杨开花及花器官发育的机
理 o为通过基因工程手段解决毛白杨育种存在的育种周期长 !开花造成的环境/污染0 !转基因受体的安全性
问题等奠定了基础 o同时也为杨柳科其他树种的相关遗传改良提供借鉴 ∀
参 考 文 献
董 源 qt|{u q毛白杨胚胎学观察 q北京林学院学报 okwl }{s p |u
董 源 qt|{w q毛白杨胚胎学观察 q北京林学院学报 oktl }{v p |w
王关林 o方宏筠 qussu q植物基因工程 q第二版 q北京 }科学出版社
张志毅 o黄智慧 o张东芳 o等 qt||u q毛白杨标本园无性系开花结实的研究 q北京林业大学学报 otwk增 vl }wv p xt
张志毅 o于雪松 o朱之悌 qusss q三倍体毛白杨有性生殖能力的研究 q北京林业大学学报 ouukyl }t p w
朱大保 qt||s q毛白杨有性生殖能力的研究 q北京林业大学学报 otuktl }t p |
„¯ √¤µ¨½2…∏¼¯ ¤¯∞ • o°¨ ¤¯½ ≥ o¬¯­¨ªµ¨± ≥ o ετ αλqusss q„±¤±¦¨¶·µ¤¯  „⁄≥2¥²¬ª¨ ±¨ §∏³¯¬¦¤·¬²±²¦¦∏µµ¨§¥¨©²µ¨ ·«¨ §¬√¨ µª¨ ±¦¨ ²©³¯¤±·¶¤±§¤±¬°¤¯¶q°µ²¦‘¤·¯
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≤²¨ ± ∞ ≥ o  ¼¨¨ µ²º¬·½ ∞  qt||t q׫¨ º¤µ²©·«¨ º«²µ¯¶}ª¨ ±¨ ·¬¦¬±·¨µ¤¦·¬²±¶¦²±·µ²¯ ¬¯±ª©¯²º µ¨§¨√¨¯²³°¨ ±·q‘¤·∏µ¨ ovxv }vt p vz
≤²¯²°¥²oƒµ¤±®¨ ± oŽ²¨·­¨ ∞o ετ αλqt||x q׫¨ ³¨·∏±¬¤  „⁄≥ ¥²¬ª¨ ±¨ ƒ…°tt §¨·¨µ°¬±¨ ¶²√∏¯¨¬§¨±·¬·¼q°¯ ¤±·≤¨¯¯oz }t{x| p t{y{
‹²±°¤ × oŠ²·² Žqusss q׫¨ Αραβιδοπσισ©¯²µ¤¯ «²°¨ ²·¬¦ª¨ ±¨ ΠΙΣΤΙΛΛΑΤΑ¬¶µ¨ª∏¯¤·¨§¥¼ §¬¶¦µ¨·¨ ¦¬¶2¨¯ °¨ ±¨·¶µ¨¶³²±¶¬√¨ ·²¬±§∏¦·¬²± ¤±§°¤¬·¨±¤±¦¨ ¶¬ª±¤¯¶q
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Žµ¤°¨ µ∞  o⁄¬≥·¬¯¬² ∂ ≥ o≥¦«¯|·¨µ°  qussv q≤²°³¯ ¬¨³¤·¨µ±¶²©ª¨ ±¨ §∏³¯¬¦¤·¬²±¬±·«¨ ΑΠΕΤΑΛΑv ¤±§ ΠΙΣΤΙΛΛΑΤΑ ¬¯±¨ ¤ª¨¶²©·«¨ µ¤±∏±¦∏¯¤¦¨¤¨ qŒ±·
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•¬¨¦«°¤±±  o Žµ¬½¨ ® … „ o  ¼¨¨ µ²º¬·½ ∞  qt||y¤q ⁄¬° µ¨¬½¤·¬²± ¶³¨¦¬©¬¦¬·¼ ²© Αραβιδοπσισ  „⁄≥ §²°¤¬± «²° ²¨·¬¦³µ²·¨¬±¶ „°∞ׄ„t o „°∞ׄ„v o
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•¬¨¦«°¤±±o Žµ¬½¨ ® … „ o  ¼¨¨ µ²º¬·½ ∞  qt||y¥q ⁄‘„2¥¬±§¬±ª ³µ²³¨µ·¬¨¶²© Αραβιδοπσισ  „⁄≥ §²°¤¬± «²° ²¨·¬¦³µ²·¨¬±¶ „°∞ׄ„t o „°∞ׄ„v o
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ΦΛΟΡΙΧΑΥΛΑo¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³²³¯¤µ¤±§ Αραβιδοπσισq׫¨ °¯ ¤±·²∏µ±¤¯ ouutv }uvx p uwx
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°¨ µ¬¶·¨°¶²©·«¨ ·º²2º«²µ¯¨ §o∏±¬¶¨¬∏¤¯ ©¯²º µ¨¶q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ otuw kul }yuz p yws
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