全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：281–294.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0886；http：//www. ahs. ac. cn 281
收稿日期：2015–12–08；修回日期：2016–02–18
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-26-18）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangxian098@126.com）
西瓜 bHLH 转录因子家族基因的鉴定及其在非
生物胁迫下的表达分析
何 洁，顾秀容，魏春华，杨小振，李 好，马建祥，张 勇，杨建强，
张 显*
（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：利用生物信息学方法，在西瓜测序基因组 97103 中共鉴定出 96 个 bHLH 家族成员，其中有
94 个可以被定位到西瓜的 11 条染色体上。通过基因结构和结构域序列保守性的预测，发现这些基因的序
列长度和内含子数量变化很大，但 bHLH 结构域序列比较保守。用拟南芥中 39 条已知的 bHLH 蛋白序列
和西瓜的 96 条 bHLH 蛋白序列构建系统发育树，结果显示西瓜的 bHLH 家族可以进一步被分为 11 个亚
族。运用荧光定量实时 PCR 技术，分析了该家族中 21 个基因在西瓜响应非生物胁迫时的表达水平，结果表
明，8个基因受低温胁迫诱导表达，13个基因受ABA胁迫诱导表达，14个基因受盐胁迫诱导表达。ClabHLH41
在 3 种胁迫下表达量均显著增加，说明其在低温、ABA 和盐胁迫应答中可能发挥着重要作用。
关键词：西瓜；bHLH；全基因组鉴定；胁迫响应；基因表达
中图分类号：S 651 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0281-14

Identification and Expression Analysis Under Abiotic Stresses of the bHLH
Transcription Factor Gene Family in Watermelon
HE Jie，GU Xiu-rong，WEI Chun-hua，YANG Xiao-zhen，LI Hao，MA Jian-xiang，ZHANG Yong，
YANG Jian-qiang，and ZHANG Xian*
（College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：The bHLH family is a large superfamily of transcription factors（TFs）in plants，which play
critical roles in plant development and response to diverse environmental stimuli. The analysis of evolution
and structure of bHLH genes and their expression under abiotic stresses in watermelon conduced to a deep
understanding of them and their application. Based on bioinformatics methods，a total of 96 bHLH genes
were identified and 94 of them were mapped onto 11 chromosomes. Sequence analysis showed that bHLH
genes were diverse both in length and numbers of intron，but were conserved in bHLH domain region. The
phylogenetic tree，which was constructed with amino acid sequences of bHLH domain of 96 and 39
bHLHs from watermelon and Arabidopsis，indicated that bHLH family of watermelon could be further
divided into 11 subfamilies. Using quantitative real-time PCR，expression levels of 21 bHLH genes were
analyzed under three different abiotic treatments. Results showed that 8，13 and 14 genes could be induced

He Jie，Gu Xiu-rong，Wei Chun-hua，Yang Xiao-zhen，Li Hao，Ma Jian-xiang，Zhang Yong，Yang Jian-qiang，Zhang Xian.
Identification and expression analysis under abiotic stresses of the bHLH transcription factor gene family in watermelon.
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to express by low temperature，ABA and salt stress，respectively. Importantly，gene ClabHLH41 had
significantly higher expression levels under all three abiotic treatments，indicating its important function in
response to these stresses in watermelon.
