全 文 ：园艺学报，2016，43 (6)：1089–1098.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0231；http：//www. ahs. ac. cn 1089
收稿日期：2016–03–31；修回日期：2016–06–13
基金项目：‘十二五’国家科技支撑计划课题（2013BAD19B07）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenjianye@scau.edu.cn）
菜薹叶片衰老相关转录因子 BrWRKY75 的特
性分析
谭小丽，范中奇，李露露，吴 亚，邝健飞，陆旺金，陈建业*
（华南农业大学园艺学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南方园艺产品保鲜教育部工程研究中
心，广东省果蔬保鲜重点实验室，广州 510642）
摘 要：以菜薹[Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）Mokino var. utilis Tsen et Lee]为材料，克隆得到
1 个 WRKY 转录因子，命名为 BrWRKY75。氨基酸序列比对及进化树分析发现 BrWRKY75 与拟南芥的
WRKY75 同源性较高，且同属于第Ⅱ类 c 亚族。实时荧光定量 PCR 表明 BrWRKY75 在菜薹叶片衰老过程
中表达明显增强。亚细胞定位和转录活性分析显示 BrWRKY75 定位于细胞核，是一种核蛋白，并且具有
转录抑制活性。体外凝胶阻滞试验（EMSA）证实 BrWRKY75 能与 W-box（TTGAC）元件特异结合。上
述结果为进一步研究菜薹叶片衰老的转录调控机制奠定了基础。
关键词：菜薹；叶片衰老；WRKY 转录因子；转录调控
中图分类号：S 634.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）06-1089-10

Molecular Characterization of a Transcription Factor BrWRKY75 Related
to Leaf Senescence of Chinese Flowering Cabbage
TAN Xiao-li，FAN Zhong-qi，LI Lu-lu，WU Ya，KUANG Jian-fei，LU Wang-jin，and CHEN Jian-ye*
（State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Engineering Research Center of
Southern Horticultural Products Preservation，Ministry of Education，Guangdong Key Laboratory for Postharvest Science，
College of Horticultural Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）
Abstract：In the present work，a WRKY transcription factor，termed BrWRKY75 was isolated from
Chinese flowering cabbage. Analysis of deduced amino acid sequence and phylogenetic tree found that
BrWRKY75 showed high homology with Brassica oleracea WRKY75 and Arabidopsis thaliana
WRKY75，and belong to Ⅱ c sub-group. Real-time quantitative PCR displayed that BrWRKY75 was
up-regulated during leaf senescence of Chinese flowering cabbage. Sub-cellular localization and
transcriptional activity analysis revealed that BrWRKY75 is a nuclear protein with transcriptional
repression activity. In addition，electrophoretic mobility shift assay（EMSA）confirmed that BrWRKY75
directly bound to the W-box（TTGAC）cis-element. Taken together，these results provide basis for the further
investigation of the transcriptional regulation mechanism of Chinese flowering cabbage leaf senescence.
Key words：Chinese flowering cabbage；leaf senescence；WRKY transcription factor；transcriptional
regulation

