全 文 ： 第 vy卷 专刊 tu s s s年 t 月
林 业 科 学
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转 ΧπΤΙ 基因毛白杨的获得 3
郝贵霞 朱 祯
k中国科学院遗传研究所 北京 tsststl
朱之悌
k北京林业大学 北京 tsss{vl
关键词 } 毛白杨 o根农杆菌介导法 o豇豆胰蛋白酶抑制剂( ΧπΤΙ)基因 o转基因植株
收稿日期 }t||{2tt2s| ∀
3 / {yv计划0基金资助项目 ∀
ΟΒΤΑΙΝΙΝΓ ΟΦ ΧΟΩΠΕΑ ΠΡ ΟΤΕΙΝΑΣΕ ΙΝΗΙΒΙΤΟΡ
ΤΡΑΝΣΓΕΝΙΧ ΠΟΠΥΛΥΣ ΤΟΜΕΝΤΟΣΑ
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(Ινστιτυτε οφ Γενετιχσ, Χηινεσε Αχαδε µψοφ Σχιενχεσ Βειϕινγ tsstst)
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( Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss{v)
Αβστραχτ : Œ±·«¬¶¶·∏§¼o¦²º³¨¤·µ¼³¶¬±¬±«¬¥¬·²µ( ΧπΤΙ)ª¨ ±¨ o¤±¬±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ª¨ ±¨ oº¤¶¬±·µ²§∏¦¨§¬±·²·º² Ποπ2
υλυστοµεντοσα ¦¯²±¨ ¶¥¼ ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ° §¨¬¤·¨§¥¼ Αγροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ. ׫¨ ·µ¤±¶©²µ° §¨µ¨ª¨ ±¨ µ¤2
·¬²±¶«²²·¶º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §§¬µ¨¦·¯¼ ¥¼¯¨ ¤©§¬¶¦¶qŒ± ²µ§¨µ·² ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ §¶¨¯¨ ¦·¬²±¦²±§¬·¬²± o¯ ¤¨©§¬¶¦¶º µ¨¨ ¦∏¯·∏µ¨§¬±
·«¨ ° §¨¬∏° º¬·«¬±¦µ¨¤¶¬±ª¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ®¤±¤°¼¦¬±qŽ¤±¤°¼¦¬±µ¨¶¬¶·¤±·k®°µl³¯¤±·¯¨·¶º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §¥¼ v ∗ w ¦¼2
¦¯¨ ¶¶¦µ¨ ±¨¬±ª¬± ¶¨¯¨ ¦·¬√¨¦²±§¬·¬²±q׫¨ ±·µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²·¶º µ¨¨ µ²²·¨§¬±·«¨ ° §¨¬∏° ¦²±·¤¬±¬±ª®¤±¤°¼¦¬± xs
°ªr¤±§·µ¤±¶©¨µµ¨§·²ªµ¨ ±¨«²∏¶¨ q׫¨ ³µ¨¶¨±¦¨ ²© ΧπΤΙ ª¨ ±¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶º µ¨¨ ¦²±©¬µ° §¨¥¼ °≤ • ¤±§
°≤ •2≥²∏·«¨µ± ¥¯²·q
Κεψ ωορδσ: Π. τοµεντοσα , Αγροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ, ≤²º³¨ ¤·µ¼³¶¬± ¬±«¬¥¬·²µª¨ ±¨ ( ΧπΤΙ) o×µ¤±¶2
ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