Key words：watermelon；bHLH；genomic identification；stress response；gene expression

bHLH（basic Helix-Loop-Helix，碱性螺旋–环–螺旋）转录因子家族普遍存在于真核生物中，
因其含有螺旋–环–螺旋（Helix-Loop-Helix，HLH）结构而被命名。bHLH 保守结构域约含有 60
个氨基酸，其 N 端为富含碱性氨基酸的 DNA 结合区，C 端为 α螺旋 1–环–α螺旋（Ma et al.，1994）。
第 1 个 bHLH 转录因子在玉米中被发现，其功能是参与了花青素的合成（Ludwig et al.，1989）。随
后该家族基因成员在拟南芥（Bailey et al.，2003）、水稻（Li et al.，2006）、烟草（Rushton et al.，2008）、
葡萄（尹欢 等，2013）、大白菜（Song et al.，2014）和番茄（Sun et al.，2015）等作物中相继被发
现并报道。bHLH 转录因子可参与植物多个生长发育过程（Nesi et al.，2000；Ramsay et al.，2003；
Groszmann et al.，2008； Kondou et al.，2008； Fujisawa et al.，2013），而且在植物响应干旱（Kiribuchi
et al.，2005；Seo et al.，2011）、高盐（Zhou et al.，2009；陈李淼 等，2013）、脱落酸（Abe et al.，
2003）、低温（Chinnusamy et al.，2003；Wang et al.，2012）、缺铁（Zhang et al.，2015）和低磷（Yi
et al.，2005）等非生物胁迫过程中也发挥重要作用。
本研究中通过生物信息学的方法，分离鉴定了西瓜基因组中的 bHLH 转录因子家族成员，并进
行家族成员分类、系统发育树构建、氨基酸保守域的鉴定、基因的序列特征和进化关系分析等，还
研究了 3 种非生物胁迫条件下的表达模式，为 bHLH 转录因子功能的解析和抗逆调控网络的构建提
供理论基础，同时预测出与西瓜抗逆性紧密相关的候选 bHLH 基因，为西瓜抗逆分子育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2015 年 3—7 月在西北农林科技大学园艺学院西瓜甜瓜资源创新与遗传改良实验室进
行。西瓜全基因组序列、基因及注释信息从葫芦科基因组数据库（CGD）（http：//www. icugi. org/
cgi-bin/ ICuGI/ index. cgi）下载。拟南芥 bHLH 基因序列和蛋白序列从 TAIR（https：//www. arabidopsis.
org/）下载，所需 HLH 特征文件（PF00010）从 Pfam 数据库（http：//pfam. xfam. org/）获得。
西瓜自交纯系‘134’栽植于西北农林科技大学科研温室内。幼苗三叶一心时，进行低温、高
盐和 ABA 共 3 种非生物胁迫处理。其中低温处理在 4 ℃恒温恒湿箱中进行，常温中的植株作为对
照（Kozik & Wehner，2014）；盐处理先进行基质培养，三叶一心时洗根后置于 250 mmol · L-1 NaCl
盐溶液中，以置于蒸馏水中的植株作为对照；ABA 处理在叶面及叶背均匀喷施 100 μmol · L-1 ABA
溶液，喷施蒸馏水作为对照（Xiao et al.，2014）。处理后 1、4 和 12 h 采集各幼苗第 3 片真叶，迅速
放入液氮中冷冻，放置于–80 ℃冰箱保存，用于基因表达验证试验，每个处理 3 次重复。
1.2 西瓜 bHLH 转录因子家族基因的鉴定及序列分析
使用基于隐马尔科夫模型（HMMs）的 Hmmer 3.0 软件，以 E ≤ 0.01 为标准在西瓜全部蛋白序
列中搜索并鉴定西瓜 bHLH 基因家族成员。将鉴定所得基因逐条提交到 Pfam 在线工具进行 bHLH
蛋白质保守结构域预测，记录保守结构域位置信息，剔除不含 bHLH 结构域的基因（Xu & Dunbrack，
2012）。根据 bHLH 基因家族成员在染色体上的位置进行系统编号。
何 洁，顾秀容，魏春华，杨小振，李 好，马建祥，张 勇，杨建强，张 显.
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使用 ExPaSy（http：//www. expasy. org/ tools/）在线工具对获得的西瓜 bHLH 转录因子的蛋白质
序列进行氨基酸数、分子量、理论等电点、脂肪族氨基酸数和蛋白质疏水性分析（Artimo et al.，2012）。
根据基因在染色体上的分布位置信息，利用 MapInspect 软件（http：//mapinspect. software.