Tan Xiao-li，Fan Zhong-qi，Li Lu-lu，Wu Ya，Kuang Jian-fei，Lu Wang-jin，Chen Jian-ye.
Molecular characterization of a transcription factor BrWRKY75 related to leaf senescence of Chinese flowering cabbage.
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研究发现，植物衰老过程受到多种内外源因子的调控和遗传程序的严格控制，其中转录因子是
近些年报道的一类影响叶片衰老的重要调控因子（Koyama，2014；张艳军 等，2014；Schippers，
2015）。拟南芥叶片衰老转录组学的分析表明，96 个转录因子在叶片衰老过程中呈现明显的上调表
达，这些转录因子属于大约 20 个不同的转录因子家族，包括 NAC、WRKY 和 AP2/ERF 等（Guo et
al.，2004）。
WRKY 是植物所特有的一类转录因子，因其序列含有 1 个或 2 个 WRKYGQK 结构域而得名，
同时还有 1 个由 60 个氨基酸组成的锌指结构（Rushton et al.，2010）。WRKY 转录因子参与植物众
多生长发育和生理进程，如种子和叶片形成、叶片衰老、激素信号转导以及逆境胁迫响应等（Chen
et al.，2012；Bakshi & Oelmüller，2014；Banerjee & Roychoudhury，2015）。在拟南芥、水稻和棉花
等作物中均发现多个调控叶片衰老的 WRKY 转录因子，它们对植物叶片衰老起到正向或负向的调
控作用（Zentgraf et al.，2010；Besseau et al.，2012；Koyama，2014）。目前，关于 WRKY 转录因
子与叶菜类蔬菜叶片衰老的关系报道较少。
菜薹[Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）Mokino var. utilis Tsen et Lee]集叶、茎和花于一体作为
食用产品，采后由于较强的呼吸及蒸腾作用等，叶片很快衰老黄化，产品失去商品价值。前人对菜
薹采后衰老及其保鲜措施进行了相关研究，包括采后外观和营养品质的变化，呼吸与乙烯生成的变
化规律，SOD 和 POD 等酶活性的变化，叶绿素降解相关酶活性及相关基因表达，以及气调贮藏、
辐射处理、保鲜袋包装、1-MCP 结合 GA 处理、SA 功能类似物苯并噻重氮（BTH）处理等采后保
鲜技术措施等（黄曲英 等，2009；王光 等，2009；姜晓阳 等，2011；Zhang et al.，2011；Wang et
al.，2014）。但目前对菜薹采后叶片衰老的分子机制的认识仍十分有限。本研究从菜薹中分离获得
了 1 个与叶片衰老相关的 WRKY 转录因子，命名为 BrWRKY75，并对其基因表达、亚细胞定位、转
录活性和 DNA 结合等特性进行了初步分析，以期为后续研究 WRKY 转录因子调控菜薹采后叶片衰
老的机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
试验所用菜薹品种为‘四九’，于 2015 年 11 月 25 日采于广州从化市郊街光联村农场大棚。采
收后立即采用冷藏车运送至华南农业大学园艺学院，挑选茎薹饱满，均匀一致，健康且花蕾未开放
的菜薹分装到塑料筐中（每筐 20 株），用 0.4 mm 厚的低密度聚乙烯薄膜袋包装后置于 15 ℃的恒温
箱中贮藏。于贮藏 0、1、3、5 和 7 d 时取菜薹从茎基部开始往上数第 2 片叶片，液氮速冻后保存在
–80 ℃冰箱中备用。
1.2 基因分离和序列分析
采用 Trizol 法提取菜薹叶片总 RNA。
根据本课题组已获得的菜薹采后叶片衰老差异基因表达谱，挑选了 1 个表达上调的 WRKY 转
录因子基因，命名为 BrWRKY75。设计引物进行全长扩增，所用引物（表 1）全部由生工生物工程
（上海）股份有限公司合成。经 PCR 扩增、连接、转化 DH5α 后，将鉴定为阳性的克隆送广州英潍
捷基生物技术有限公司测序。
利用 ExPASy 在线工具（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）对 BrWRKY75 编码的蛋白质
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菜薹叶片衰老相关转录因子 BrWRKY75 的特性分析.
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进行氨基酸基本特性分析。在 NCBI 的 Blast（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/blast）进行 BrWRKY75
的同源性检索和相似性比对。利用 Clustal X1.83 和 Genedoc 以及 DNAMAN 软件进行不同物种间同
源基因的氨基酸序列比对，并结合 MEGA5.0 软件构建系统进化树。
1.3 实时荧光定量 PCR 分析
根据 BrWRKY75 基因的全长序列设计荧光 PCR 引物（表 1），并选取 BrAct1（基因登录号
ABS70449.1）作为内参基因。提取各样品的总 RNA，合成 cDNA 第一链。按 TaKaRa（SYBR○R Premix
Ex TaqTMⅡ）配制 PCR 体系，荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad CFX9600）进行实时定量荧光 PCR 检测，
反应程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，40 个循环。
测定其 Ct 值，用 F = 2-ΔΔCT 计算各样品 BrWRKY75 的相对表达量。

表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物用途
Primer usage
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
内切酶
Restriction
enzyme
全长扩增
Full-length amplification
BrWRKY75 F：ATGGAGGGATATCAAAATGGATCGTC
R：TTAATTAAAAGAAGAGTAG

BrAct1 F：GGTATTGTAAGCAACTGGGATGAC
R：GCGACATACATAGCAGGGACAT
实时荧光定量 PCR
Real-time quantitative
PCR BrWRKY75-RT F：AGGTCGATTCCACAATTAGTTAGGA
R：CTCCTTGATGGAACTCCAATTTAG