毛白杨是我国特有的树种 o与其他派别的杨树相比抗性较强 o品质优良 o生长迅速 ∀但蛀干害虫桑
天牛专门危害毛白杨 o造成了很大损失 ∀生物技术的发展为害虫防治提供了一条崭新的途径 o人们寄
希望于通过基因工程手段导入外源抗虫基因培育抗虫新品系 ∀ ¦≤²º±kt||tl将苏云金杆菌毒蛋白
k Β . τ毒蛋白l导入银白杨 ≅大齿杨 o获得一株转基因植株 o并对舞毒蛾幼虫有毒杀作用 o国内的研究者
同样将 Β . τ毒蛋白基因导入黑杨派树种获得抗虫转基因植株k陈 颖 ot||x ~田颖川 ot||v ~王学聘 o
t||zl o但害虫易对 Β . τ毒蛋白产生耐受性的问题不容忽视 ∀豇豆蛋白酶抑制剂k≤²º³¨ ¤ ×µ¼³¶¬± Œ±2
«¬¥¬·²µoΧπΤΙl属丝氨酸蛋白酶抑制剂 o是一种天然的抗虫物质k‹¬¯§¨µot|{zl o作用位点是胰蛋白酶的
活性中心 o其杀虫机理在于抑制害虫必须的消化酶活性 o并通过神经系统的反馈 o使害虫产生厌食 o最
终使害虫因缺乏必须氨基酸而非正常发育或死亡 ∀与 Β . τ毒蛋白相比 , ΧπΤΙ 具有抗虫谱广 ,对人畜
无副作用以及害虫不易产生耐受性等优点 ∀刘春明等分离克隆了 ΧπΤΙ 基因 ,已获得了转基因抗虫烟
草 !棉花等(刘春明 ,t||u ;t||v ;王 伟 ,t||{)
本文通过根农杆菌介导法首次成功地将经过修饰的 ΧπΤΙ 基因转入毛白杨( Ποπυλυσ τοµεντοσα
≤¤µµql o获得了再生植株 o并对其进行了分子生物学鉴定 ∀
1 材料和方法
t1t 菌种和质粒 根农杆菌 …„wwsw o携带质粒 ³…¬±8 ≥≤Ž含豇豆胰蛋白酶抑制剂( ΧπΤΙ)基因 ∀
t1u 毛白杨转材料 毛白杨优良无性系 tu{x易县雌株( Ποπυλυστοµεντοσα)和毛新杨 ≅毛白杨( Π. το2
µεντοσα ≅ Π. βολλεανα) ≅ Π. τοµεντοσα杂种 ∀试管苗在附加 y ) …„s1x °ªr和 Œ…„s1t °ªr的培养基
上继代 ∀
t1v 农杆菌培养 将根农杆菌 ³…¬±8 ≥≤Ž划于含 xs °ªr利福霉素kµ¬©l !xs °ªr卡那霉素k®°l的
≠ ∞…平板上 o置于 u{ ε 恒温培养箱培养 u§∀从平板上挑取单菌落 o加入含µ¬©kxs °ªrl !®°kxs °ªrl
的液体培养基中 ou{ ε t{s ∗ ussµr°¬±振荡培养过夜 ∀次日早晨取 s1{ ∗ t °菌液加至 us °新鲜
≠ ∞…培养基中 o不加抗生素 o加入 usˏ乙酰丁香酮 o使其终浓度为 xss °²¯r继续振荡培养 v ∗ x«∀
菌液 ’⁄yss约 s1v ∗ s1y左右 o可用于转化 ∀
t1w 叶盘法转化杨树 在无菌条件下 o取生长健壮的无菌苗叶片 o切成 s1x¦° ≅ s1x¦° ∗ t1s¦° ≅ t1s
¦° o预培养 t ∗ u§∀然后在稀释的菌液中浸染 ts ∗ us °¬±∀取出叶片切块 o用无菌滤纸吸干后 o转入覆
有一层无菌滤纸的共培养培养基k  ≥附加 y2…„ !Œ„„ !× 各 s1ux °ªrl上于 ux ε 下暗培养 u ∗ v§∀
转化叶片移入选择培养基k共培养培养基补加 ®°vs °ªr和头孢霉毒 xss °ªrl上 o暗培养 z ∗ ts§
后 o移至光照 ty«!温度 ux ε 下培养 ∀每次实验设 u种对照 o≤Žs为在相同条件下不接种菌液的外植体
在不含抗生素的培养基上 o≤Žt为在相同条件下不接种菌液的外植体在含抗生素的培养基上 ∀将获得
的转化芽切下和对照未转化芽同时接种在生根培养基ktru  ≥附加Œ…„s1u °ªr!®°xs °ªrl上 o进行
生根培养 o培养条件为光照 ty«!温度 ux ε ∀当转化植株长至 x ∗ ts¦°时移栽 ∀
t1x 分子检测 采用 ≤ × „…法提取转化植株和对照植株 ⁄‘„ o进行 °≤ • 及 °≤ • p ≥²∏·«¨µ±检测 ∀
°≤ • 鉴定采用常规方法进行 o所使用引物为 }
x.端引物 }x. ) „„„„× Š„„Š„Š≤ „≤≤ „× ≤ × × ≤ v.