informer. com/ 1.0/）绘制基因在染色体上的分布图（Zhang et al.，2013）。
使用基因结构图绘制工具 GSDS 2.0（http：//gsds. cbi. pku. edu. cn/），根据西瓜基因序列和编码
序列绘制基因结构图（Guo et al.，2007）。由已获得的 bHLH 结构域在蛋白质序列上的位置计算出其
在编码序列上的位置，并算出其在基因上的位置进行标注。
使用模体分析工具 MEME（http：//meme-suite. org/）进行序列比对及保守结构域序列分析（Bailey
et al.，2009），其中氨基酸保守性的计算方式为该位点上出现频率最高的氨基酸出现的次数除以基因
总数（即 96）。
1.3 西瓜 bHLH 转录因子家族的进化分析
根据拟南芥中 bHLH 转录因子亚家族的划分（Heim et al.，2003），在每个亚家族中至少选取 2
个 bHLH 氨基酸序列作为该亚家族的代表，共从 12 个亚家族中选取了 39 个 bHLH 蛋白质的氨基酸
序列。使用 MUSCLE（http：//www. drive5. com/ muscle/ downloads. htm）对拟南芥的 39 个和西瓜
的 96 个 bHLH 蛋白质氨基酸序列进行比对并截取 bHLH 结构域序列。利用 MEGA 5.1（参数默认）
对 bHLH 转录因子家族构建进化树（Nayeri &Yarizade，2014），以 modeltest 确定最佳的构树模型。
进化树生成算法采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），校验参数 Bootstrap 重复 1 000 次。
1.4 西瓜 bHLH 转录因子家族基因表达分析
叶片总RNA提取与反转录使用天根生化科技（北京）有限公司的总RNA提取试剂盒和FastQuant
RT Kit（With gDAase）反转录试剂盒。使用 Primer 5 软件设计实时荧光定量 PCR 特异性引物，由
北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。荧光定量 PCR 所用引物序列见表 1。

表 1 荧光定量 PCR 扩增的引物序列
Table 1 Primers used for qRT-PCR amplification
基因
Gene
CGD 登录号
CGD accession No.
上游引物
Forward primer
下游引物
Reverse primer
ClabHLH9 Cla014085 GAGCCATAGTCCCTAAAATAAGC ATCCCATTGAAGAAGCCCAC
ClabHLH11 Cla007697 CCACTGTTCAAATCCCTCGC TCCATCTTCTTGTCCCACGG
ClabHLH12 Cla015818 GCAACAAACGGAATCCAATC ATGTCATAACCCACATCGGTG
ClabHLH23 Cla008700 TTCAAGTGGAGGAAAGAGGATT CGGTGAGAATGAATCTATCTGAAG
ClabHLH25 Cla002645 TCCACCCGCTGACTCCAA ACTGCCCGTCCTTCTCGTA
ClabHLH32 Cla005253 CACAAAAGAACAAGGAGGAACTA TGGACATAGGAGTGAGGCATT
ClabHLH34 Cla001653 CAGAAGAAACCCTCAAACCACA GAAGAAGAGCCTCCCATCAAAG
ClabHLH39 Cla018626 AAACTTTGCTCCCTCACCTCA AATCATCCACCTCCCTCTGC
ClabHLH40 Cla021059 TCAAGTCCCTCATACCTACCTC CCCTTCTCCTATTCTCCCATT
ClabHLH41 Cla021148 AGAAACTGGCGATTAGGAAGA GCTGCTGCTCGTGATTATTAT
ClabHLH42 Cla021422 CCGAAACTCAGTCTCAACCG TAATCTCCCTCCCGTCTCC
ClabHLH46 Cla003232 AACTCTTCCCTGTCGTGTCAAA TCCAAGCCAAGGTTATCCAGA
ClabHLH53 Cla006692 GTTCCGTTGTCTGGCTCACTG CCAAGACGCCGTAAGAGGTT
ClabHLH56 Cla010576 TTACCACTGAACGCCAAAGAA CTCCCACAACTGATGCCCTAT
ClabHLH58 Cla018860 CGAAGAAGATAGCAGGGTATGAAT GCTCACTACTATTGTTCTGTCCCC
ClabHLH64 Cla006006 AGGAGGGAAGCAAGAGGAAT GTTCCCAGAGTCGCACATAA
ClabHLH71 Cla022119 ATGAATGAGTATCTTGCCGTTC GCACGAGTTGAGTATTGAGGG
ClabHLH73 Cla022177 TAGAAGGATCAAATCCGAGGAC TTTCCCGCACAGCAAATCT
ClabHLH82 Cla016224 CAACGACGACGCAACAAGG ATTCGGGCATGAGGGAACG
ClabHLH83 Cla016199 CACAACAAACAGCCAACCG AAACGACCATTCTCATACCCA
ClabHLH93
Actin
Cla023083
Cla007792
GCAGCAAAGCCAGGGTTATTAT
GTCGTACAACAGGTATTGTG
CTGCTCGCTTCCCTCAGAA
AAGGTCCAGACGGAGGATAG
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使用 Bio-rad 公司（美国）的 iQ5 实时定量仪进行荧光定量分析，定量试剂盒选用宝生物工程
