全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2306–2314.
Acta Horticulturae Sinica
2306 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0513；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–07–30；修回日期：2015–10–23
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-23）；中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）；
浙江省农业新品种选育重大科技专项（2012C12905）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zengjm@tricaas.com）
茶树硫酸盐转运蛋白基因 CsSUL3.5的克隆与表
达分析
胡玉荣 1，岳 川 1，周 超 2，黄玉婷 1，曹红利 1，郝心愿 1，王新超 1，
曾建明 1,*
（1 中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，杭州 310008；2 西
南大学食品科学学院，重庆 400715）
摘 要：采用电子克隆与 RT-PCR 相结合的方法获得茶树硫酸盐转运蛋白（CsSUL3.5）的 cDNA 序
列，并进行了相关生物信息学分析。克隆到茶树 CsSUL3.5 cDNA 序列 2 017 bp（GenBank 登录号
KP984500），包含完整的开放阅读框（ORF）1 914 bp，编码 637 个氨基酸。生物信息学分析显示，CsSUL3.5
编码的蛋白分子量为 70.38 kD，无信号肽，是疏水性的非分泌蛋白，有 11 个跨膜区；与其他物种相似性
均在 60%以上，与烟草的相似性最高（74%），具有硫酸盐转运蛋白家族典型的保守结构域和空间结构，
属于硫酸盐转运蛋白家族。系统进化分析表明茶树的 CsSUL3.5 属于第 3 亚家族，与芝麻的关系比较近。
荧光定量 PCR 表明该基因在茶树幼苗根与成熟叶中均有表达；Na2SO4 与 Na2SeO4 处理均能显著诱导
CsSUL3.5 的表达。
关键词：茶树；CsSUL3.5；硒；克隆；表达分析
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2306-09

Cloning and Expression Analysis of Sulfate Transporter CsSUL3.5 Gene in
Tea Plant
HU Yu-rong1，YUE Chuan1，ZHOU Chao2，HUANG Yu-ting1，CAO Hong-li1，HAO Xin-yuan1，WANG
Xin-chao1，and ZENG Jian-ming1,*
（1Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center for Tea Improvement/Key
Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization，Hangzhou 310008，China；2College of Food Science，Southwest
University，Chongqing 400715，China）
Abstract：The cDNA of putative sulfate transporter（CsSUL3.5）gene（GenBank accession number
KP984500）was cloned from tea plant[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]. Bioinformatics analysis
indicated that the cDNA of CsSUL3.5 containing 1 914 bp ORF encoded 637 amino acids residues with a
putative molecular mass of 70.38 kD. It was predicted that CsSUL3.5 was a non-secretory protein without
a signal peptide. CsSUL3.5 could be located in the plasma membrane with 11 transmembrane domains.
Further analyses showed that CsSUL3.5 had the typically conserved domain and the highest identity

胡玉荣，岳 川，周 超，黄玉婷，曹红利，郝心愿，王新超，曾建明.
茶树硫酸盐转运蛋白基因 CsSUL3.5 的克隆与表达分析.
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（74%）with Sulfate Transporter 3.5 of Nicotiana sylvestris. The real-time PCR analysis showed that
CsSUL3.5 transcripts were significantly increased upon the treatment of Na2SO4 and Na2SeO4.
Key words：tea plant；CsSUL3.5；selenium；cloning；expression analysis