转录活性分析
Transcriptional activity assay
BrWRKY75-PBD F：TCGCCGACCGGTAGGCCTATGGAGGGATATCAAAATGGATCGTC
R：AACCAGAGTTAAAGGCCTTTAATTAAAAGAAGAGTAGATTTGC
StuⅠ
亚细胞定位
Sub-cellular localization
BrWRKY75-GFP F：TTCTGCCCAAATTCGCGATGGAGGGATATCAAAATGGATCGTC
R：TAGTCATACCGGTCGCATTAAAAGAAGAGTAGATTTGC
NruⅠ
原核表达
Prokaryotic expression
GST-BrWRKY75 F：GGTTCCGCGTGGATCCATGGAGGGATATCAAAATGGATCGTC
R：AGTCACGATGCGGCCGC TTAATTAAAAGAAGAGTAGATTTGC
BamHⅠ
NotⅠ

1.4 亚细胞定位
所用载体为带绿色荧光蛋白（GFP）的 pEAQ[英国 George P. Lomonossoff 博士（Department of
Biological Chemistry，John Innes Centre，Norwich Research Park）惠赠]。根据 BrWRKY75 基因的全
长和载体图谱设计定位引物（表 1）。获得正确的阳性克隆后，经 NruⅠ单切酶切出与目的基因两端
相同的粘性末端，用 T4 DNA 连接酶连接到 pEAQ 载体从而得到 BrWRKY75-GFP 融合表达载体，
转入 DH5α，PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。
农杆菌侵染法转化烟草叶片（Sainsbury et al.，2009）：CaCl2 法制备农杆菌 GV3101 感受态细胞，
把 1 μL pEAQ 空载（正对照）与 BrWRKY75-GFP 等 2 种质粒各加入 50 μL 农杆菌感受态菌液中，
电穿孔仪电转法进行转化；挑取农杆菌单菌落分别置于含卡那霉素（50 mg · L-1）和庆大霉素（40
mg · L-1）的 YEB 液体培养基中，于摇床中 28 ℃ 200 r · min-1 24 ~ 36 h，PCR 鉴定阳性克隆。将阳
性克隆农杆菌单菌液培养至 OD600 nm = 0.8 ~ 1.0，10 000 r · min-1 离心 1 min，收集菌体，用侵染缓冲
液（10 mmol · L-1 MES-KOH，10 mmol · L-1 MgCl2，0.1 mmol · L-1 乙酰丁香酮）重悬菌体至 OD600 nm
为 0.5 ~ 0.6，室温静置 4 h 后将重悬菌液注射到本式烟草（Nicotiana benthamiana）叶片背面，培养
室培养 2 d 后，取约 1 cm2 的叶片材料在荧光显微镜（Zeiss Axioskep 2 Plus）下观察 GFP 信号并拍
照记录。
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图 1 菜薹 BrWRKY75 基因 ORF 序列 PCR 扩增产物电泳图
Fig. 1 PCR amplification of ORF sequences of BrWRKY75 gene in
Chinese flowering cabbage
1.5 转录活性分析
在新西兰植物与食品研究所开发的含双荧光素酶的 pGreenⅡ 0800-LUC 载体（Hellens et al.，
2005）的基础上，将连续 5 个 GAL4 序列和 TATA 序列插入到萤火虫荧光素酶（LUC）前面作为本
试验要用的报告基因载体，而在同一个载体上的由 35S 驱动的海肾荧光素酶（REN）作为内参。
GAL4BD 序列和 BrWRKY75 的全长序列经 PCR 扩增分别重组到 pEAQ 载体上作为本试验要用效应
基因载体。载体构建引物序列见表 1。
用农杆菌侵染法，将报告基因和效应基因质粒共侵染烟草叶背面，培养 2 d 后用双荧光素酶检
测试剂盒（Promega 公司）测定烟草叶片的 LUC 和 REN 活性。测定仪器为化学发光光度计（Thermo
公司），参考试剂盒说明书进行操作。转录活性用 LUC 和 REN 活性比值表示，每个组合重复 6 次。
1.6 凝胶阻滞分析（EMSA）
原核表达与蛋白纯化：参照 Shan 等（2014）的方法，限制性内切酶 NotⅠ和 BamHⅠ双酶切测
序正确的 pGEM-BrWRKY75 质粒，回收目的片段，将 BrWRKY75 构建到经过同样酶切并含有 GST
标签的 pGEX-4T-1 表达载体上，并转化大肠杆菌 BL21（DE3）细胞。1.0 mmol · L-1 IPTG 诱导目的
蛋白表达。采用 Glutathione Sepharose 4B（GE 公司）GST 亲和层析柱纯化表达的 GST-BrWRKY75
融合蛋白。纯化后的蛋白用 10% SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
EMSA 分析：合成含有 2 个串连 W-box（TTGAC）的 DNA 序列（Pr：GGAACTTGACCTTGAC
CTTAGGGCTGCAGGAATTCG ）和突变序列（ mPr ： GGAACTTGAACTTGACTTAGGGCTGC
AGGAATTCG）及其反向互补序列等 2 个 DNA 探针。每个探针的每对引物按 1︰1 的比例将 2 条反
向互补的 DNA 序列混合，100 ℃变性 10 min，逐渐冷却至室温即合成双链 DNA，用地高辛对 2 个
探针进行末端标记，采用 EMSA 试剂盒（Thermo 公司），参照 Shan 等（2014）的方法进行 EMSA，
分析纯化后的 BrWRKY75 蛋白与 W-box 元件的结合情况。
2 结果与分析
2.1 菜薹 BrWRKY75 克隆与序列比对
根据本课题组前期构建的菜薹叶片衰老的
数字基因表达谱，从中挑选了 1 个在衰老过程
中表达较明显上调（约 3.08 倍）的 WRKY 转
录因子，名为 BrWRKY75。以菜薹叶片 cDNA
为模板进行 RT-PCR 扩增，获得与预期最大开
放阅读框（ORF）长度（450 bp）基本一致的
目的条带（图 1），经测序获得其全长序列。
BrWRKY75 的 ORF 长 444 bp，编码 1 个由 147
个氨基酸组成，分子量为 17.083 kD、等电点为
9.65 的多肽蛋白链。在 NCBI 进行 Blast 同源性
分析，结果表明：BrWRKY75 蛋白与拟南芥
AtWRKY75（AED91848.1）的同源性为 88%。氨基酸比对表明，BrWRKY75 含有 1 个 WRKY 保守
结构域和 1 个 Cx4-5Cx22-23HxH 型的锌指结构（图 2），因此属于 WRKY 转录因子家族的第Ⅱ类成员。
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图 2 菜薹 BrWRKY75 与其他植物 WRKY 蛋白氨基酸比对
At：拟南芥；Bo：甘蓝；Sl：番茄。方框和*分别表示 WRKY 结构域和锌指结构。
Fig. 2 Alignment of the predicted WRKY proteins between Chinese flowering cabbage and other plant species
At：Arabidopsis thaliana；Bo：Brassica oleracea；Sl：Solanum lycopersicum；
Box and asterisks indicate the WRKY domain and zinc finger-like motif respectively.