（大连）有限公司 SYBR®Premix ExTaqTMⅡ，以基因 Actin 作为内参基因。反应体系为 SYBR 荧光
染料 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各 0.8 μL、ddH2O 6.4 μL，总计 20 μL。反应条件为 95 ℃ 30 s；
95 ℃ 20 s、58 ℃（随不同基因退火温度的不同而变化）30 s、72 ℃ 10 s，40 个循环。试验结果
数据分析采用 2-ΔΔCt 法，使用 SPSS 软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 西瓜 bHLH 转录因子家族成员数及其分布
根据 Pfam 数据库特征文件，在葫芦科基因组数据库发布的西瓜基因组信息中共检索到 133 条
bHLH 转录因子序列，使用 Pfam 在线工具对保守结构域进行检测，剔除结构域不完整的序列，最后
得到 96 个西瓜 bHLH 转录因子家族成员。
西瓜 bHLH 家族基因成员染色体定位分析结果如图 1 所示。在所有 96 个基因中，94 个基因在



图 1 西瓜 bHLH 转录因子基因在染色体上的分布
左侧竖线表示染色体长度。
Fig. 1 Chromosomal locations of bHLH transcription factors genes in watermelon
The vertical bar on the left means the length of chromosome.
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11 条染色体上均有分布，ClabHLH1 和 ClabHLH2 两个基因无法定位到染色体上。2 号染色体和 5
号染色体上分布基因最多，都各有 13 个基因（ClabHLH11 ~ ClabHLH23 和 ClabHLH40 ~
ClabHLH52），其次是 8 号染色体，共有 11 个基因（ClabHLH67 ~ ClabHLH77），7 号染色体上的基
因最少，只有 4 个（ClabHLH63 ~ ClabHLH66）。其余的基因在染色体上的分布数量为 5 ~ 10 个不等。
2.2 西瓜 bHLH 转录因子家族成员蛋白质理化性质分析
利用 ExPaSy 对西瓜 bHLH 蛋白质的理化特性进行了分析，家族成员的编号、对应的登录号、
氨基酸数及理化性质见表 2（根据西瓜基因组信息，ClabHLH83 的蛋白质序列中存在 21 个未知氨基
酸，故无法进行分子量和理论等电点的预测）。

表 2 西瓜中的 bHLH 转录因子的理化性质
Table 2 The chemicophysical properties of bHLH transcription factors in watermelon
蛋白质
Protein
CGD 登录号
CGD accession No.
氨基酸数
Number of AA
分子量/D
Mv
理论等电点
pI
脂肪族氨基酸指数
Aliphatic index
蛋白质疏水性平均
值 GRAVY
ClabHLH1 Cla000121 321 36 213.23 8.51 85.95 –0.488
ClabHLH2 Cla000218 317 35 559.87 5.90 78.45 –0.541
ClabHLH3 Cla005872 534 57 646.96 5.55 64.63 –0.618
ClabHLH4 Cla008442 222 24 664.70 6.18 67.75 –0.747
ClabHLH5 Cla000703 415 45 440.51 5.02 71.45 –0.572
ClabHLH6 Cla014072 321 36 147.37 5.21 74.39 –0.491
ClabHLH7 Cla014073 322 35 159.46 5.46 85.43 –0.366
ClabHLH8 Cla014074 286 32 174.72 6.96 87.20 –0.409
ClabHLH9 Cla014085 341 38 042.60 4.86 66.95 –0.556
ClabHLH10 Cla014286 408 45 507.77 8.67 61.91 –0.773
ClabHLH11 Cla007697 321 35 666.60 6.12 74.45 –0.226
ClabHLH12 Cla015818 608 68 548.29 4.96 71.79 –0.701
ClabHLH13 Cla015913 475 51 838.79 5.89 60.99 –0.641
ClabHLH14 Cla016013 292 32 406.48 6.61 77.19 –0.452
ClabHLH15 Cla016091 321 36 006.00 4.92 51.40 –1.077
ClabHLH16 Cla001663 125 14 115.12 8.82 94.40 –0.590
ClabHLH17 Cla020193 202 22 394.77 9.87 72.03 –0.367
ClabHLH18 Cla019998 710 76 076.97 5.94 65.77 –0.572
ClabHLH19 Cla019871 315 35 487.99 5.42 78.60 –0.487
ClabHLH20 Cla013612 381 40 240.06 6.17 70.50 –0.470
ClabHLH21 Cla013555 154 17 907.38 7.90 91.75 –0.594
ClabHLH22 Cla013532 253 28 206.29 9.03 87.59 –0.321
ClabHLH23 Cla008700 305 35 006.81 5.00 91.34 –0.394