硒（Se）是 1817 年由瑞典化学家 Berzelius 首先在生产硫酸的尾矿中发现。硒具有增强机体免
疫力、延缓衰老以及抗癌等多种功能，还可有效预防由缺硒引发的大骨节病和克山病等多种疾病（Tan
et al.，2002）。
茶是中国传统饮品，茶树具有较强的富集转化硒的能力，可通过硫酸盐转运等途径将外界非生
物活性和毒性较高的无机硒转化为有机硒（Zhu et al.，2009）。茶叶中有机硒含量占总硒量的 80%（杜
琪珍 等，1991），是一种良好的植物性补硒剂。硒和硫是同一主族元素，硒酸盐和硫酸盐具有相似
的物理化学性质（Wessjohann et al.，2007）。有研究表明，高浓度的硫酸盐在一定程度上抑制拟南
芥对硒酸盐的吸收（White et al.，2004），硫转运蛋白的突变能够影响植物细胞对硒的耐受能力，认
为土壤中的硒酸盐通过硫转运蛋白进入植物细胞（Cherest，1997；Shibagaki et al.，2002；马建辉和
孙梅好，2012）。编码硫转运蛋白的基因首次在柱花草（Stylosanthes hamata）中克隆得到（Smith et
al.，1995），目前在玉米、拟南芥、番茄等多种植物中克隆到多个硫酸盐转运蛋白基因（Bolchi et al.，
1999；Shibagaki et al.，2002；Yoshimoto et al.，2002；Howarth et al.，2003）。已在拟南芥中克隆到
14 个硫酸盐转运蛋白基因，这些基因可划分为 5 个亚家族，前 4 个亚家族基因编码的蛋白具有相似
的结构特点，都有 12 个跨膜结构域，在 C–都含有一个 STAS 保守域（Shibagaki & Grossman，2006）。
植物根系对硒的吸收以硒酸盐为主，研究茶树硫酸盐转运蛋白基因表达特性对了解茶树硒吸收机制
具有重要意义。
本研究中在转录组数据库中筛选出与硫酸盐转运蛋白基因中间片段高度同源的 EST 序列，通过
电子克隆和 RT-PCR 技术克隆得到茶树硫酸盐转运蛋白基因 CsSUL3.5 的 cDNA 序列，并利用生物
信息学方法对 CsSUL3.5 的序列、系统发育和蛋白结构进行分析，研究其在低硫及硒处理后不同阶
段以及不同组织中的表达变化，为该基因的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
以国家级良种‘中茶 108’为材料。选取生长势一致的一年生扦插苗，从试验田中挖出（尽可
能取出茶苗的根），迅速用自来水将根部的泥土清洗干净，在纯净水中适应性通气水培 2 d，移至改
良的缺硫营养液（石元值 等，2013）中通气培养。待茶苗重新长出嫩根后，将其分成 3 组：一组在
原营养液中通气培养，作为对照；另外两组的培养液中分别加入 Na2SeO4 和 Na2SO4，使浓度达到
0.5 mg · L-1。分别在处理 0、12、24、48、72 及 168 h 后，取完整幼根及顶端第 2 ~ 3 片无病虫害的
叶片，样品经液氮速冻后于–80 ℃冰箱保存备用。
1.2 茶树总 RNA 的提取及 cDNA 合成
按照离心柱型植物总 RNA 快速提取试剂盒（Tiangen，北京）说明书的操作步骤提取茶树根及
叶片中的总 RNA。用 NanoDrop2000 微量核酸蛋白测定仪（Pittsburgh，PA，USA）测定 RNA 浓度
及纯度；用 1.0%变性琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。根据测定的浓度，逐级稀释浓度到 500
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ng · μL-1，总 RNA 于–80 ℃冰箱保存备用。
按照逆转录酶 SuperScript Ⅲ的使用说明，以 1 μg 总 RNA 合成 cDNA 用于基因克隆；参照岳川
等（2013）的方法，以每个时间点提取样品的总 RNA 各 1 μg 合成 cDNA，用于基因表达分析检测。
1.3 目的基因的克隆与测序
在转录组数据库中筛选与硫酸盐转运蛋白基因片段同源的片段，将这些序列用 Seqman 软件进
行拼接，初步得到 cDNA 序列。把每个拼接成的序列在 NCBI 中进行 BLASTX 比对，分析序列的完
整性，根据比对结果，以具有全长开放阅读框（ORF）的序列为模板，在其 ORF 上、下游分别设计
特异引物（表 1）进行 PCR 扩增验证。以根的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测
后，用试剂盒（Axygen，USA）进行纯化回收。回收产物连接至 pMD18-T 载体（TaKaRa，大连），
经化学转化法转入大肠杆菌 DH5α（本实验室保存）中，后续克隆参照岳川等（2013）的操作进行。
挑选 3 个阳性克隆进行测序。引物合成及测序由上海华津生物技术有限公司完成。