利用 MEGA5.0 对 BrWRKY75 和其他物种的 WRKY 构建系统进化树。结果表明，植物 WRKY
可以分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ类，其中第Ⅱ类又分为 a ~ e 等 5 个亚族；BrWRKY75 与拟南芥的 AtWRKY75、
AtWRKY44 和番茄 SlWRKY13 等亲缘关系较近，它们均含有 1 个 WRKY 保守结构域，同属于第Ⅱ
类 c 亚族（图 3），这进一步说明 BrWRKY75 属于 WRKY 转录因子家族的第Ⅱ类 c 亚族成员。


















图 3 菜薹 BrWRKY75 与其他植物 WRKY 蛋白家族的进化关系
BrWRKY75 蛋白用“●”标出；At：拟南芥；Sl：番茄；Os：水稻。
Fig. 3 The phylogenetic tree of Chinese flowering cabbage BrWRKY75 protein and other plants WRKY proteins
BrWRKY75 is indicated by black dot；At：Arabidopsis thaliana；Sl：Solanum lycopersicum；Os：Oryza sativa.
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图 4 菜薹叶片衰老过程中 BrWRKY75 的表达
Fig. 4 Expression level of BrWRKY75 during leaf senescence of
Chinese flowering cabbage
2.2 菜薹叶片衰老过程中 BrWRKY75 的定量
表达分析
为进一步确定 BrWRKY75 与采后菜薹叶
片衰老的关系，利用实时荧光定量 PCR 技术分
析了 BrWRKY75 在 15 ℃贮藏温度下的菜薹叶
片 衰 老 过 程 中 的 表 达 特 征 ， 结 果 显 示
BrWRKY75 随着叶片衰老进程而表达增强，至
贮藏 5 和 7 d，分别为贮藏 0 d 时的 3.8 倍和 8.5
倍（图 4），表明 BrWRKY75 与采后菜薹叶片
衰老有一定关系。
2.3 BrWRKY75 蛋白的亚细胞定位
如图 5 所示，与整个细胞都发光的阳性
GFP 对照相比，BrWRKY75-GFP 的融合蛋白
只在烟草叶片表皮细胞的细胞核里观察到绿色荧光，表明 BrWRKY75 定位于细胞核，是核蛋白，
这与转录因子是核定位的特征一致。