ClabHLH24 Cla002643 331 36 664.39 8.74 67.82 –0.600
ClabHLH25 Cla002645 571 62 843.37 5.57 80.46 –0.454
ClabHLH26 Cla019678 255 28 012.83 9.24 83.02 –0.399
ClabHLH27 Cla019752 304 34 098.28 4.73 62.63 –0.456
ClabHLH28 Cla019764 293 32 885.49 6.01 68.60 –0.847
ClabHLH29 Cla006289 447 49 402.90 6.47 62.62 –0.733
ClabHLH30 Cla011198 469 52 241.74 7.14 91.49 –0.283
ClabHLH31 Cla011292 317 34 143.62 5.86 73.56 –0.409
ClabHLH32 Cla005253 332 36 969.00 5.85 79.82 –0.466
ClabHLH33 Cla001652 233 26 521.40 6.71 100.34 –0.161
ClabHLH34 Cla001653 234 26 036.60 9.01 84.23 –0.414
ClabHLH35 Cla001654 253 28 249.21 7.10 80.63 –0.445
ClabHLH36 Cla018085 190 20 782.13 6.28 62.63 –0.596
ClabHLH37 Cla018502 273 30 409.99 6.66 68.57 –0.666
ClabHLH38 Cla018581 394 43 440.00 9.08 62.41 –0.679
ClabHLH39 Cla018626 81 9 365.75 4.80 105.80 –0.373
ClabHLH40 Cla021059 370 41 971.67 6.44 79.57 –0.550
He Jie，Gu Xiu-rong，Wei Chun-hua，Yang Xiao-zhen，Li Hao，Ma Jian-xiang，Zhang Yong，Yang Jian-qiang，Zhang Xian.
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续表 2
蛋白质
Protein
CGD 登录号
CGD accession No.
氨基酸数
Number of AA
分子量/D
Mv
理论等电点
pI
脂肪族氨基酸指数
Aliphatic index
蛋白质疏水性平均
值 GRAVY
ClabHLH41 Cla021148 618 68 589.08 5.85 76.99 –0.547
ClabHLH42 Cla021422 364 40 737.50 5.14 76.65 –0.604
ClabHLH43 Cla021863 547 59 448.21 7.18 62.38 –0.725
ClabHLH44 Cla004232 359 39 123.80 5.29 73.31 –0.509
ClabHLH45 Cla013237 254 28 287.83 6.12 66.81 –0.570
ClabHLH46 Cla003232 538 58 476.45 5.67 79.98 –0.415
ClabHLH47 Cla020660 224 25 074.36 7.07 61.88 –0.630
ClabHLH48 Cla020607 336 37 430.46 5.32 67.38 –0.719
ClabHLH49 Cla020364 359 39 643.71 5.88 81.28 –0.508
ClabHLH50 Cla020330 541 58 531.61 6.71 67.39 –0.537
ClabHLH51 Cla010083 491 55 405.57 5.70 81.16 –0.492
ClabHLH52 Cla009965 399 43 152.23 5.69 66.97 –0.506
ClabHLH53 Cla006692 427 47 692.74 5.09 78.78 –0.424
ClabHLH54 Cla006693 423 47 569.45 5.14 71.70 –0.513
ClabHLH55 Cla007559 279 31 905.28 9.23 68.92 –0.676
ClabHLH56 Cla010576 509 56 377.41 5.65 69.37 –0.626
ClabHLH57 Cla018722 422 44 500.75 6.51 70.09 –0.512
ClabHLH58 Cla018860 239 27 282.93 4.95 87.74 –0.359
ClabHLH59 Cla018968 260 29 092.84 7.21 61.88 –0.526
ClabHLH60 Cla019030 573 63 199.44 8.11 64.49 –0.747
ClabHLH61 Cla019121 91 10 324.61 7.96 96.48 –0.605
ClabHLH62 Cla019311 216 23 124.03 9.48 69.12 –0.496
ClabHLH63 Cla002749 580 63 762.97 5.21 58.36 –0.517
ClabHLH64 Cla006006 501 55 179.91 5.96 76.47 –0.504
ClabHLH65 Cla006061 274 30 391.13 6.51 78.61 –0.511
ClabHLH66 Cla010807 345 37 848.19 5.66 74.29 –0.555
ClabHLH67 Cla007965 175 20 480.25 8.44 69.03 –0.735