v.端引物 }x. ) ≤ × × „≤ × ≤ „× ≤ „× ≤ × × ≤ „× ≤≤ v.
电泳检测扩增结果 ∀将 °≤ • 产物的电泳胶切下转膜 o按 ≥²∏·«¨µ±程序进行杂交 ∀
2 结果与分析
u1t 毛白杨再生系统的建立 为了保证植物遗传转化的成功 o就要有完整而有效的转化系统 ∀实验
首先研究了毛白杨叶片的分化能力 o结果发现分化能力较好的毛白杨无性系再生芽存在玻璃化现象 o
不同无性系间玻璃化程度有一定差别 o其中以毛新杨 ≅毛白杨最为严重 o高达 {s h以上 ∀玻璃化苗幼
芽透明 o呈水浸状 o脆弱易碎 o整株肿胀 o这种苗生根困难 o移栽很难成活 ∀为了获得正常转化植株 o首
先研究了影响毛白杨玻璃化的因素 o基本解决了再生芽玻璃化问题 o建立了简单高效的再生系统 ∀
u1u 转化和转化植株的获得 由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶( νπτΙΙ)基因 o因
此以卡那霉素为筛选试剂选择转化细胞 ∀为了确定毛白杨对卡那霉素的本底抗性 o将均匀一致的叶切
块分别接种于含 s ox ots ous ovs oxs ozs otss °ªr®°的分化培养基上 o每皿 y个外植体 o进行了叶片对
®°抗性的临界浓度试验 ∀培养 xs§后进行统计 ∀结果表明 o低浓度的卡那霉素即抑制叶片产生不定
芽 ∀在不含 ®°的对照培养基上 o|y1y h的外植体产生大量丛生芽 ∀在含 ®°x °ªr和 ts °ªr的培
养基上 o虽然产生少量不定芽 ous§左右这些芽变黄 o死亡 ∀当 ®°浓度大于 us °ªr时 o叶片既不分化
出芽也不产生愈伤 ∀故 ®° us °ªr即可作为临界浓度选择转化细胞 ∀本实验以 vs °ªr或 xs °ªr
的卡那霉素筛选抗性芽 ∀
通常未浸染的对照外植体k≤Žl接种在不含卡那霉素的培养基中 o暗培养 ts ∗ tu§后有小量淡黄
色愈伤产生 o移至光下继续培养 us ∗ vs§o有大量健壮不定芽产生 ∀而经过预培养细菌感染进行共培养
和选择培养的外植体 o暗培养 ts ∗ tu§基本上没有愈伤产生 o叶片由深绿转成淡黄 o移至光下继续培
养 o大多数外植体逐渐黄化死亡 o极少量外植体产生小量愈伤或不产生愈伤直接分化出小芽k图 tl ∀未
经细菌感染的外植体在选择培养基上培养一段时间变黄死亡 ∀
获得的抗性小芽连同外植体一起转至含 ®°xs °ªr的筛选培养基上筛选 o约 ts ∗ tx§待芽长至 u
∗ v¦°时 o再切下移至含 ®°xs °ªr的生根培养基中 ∀在第 u次筛选中 o真正具卡那抗性的小芽可长
大 o部分假阳性植株被淘汰 ∀将对照植株和卡那抗性芽或枝芽接种于含有 ®°xs °ªr的同一 Š„z盒
子中 o对照植株在选择压力下生长一段时间 o叶片逐渐变黄 o根本不能生根 o最后完全死亡 o而转化植株
约 tx§左右生出根 o发育成完整的再生植株k图 ul ∀有些抗性芽移至生根培养基中并不生根 o慢慢长
ztt 专刊 t 郝贵霞等 }转 ΧπΤΙ 基因毛白杨的获得
大 o叶片略黄 o也不死亡 o在基部形成较多愈伤 o这种植株亦作为假阳性个体淘汰 ∀
图 t 选择培养基上卡那霉素抗性芽的获得 图 u 选择培养基上卡那霉素抗性芽生根
ƒ¬ªqt ’¥·¤¬±¨ §²©·µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²· ƒ¬ªqu • ²²·¨§²©·µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²·
转化的毛白杨叶片切块在选择分化培养基k®° xs °ªrl上 o培养 x