图 5 菜薹 BrWRKY75 蛋白在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位
Fig. 5 Sub-celluar localization of BrWRKY75 in tobacco leaf epidermis cells
2.4 BrWRKY75 的转录活性分析
利用双荧光素酶报告基因分析系统，通过在烟草叶背面瞬时表达来测定 BrWRKY75 的转录活
性。将全长 BrWRKY75 构建到效应基因载体上（pBD-BrWRKY75），以空 GAL4BD 为对照（pBD），
报告基因和效应基因两个载体系统（图 6）共转到烟草叶背面瞬时表达后，测定 2 个报告基因表达
后发生的荧光量比值（LUC/REN）来反映 BrWRKY75 的转录活性。结果（图 7）表明，与含 BrWRKY75
的效应基因载体共转后，LUC/REN 明显低于对照，仅为对照的 34.5%，说明 BrWRKY75 具有转录
抑制活性，可能是 1 个转录抑制子。
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图 7 相对 LUC 荧光酶活性与 REN 荧光酶活性比值代表的
BrWRKY75 转录活性
Fig. 7 Transcriptional activity of BrWRKY75 as revealed
by relative LUC/REN ratio











图 8 菜薹 BrWRKY75 原核表达和蛋白纯化的 SDS-PAGE 分析
M：蛋白质 marker；1：GST 空载体；2：GST-BrWRKY75 经 IPTG 诱
导 4 h；3：纯化 GST-BrWRKY75。
Fig. 8 SDS-PAGE analysis ofprokaryotic expressed- and
purified-BrWRKY75 protein
M：Protein marker；1：GST empty；2：GST-BrWRKY75 induced by IPTG
for 4 h；3：Purified GST-BrWRKY75.

图 6 菜薹 BrWRKY75 转录活性分析中用到的载体
Fig. 6 Vectors used in the assay of transcriptional activity of BrWRKY75
2.5 凝胶阻滞分析 BrWRKY75 蛋白与 W-box
元件的结合
转录因子通过 DNA 结合功能域与下游目
标基因启动子上的顺式元件结合来激活或抑制
基因的表达。WRKY 通过结合靶基因启动子区
域的 W-box 元件[（C/T）TGAC（C/T）]而调
节靶基因的表达（Rushton et al.，2010）。为了
确定 BrWRKY75 是否可以结合 W-box 元件，
首先对 BrWRKY75 基因的原核表达和蛋白纯
化进行了分析。结果如图 8 所示，与转化空载
体 pGEX-4T-1 的大肠杆菌 BL21 相比，含有
BrWRKY75 重组质粒的大肠杆菌 BL21 经
IPTG 诱导后产生大量分子量约为 41 kD 的表
达产物，与预期的 GST-BrWRKY75 融合蛋白
大小一致，证明 BrWRKY75 在该表达系统获
得了正确表达。通过 GST 亲和层析柱纯化后，
获得较为清晰的 GST-BrWRKY75 融合蛋白条
带。在其下方有 2 条带，可能为融合蛋白降解
形成。纯化后的 GST-BrWRKY75 融合蛋白可
用于后续凝胶阻滞分析试验（EMSA）。
利用 EMSA 分析了 BrWRKY75 蛋白结合
合成的生物素标记的含 2 个串联重复的 W-box
元件（ TTGAC ） GGAACTTGACCTTGACC
TTAGGGCTGCAGGAATTCG（Biotin-Pr，生
物素标记的原始探针）及突变的 W-box 元件
GGAACTTGAACTTGAACTTAGGGCTGCAG
GAATTCG（mPr，生物素标记的突变探针）情
况。结果表明，GST-BrWRKY75 融合蛋白能结
合到含 W-box 元件的 Biotin-Pr 上，随着竞争性
探针（Cold-Pr，未作生物素标记的同序列）的加入和浓度的增加，结合条带逐渐变弱；但是加入突
变 W-box 元件的 mPr，结合条带没有发生明显变化（图 9）。这些结果说明 BrWRKY75 在体外能够
特异地结合 W-box 元件。
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图 9 BrWRKY75 蛋白与 W-box 元件的结合凝胶阻滞分析
Biotin-Pr：生物素标记的原始探针；mPr：生物素标记的突变探针；Cold-Pr：未作生物素标记的竞争探针
虚线箭头表示 BrWRKY75 蛋白结合 W-box 的复合体；实线箭头表示表示自由探针。
Fig. 9 The binding of BrWRKY75 with W-box cis-element analyzed by EMSA
Biotin-Pr：Biotin labeled probe：mPr：Biotin labeled mutant probe：Cold-Pr：Unlabeled competitor probe
The dashed and solid arrows indicate BrWRKY75-DNA complex and free probe respectively.