ClabHLH68 Cla021887 95 10 710.08 9.09 93.47 –0.548
ClabHLH69 Cla021901 298 32 594.23 6.77 65.20 –0.782
ClabHLH70 Cla022045 485 53 002.89 5.45 69.20 –0.735
ClabHLH71 Cla022119 310 35 078.53 5.93 73.58 –0.546
ClabHLH72 Cla022160 239 26 546.95 9.03 64.06 –0.608
ClabHLH73 Cla022177 310 34 871.33 4.71 77.13 –0.474
ClabHLH74 Cla022582 251 27 463.21 7.94 69.76 –0.389
ClabHLH75 Cla022588 379 41 315.91 5.24 64.59 –0.530
ClabHLH76 Cla022622 239 26 362.31 6.03 71.42 –0.778
ClabHLH77 Cla022649 376 41 548.63 6.17 75.64 –0.466
ClabHLH78 Cla015607 391 43 031.71 6.55 64.65 –0.605
ClabHLH79 Cla015223 405 44 690.24 7.24 55.63 –0.757
ClabHLH80 Cla014806 313 32 611.76 6.00 76.49 –0.265
ClabHLH81 Cla014991 612 67 405.12 5.91 58.48 –0.591
ClabHLH82 Cla016224 307 34 940.54 8.50 84.53 –0.607
ClabHLH83 Cla016199 702 68.46 –0.596
ClabHLH84 Cla010338 91 10 431.86 9.09 103.96 –0.515
ClabHLH85 Cla008805 656 72 024.55 5.87 65.00 –0.592
ClabHLH86 Cla008890 463 51 021.92 8.77 79.74 –0.471
ClabHLH87 Cla017143 235 25 787.18 8.66 93.87 –0.391
ClabHLH88 Cla017516 375 41 313.14 5.47 79.57 –0.547
ClabHLH89 Cla017518 370 40 084.30 9.30 62.46 –0.605
ClabHLH90 Cla006599 250 27 876.73 9.01 79.24 –0.476
ClabHLH91 Cla007867 340 38 214.35 6.52 91.47 –0.344
ClabHLH92 Cla022767 211 24 118.17 5.08 89.62 –0.596
ClabHLH93 Cla023083 331 37 351.37 4.86 81.30 –0.483
ClabHLH94 Cla023247 575 62 911.76 6.62 60.75 –0.642
ClabHLH95 Cla016562 271 31 192.65 9.39 74.83 –0.720
ClabHLH96 Cla016834 375 42 495.83 9.34 89.44 –0.243
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由表 2 可见，各蛋白质分子中氨基酸数在 81（ClabHLH39）~ 710（ClabHLH18）个之间，平均
值为 353。理论等电点在 4.71（ClabHLH73）~ 9.48（ClabHLH62）范围内，虽然 bHLH 转录因子的
保守结构域中存在碱性区域，但从总体看，西瓜 bHLH 家族蛋白的氨基酸序列的等电点大多数在酸
性范围内，蛋白质分子中富含酸性氨基酸。此现象与拟南芥、水稻中的 bHLH 家族蛋白相同（分析
结果未列出）。对蛋白质疏水性的分析表明，96 条序列的疏水性平均值均为负值，表明西瓜 bHLH
家族蛋白大多属于亲水蛋白，亲水性存在差异。
2.3 西瓜 bHLH 转录因子家族成员结构域序列保守性及基因结构
如图 2 所示，除 Loop 区域不具有相对保守的氨基酸位点外，其他区域都有保守位点出现。共
有 31 个位点上保守氨基酸的出现频率高于 50%，其中 Glu-9、Arg-10、Arg-12、Arg-13、Leu-23、
Leu-26、Pro-28、Lys-32、Ala-36、Leu-39、Leu-49 的保守性都高于 80%。



图 2 西瓜 bHLH 家族蛋白保守结构域分析
横排数字 1 ~ 60 表示 bHLH 保守结构域的 60 个氨基酸位点，每个位点 1 个堆叠。
每个堆叠的总体高度表示各条序列在该位置的保守性，堆叠中的字符高度表示该位置的氨基酸的相对频率。
Fig. 2 Conservation domain structures analysis in watermelon bHLH proteins
The number 1–60 means 60 positions of amino acid at bHLH domain，one stack for each position in the sequence. The overall height of each stack
indicates the sequence conservation at that position，whereas the height of symbols within the stack reflects the relative frequency of the
corresponding amino acid at that position.