周分化出芽 ∀ ×µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²·¶©²µ°¤·¬²± ©µ²° ¬±©¨¦·¨§ ¬¨³¯¤±·¶¬±
·«¨ ° §¨¬∏° º¬·«xs °ªr®¤±¤°¼¦¬±q
在 tru  ≥附加 ®° xs °ªr对照k左lw周后变黄变白直至死亡 ~转
化芽k右l生根形成完整再生植株 ∀Œ± ·«¨ µ²²·¬±ª ° §¨¬∏° º¬·«xs
°ªr®¤±¤°¼¦¬±·«¨ ∏±·µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²··∏µ±¨ §º«¬·¨¤±§§¬¨§k¨©·l
º«¬¯¨ ·«¨ ·µ¤±¶©²µ° §¨¶«²²·µ²²·¨§k•¬ª«·l
u1v 转化植株移栽 生根植株生长很快 ot个月
左右可长至 z ∗ {¦° o将这些植株编号 o切成数段进
行快速繁殖 o来源于同一植株的切段编号相同 o这
些植株长大后可移栽至花盆中 ∀在实验中发现 o
未经转化的对照植株 o无论是直接移栽到蛭石中
还是营养土中 o都较容易成活 o成活率达 |s h 以
上 ∀而转化植株的移栽则较为困难 o挑选生长健
壮 !根系发达的转化植株进行移栽 o无论是在蛭石
中还是营养土中 o植株 t周左右萎蔫死亡 ∀经过
实验 o先在 trts  ≥营养水中培养转化植株 o待其
生出大量白色根后再进行移栽 o成活率可达 zs h
以上 ∀现已经将 us 个转化株系移栽成活 ∀田颍
川等k王 伟 ot||{l研究同样表明 o转抗虫基因的
欧洲黑杨再生植株从培养瓶中转到土壤中的存活
率只有 ux h ∗ vs h ∀转基因植株移栽成活率高低
是得到大量转基因植株的一个重要环节 o提高其
成活率是十分重要的 ∀
u1w 转化植株 °≤ • 扩增和 °≤ •2≥²∏·«¨µ±杂交
取转 ΧπΤΙ 卡那抗性植株 o提取植物基因组 ⁄‘„ o
图 v 转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因卡那霉素抗性植株 °≤• 检测
ƒ¬ªqv °≤ • ¤¶¶¤¼ ²©≥≤Žª¨ ±¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
 ³Š∞2z½©k n lr‹¤¨ ¶ ¤µ®¨µ~„ 阳性对照 ³…¬±8≥≤Ž质粒 ~…阴
性对照非转化植株 ~≤ ) Š ®°µ植株 q q³Š∞2z½©k n lr‹¤¨ ¶ ¤µ®2
µ¨~„ ³…¬±8≥≤Ž³¯¤¶°¬§ ⁄‘„ ¤¶³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~… ˜·µ¤±©²µ° §¨ ³¯¤±·
¶¤°³¯¨¤¶±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~≤ p Š}×µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶¤°³¯ ¶¨q
以质粒 ³…¬±8 ≥≤Ž作阳性对照 o以未转基因植株作为阴性对照 o进行 °≤ • 扩增 ∀结果如图 v !w所示 o未
转化植株基因组未出现 °≤ • 扩增片段 ∀转基因的植株经 °≤ • 扩增 o得到一条和预期长度一样大小的
wxs¥³的片段 o有的样品除目的带外 o还扩增出了非特异带 o而未转化植株基因组未出现 °≤ • 扩增片
段 ov次重复结果一致 ∀其原因可能是外源 ⁄‘„插入过程中发生基因重组或多拷贝插入造成的 ∀