表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物
Primer
引物序列（5′–3′）
Sequence
用途
Function
CsSUL3.5-S TCTTTAGAAGTTTGCAGCCATGG 开放阅读框上游引物 Forward primer for ORF
CsSUL3.5-A TATATTAATCCTCGCCCCTCTCACC 开放阅读框下游引物 Reverse primer for ORF
CsSUL3.5-qS CATATGGATGGAAACAAGGAGATG 荧光定量上游引物 Forward primer for Real-PCR
CsSUL3.5-qA AGAGGAGCCAAGAACAATAAGG 荧光定量下游引物 Reverse primer for Real-PCR
CsPTB-F TGACCAAGCACACTCCACACTATCG 荧光定量内参基因上游引物 Forward primer of reference gene for Real-PCR
CsPTB-R TGCCCCCTTATCATCATCCACAA 荧光定量内参基因下游引物 Reverse primer of reference gene for Real-PCR

1.4 CsSUL3.5 的生物信息学特征分析
本研究中所用到的其他植物中的氨基酸序列均来自 NCBI 数据库。序列的同源性比对等在 NCBI
数据库中用 BLASTX 工具进行分析；利用 DNAStar 软件包进行序列拼接和开放阅读框的查询；蛋
白质的相对分子量和理论等电点等基本参数在 ProtParam 中预测（Gasteiger et al.，2005）；ProtScale
进行亲水性/疏水性分析；TMHMM 预测蛋白质的跨膜结构；用 SingalP 进行信号肽预测（Bendtsen et
al.，2004）；NetNES1.1 预测蛋白质的亚细胞定位（Cour et al.，2004）；序列经 ClustalX 2.0 比对后，
比对结果在 GenDOC 中输出显示，用 MEGA6.0 构建系统发育树（Tamura et al.，2007）；二级结构
用 GORⅤ进行分析（Sen et al.，2005）；三级结构在 SWISS MODEL 中进行同源模拟（Kiefer et al.，
2009）然后在 PyMol 软件中编辑输出（Combet et al.，2002）。
1.5 CsSUL3.5 的表达分析
以茶树 CsPTB 基因作为内参基因（Hao et al.，2014），依据 CsSUL3.5 的序列，设计特异引物用
于荧光定量 PCR 检测（表 1）。合成的 cDNA 稀释 5 倍用于基因表达检测的模板。荧光定量反应体
系为：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物（10 μmol · L-1）各 0.8 μL，ROX DyeⅡ 0.4 μL，
cDNA 2 μL，加水至终体积 20 μL。按照曹红利等（2015）的方法及程序，在 ABI PRISM 7500 实时
定量 PCR 仪上进行基因表达分析检测。每个样品重复 3 次，共 3 个生物学重复。采用 2-ΔΔCT 法对结
果进行分析。
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2 结果与分析
2.1 CsSUL3.5 cDNA 的克隆
从转录组数据中筛选出相关的基因序列共
36 条，获得 7 个拼接的 contig。通过 BLASTX
比对发现其中 1 个 contig 的序列与其他植物中
的 SULTR3.5 具有较高的同源性，且具有完整
的 ORF 区，中间无缺失等位点，表明其可能编
码茶树 SULTR3.5 的完整氨基酸序列；其他 6
条序列均不编码完整的氨基酸序列。以该序列
为模板，在 ORF 的两端设计引物进行 PCR 扩增（图 1），测序结果显示该片段长 2 011 bp，该序列
与原序列能够较好的拼接。拼接后获得该基因的 cDNA 序列 2 017 bp，其中 ORF 长 1 914 bp，编码
637 个氨基酸（图 2）。根据该序列在 NCBI 中同源比对的结果，将其命名为 CsSUL3.5，并提交 NCBI
GenBank 数据库，登录号：KP984500。