3 讨论
在本研究中，从菜薹中克隆了 1 个 WRKY 转录因子，序列分析表明，该蛋白与拟南芥的
AtWRKY75 同源性最高。此外，BrWRKY75 具有 WRKY 转录因子第Ⅱ类 c 亚族的典型特点：含有
1 个 WRKYGQK 结构域和 1 个 Cx4-5Cx22-23HxH 锌指型结构，系统进化树也显示，BrWRKY75 与拟
南芥Ⅱc 亚族的 AtWRKY75、AtWRKY12 和 AtWRKY13 等共同组成一个分支，进一步证实
BrWRKY75 属于Ⅱc 亚族。
近几年，关于 WRKY 转录因子的功能已在多种植物中进行了研究。拟南芥表达谱分析表明
WRKY 转录因子是衰老转录组的第 2 大转录因子家族（Guo et al.，2004）。第 1 个被报道和衰老有
关的是 AtWRKY6，其在拟南芥叶片衰老过程中显著上调（Robatzek & Somssich，2001）。与衰老有
关的 WRKY 转录因子还有拟南芥 AtWRKY53、AtWRKY54、AtWRKY57、AtWRKY70 和 AtWRKY75
等（Zentgraf et al.，2010；Besseau et al.，2012；Jiang et al.，2014），以及水稻 OsWRKY23 与 OsWRKY42
等（Jing et al.，2009；Han et al.，2014）。已有研究报道 AtWRKY75 能正调控拟南芥叶片衰老，当
沉默该基因时表现出延缓叶片衰老的现象（Li et al.，2012），但 AtWRKY75 具体的调控途径还不清
楚。BrWRKY75 的 qRT-PCR 分析表明，该基因在菜薹叶片衰老过程中表达明显增强，推测其有可能
参与调控叶片的衰老。
一般来说，转录因子进入细胞核后才能发挥调控其他基因表达的作用。亚细胞定位分析表明，
BrWRKY75 蛋白定位在细胞核内，与转录因子的核定位特征一致。更为重要的是，转录因子通过
DNA 结合域识别并结合顺式作用元件来实现调控基因表达。WRKY 转录因子主要通过结合下游靶
基因（如 NPR1、病程相关蛋白基因 PR 等）启动子序列中的 W-box 元件来调控靶基因的表达（Rushton
et al.，2010）。本研究中通过 EMSA 试验同样发现，BrWRKY75 蛋白可以结合 W-box 元件。转录因
子结合靶基因启动子后，通过激活域或者抑制域对靶基因表达起激活或抑制作用。目前关于 WRKY
转录因子的转录激活活性已在多种植物中进行了研究。拟南芥 AtWRKY28（van Verk et al.，2011）、
水稻 OsWRKY4（Wang et al.，2015）以及小麦 TaWRKY2 和 TaWRKY19（Niu et al.，2012）等在体
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菜薹叶片衰老相关转录因子 BrWRKY75 的特性分析.
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内都具有转录激活活性，而拟南芥 AtWRKY46（Ding et al.，2013）和水稻 OsWRKY76（Yokotani et
al.，2013）等则都具有转录抑制活性，说明 WRKY 转录因子既可以作为转录激活子，也可以作为
转录抑制子。本研究表明，BrWRKY75 具有转录抑制活性。很有意思的是，通过对拟南芥叶片衰老
有关的 AtWRKY53 的靶基因分析，发现 AtWRKY53 既可以作为转录激活子也可以作为转录抑制子，
通过直接转录激活或者抑制 63 个衰老基因来参与调控叶片衰老过程（Miao et al.，2004）。因此，有
关 BrWRKY75 下游靶基因的筛选鉴定，明确菜薹叶片衰老过程中 BrWRKY75 的转录调控机制，将
是下一步研究的重点内容。

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