为了进一步证明 °≤ • 扩增产物是目的基因片段 o将 °≤ • 扩增产物电泳后吸印于尼龙膜上 o以阳性
{tt 林 业 科 学 vy卷
质粒扩增产物为探针 o进行 °≤ •2≥²∏·«¨µ±杂交检测 o结果见图 v !w oΧπΤΙ 转基因株的 °≤ • 阳性植株的
°≤ • 扩增产物目的带显示出较强信号 o非特异带没有显示杂交信号 o对照非转化植株没有显示信号 o说
明 ΧπΤΙ 基因已整合到杨树基因组中 ∀
图 w 转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因卡那霉素抗性植株 °≤ •2≥²∏·«¨µ±检测
ƒ¬ªqw °≤ • ≥²∏·«¨µ± ¤¶¶¤¼ ²©≥≤Žª¨ ±¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
„ q阳性对照 ³…¬±8 ≥≤Ž质粒 ~…阴性对照非转化植株 ~≤ ) ®°µ植株 q„ q³…¬±8 ≥≤Ž³¯¤¶°¬§ ⁄‘„ ¤¶³²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯ ~…q˜±·µ¤±¶©²µ° §¨
³¯¤±·¶¤°³¯¨¤¶±¨ ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ ~≤2}×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶¤°³¯ ¶¨q
3 讨论
本实验将经过修饰的 ΧπΤΙ 基因导入毛白杨 o由于蛋白酶抑制剂抗虫谱广且害虫不易产生耐受
性 o为获得不仅抗鳞翅目害虫同时也抗鞘翅目害虫的毛白杨打下了基础 ∀实验经过严格筛选获得了大
量转基因植株 o并发现转基因植株经过水培养一段时间再移栽至花盆 o大大提高了成活率 o不仅为进一
步筛选抗虫效果较好的工程植株提供了条件 o也为其他转基因植物的移栽提供了借鉴 ∀转基因杨树的
抗虫鉴定目前正在进行之中 o结果将于另文报道 ∀
参 考 文 献
陈 颖 o韩一凡 o李 玲等 q苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因转化美洲黑杨的研究 q林业科学 ot||x ovtkul }|z ∗ tsv
郝贵霞 o朱 祯 o朱之悌 q毛白杨叶片组培再生芽的玻璃化问题探讨 q北京林业大学学报 ot||| outktl }y{ ∗ zt
刘春明 o朱 祯 o周兆斓等 q豇豆胰蛋白酶抑制剂在大肠杆菌中的克隆与表达 q生物工程学报 ot||v o| }txu ∗ txz
刘春明 o朱 祯 o周兆斓等 q豇豆胰蛋白酶抑制剂抗虫转基因烟草的获得 q科学通报 ot||u ovzkt{l }ty|w ∗ ty|z
田颖川 o李太元 o莽克强等 q抗虫转基因欧洲黑杨的培育 q生物工程学报 ot||v o|kwl }u|t ∗ u|z
王学聘 o韩一凡 o戴莲韵等 q抗虫转基因欧美杨的培育 q林业科学 ot||z ovvktl }y| ∗ zw
王 伟 o朱 祯 o邓朝阳等 q陆地棉栽培品种新陆早 t号转基因抗虫植株的获得 q高技术通讯 ot||{ o{kxl }t ∗ x
‹¬¯§¨µ∂ „ oŠ¤·¨«²∏¶¨ „  • o≥«¨ µ¨°¤± ≥ ∞ ετ αλ. „ ±²√¨¯ ° ¦¨«¤±¬¶° ²©¬±¶¨¦·µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¨§¬±·²·²¥¤¦¦²q‘¤·∏µ¨ ot|{z ovvs }tys ∗ tyv
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