图 2 CsSUL3.5 开放阅读框和推测的氨基酸序列
Gly-Motif 结构域域用灰色阴影标出，起始密码子和终止密码子用方框标出，Sulfate-transp 结构域以斜体标出。
Fig. 2 The open reading frame of CsSUL3.5
The Gly-Motif domain were shaded，the initiator codon and terminator codon were marked in box，and the
Sulfate-transp domain were denoted in italic type.
图 1 茶树硫酸盐转运蛋白基因 CsSUL3.5 RT-PCR 电泳结果
Fig. 1 Result of RT-PCR in CsSUL3.5 gene
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2.2 CsSUL3.5 的相似性及系统发育树分析
将 CsSUL3.5 氨基酸序列进行 BLASTX 同源比对，保守域比对结果显示 CsSUL3.5 中含有硫酸
盐转运蛋白典型的 Sulfate-transp 结构域（第 170 ~ 448 位氨基酸）和 STAS 结构域（第 503 ~ 618 位
氨基酸），并且在 N 端具有 Gly-Motif 功能域（第 57 ~ 139 位氨基酸），它们是植物中硫酸盐转运蛋
白的特征功能域（Shibagaki & Grossman，2006；Alok et al.，2011），说明获得的基因编码一个硫酸
盐转运蛋白。其氨基酸序列与烟草（Nicotiana sylvestris）、葡萄（Vitis vinifera）、甜菜（Beta vulgaris）、
咖啡（Coffea canephora）、甜橙（Citrus sinensis）等物种中的同源序列的相似性均在 70%以上，其
中与烟草的相似性最高，达 74%。
将茶树 CsSUL3.5 与来自拟南芥等多种植物中的硫酸盐转运蛋白构建进化树进行分析（图 3）。
根据拟南芥中的分类（邱睿，2009；Shinmachi et al.，2010），可以看出，植物中硫转运蛋白可以分
为 5 种类型，CsSUL3.5 属于第 3 亚家族。


图 3 茶树硫酸盐转运蛋白与其他植物硫酸盐转运蛋白氨基酸序列的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of SULTRs of C. sinensis and other plants
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图 4 CsSUL3.5 蛋白的三维结构
Fig. 4 3-D structure of CsSUL3.5 protein
2.3 CsSUL3.5 理化性质及特征分析
Protparam 预测显示，CsSUL3.5 的蛋白质分子量为 70.38 kD；理论等电点（pI）为 9.16，其中
含有带负电荷的氨基酸（Asp + Glu）47 个，带正电荷的氨基酸（Arg + Lys）61 个，属于碱性蛋白
质。亮氨酸、异亮氨酸和 Val 等的含量最高，占总氨基酸的比例分别为 10.8%、9.3%和 8.0%。ProtScale
Sever 对 CsSUL3.5 是亲/疏水性进行预测，采用 Hyhob/Kyte & Doolittle 的方法分析显示，最大正值
为 3.167，最小负值为–2.667，表明它是一个疏水性蛋白，这与其转运硫酸盐的作用密切相关。
SingalP 预测显示 CsSUL3.5 无信号肽输出位点，属于非分泌蛋白；TargetP 预测结果显示它不属
于分泌蛋白，且定位在叶绿体和线粒体等亚细胞上的可能性较小。WoLFPSORT 预测结果显示该蛋
白主要定位在质膜上，是一种膜内在蛋白，说明 CsSUL3.5 具有跨膜螺旋结构，可能参与了硫酸盐
在茶树细胞中的跨质膜运输。
进一步用 TMHMM 对它的跨膜螺旋结构域进行预测，结果显示该蛋白具有 11 个跨膜区（TMs），
且这些 TMs 主要集中在靠近 N 端的区域。
2.4 CsSUL3.5 的结构分析
CsSUL3.5 的二级结构预测显示，其主要由
α–螺旋、无规卷曲和延伸链组成，它们分别
占 39.87%、37.05%和 23.08%。SWISS-MODEL
中预测的三级结构显示，CsSUL3.5 含有 14 个
α 螺旋，可能参与跨膜结构的组成；这些 α 螺
旋相互围绕形成一个通道结构，硫酸盐等通过
该通道进行跨膜转运（图 4）。
2.5 CsSUL3.5 在硒酸盐和硫酸盐处理后的表
达模式分析
用荧光定量 PCR 分析了 CsSUL3.5 分别在
0.5 mg · L-1 浓度的 Na2SeO4 和 Na2SO4 处理后的表达模式。在每一个取样时间（0、12、24、48、72
和 168 h），对照处理的茶苗叶片和根系中，CsSUL3.5 的表达量均维持在相对稳定的水平（图 5）。
在根系中，短期内（24 h），Na2SO4 处理能够显著诱导 CsSUL3.5 的表达，与 0 h 相比，12 h 其相对
表达量提高了近 1.5 倍，24 h 的表达提高了 2.5 倍；而在处理后 48 和 72 h 又恢复到与原来相近的水
平，但在 168 h 时的相对表达量提高了近 2 倍。与在 Na2SO4 条件下的表达模式不同，Na2SeO4 处理
短期内（24 h），对 CsSUL3.5 的表达诱导作用没有 Na2SO4 处理明显，延长处理时间至 48 h，表达提
高了 5 倍以上，在 48 到 168 h 逐渐增加，到 168 h 时达到最大，比对照相同时间点的相对表达量提
高了近 9 倍。
在叶片中，Na2SO4 处理能够显著诱导 CsSUL3.5 的表达，12 h 其相对表达量提高了近 1.5 倍；
在处理后 48 和 72 h 其表达受到抑制，但在 168 h 的相对表达量提高了近 2 倍。Na2SO4 处理下，
CsSUL3.5 在根和叶片中的表达具有同步性，在 12 h 内，Na2SeO4 处理对 CsSUL3.5 的表达诱导作用
不显著，但 24 h 的相对表达量提高了 1 倍；延长处理时间至 72 h 又恢复到原来的水平，但在 168 h
时表达量达到峰值，其相对表达量比同期对照的相对表达量提高了 4 倍以上。


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图 5 Na2SeO4 和 Na2SO4 处理后 CsSUL3.5 的表达
“a、b、c、d、e”表示差异显著 P ≤ 0.05。
Fig. 5 Expression of CsSUL3.5 under Na2SeO4 and Na2SO4 treatment
“a，b，c，d，e”means significant difference at P ≤ 0.05 level.
3 讨论
由于 S 和 Se 属于同族元素，它们在植物中的吸收与转运密不可分。然而植物中特异转运硒的
转运蛋白仍未见报道，而硫酸盐转运蛋白既可以转运硫酸盐，也能够转运硒酸盐（White et al.，2004）。
因此，通过研究硫转运蛋白能够揭示植物中 Se 的转运吸收机制。本研究克隆获得了 1 个茶树硫转运
蛋白基因 CsSUL3.5，该基因编码 637 个氨基酸，并与其他植物中硫转运蛋白的氨基酸序列具有较高
的同源性。生物信息学分析显示，该基因编码的蛋白质具有硫转运蛋白典型的生物信息学特征，如
N–端含有 STAS 保守域，具有多个跨膜结构域，是一种跨膜转运蛋白。进一步分析发现，CsSUL3.5
属于硫酸盐转运蛋白基因家族中的第 3 亚家族成员，其表达受硒酸盐和硫酸盐的调控。
硫酸盐转运蛋白家族的 5 个亚家族成员各有其表达特性，高亲和性的第 1 亚家族成员主要负责
硫酸盐的吸收（Yoshimoto et al.，2002），而 SULTR1;2 也能够进行硒酸盐的吸收（Barberon et al.，
2008）。低亲和性的第 2 亚家族成员主要负责硫酸盐从根系向地上部的运输；硫酸盐转运蛋白的第 3
亚家族较少，SULTR3;1、SULTR3;2 与 SULTR3;3 在叶片中特异表达（Takahashi et al.，2000），
SULTR3;5 在根和芽中均有表达，参与介导硫酸盐从根部向地上部的转运（Kataoka et al.，2004）。
荧光定量 PCR 分析结果表明，茶树 CsSUL3.5 基因在成熟叶和根中均有表达，与前人研究结果相近。
在本试验中测定了168 h内CsSUL3.5的表达变化，显示Na2SO4处理12 h后就能够显著诱导CsSUL3.5
的表达，在 48 h 到 72 h 又恢复到原来水平；而 Na2SeO4处理 24 h 内 CsSUL3.5 的表达变化不大，48 h
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后表达量显著增加。这表明，CsSUL3.5 在短时间内能够快速响应硫酸盐的诱导，而硒酸盐需要较长
时间诱导 CsSUL3.5 表达。Kataoka 等（2004）研究表明，SULTR3;5 与 SULTR2;1 共表达于根系维
管组织，负责硫酸盐向地上部运输，而二者是否同样负责硒酸盐从根部向地上部的运输还未见报道。
本试验中通过电子克隆和 RT-PCR 技术克隆了硫酸盐转运蛋白 CsSUL3.5 的 cDNA 序列，对其进
行生物信息学分析，并采用 qRT-PCR 技术对其在低硫、低硒条件下的表达模式进行了分析。有关茶
树 CsSUL3.5 基因的功能还需进一步研究。

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