西瓜 96 个 bHLH 基因的结构如图 3 所示。进化关系近的基因之间，结构具有相似性。总的来看，
这些基因的长度差异较大，结构类型多样。内含子数从 0 到 10 个不等，52 个（54%）基因的内含
子数少于或等于 3，79 个（82%）基因少于或等于 5。内含子在 0、1、2 相位均有出现，但以 0 相
位出现较多，即多数内含子位于两个密码子之间。除 17 个不含内含子的基因外，大部分基因（82.3%）
的保守结构域上具有内含子，其中共 33 个（34%）基因的保守结构域位于第一、第二外显子上，24
个（25%）基因的保守结构域位于第二、第三、第四外显子上。在 bHLH 保守结构域中，内含子绝
大部分出现在 0 相位，即没有将编码蛋白质的三联密码子从中打断；结构域内含子的数量为 0 ~ 2
个不等，其中 82.3%的基因在 bHLH 结构域中有内含子，这与水稻的 87.4%（Li et al.，2006）较为
接近。



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图 3 西瓜 bHLH 基因结构分析
Fig. 3 Structure of bHLHs gene in watermelon
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2.4 西瓜 bHLH 蛋白质系统发生树的构建
根据预测到的西瓜 bHLH 蛋白序列保守结构域氨基酸序列的相似性，利用 MEGA 5.1 软件以保
守结构域序列构建进化树，为了更好地对西瓜 bHLH 家族进行分类，加入 39 个拟南芥 bHLH 家族
成员作为参考。根据进化树的分类情况和拟南芥中 bHLH 转录因子的分类系统，全部成员分为 12
个亚族，其中第 10 亚族只含拟南芥的 bHLH 家族成员，西瓜的 96 个 bHLH 蛋白可分成 11 个亚族。
在被划分的 11 个亚族中，第 3 亚族中的 bHLH 成员数量最多，共 18 个；第 2、6 亚族中的成员数
量最少，仅为 1 个。在拟南芥中，第 3 亚族成员也最多，其功能主要为逆境响应和参与依赖 ABA
的信号传导途径。较少的为第 2、6 亚族。比较其他亚族成员数量，也可发现类似规律。


图 4 西瓜 bHLH 蛋白家族的系统进化树分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of bHLH proteins from watermelon

2.5 部分西瓜 bHLH 基因在非生物逆境胁迫下的表达分析
根据拟南芥与西瓜中的 bHLH 家族成员共同构建的进化树，将与具有抗逆功能的拟南芥 bHLH
基因进化关系较近的西瓜 bHLH 基因作为候选基因并进行表达分析，共 21 个。
qRT-PCR 分析结果表明，在 4 ℃低温胁迫处理下，在候选的 21 个西瓜 bHLH 基因中，有 8 个
基因的表达量受低温胁迫的诱导（图 5）。其中，ClabHLH9、ClabHLH11、ClabHLH46、ClabHLH58、
ClabHLH73、ClabHLH93 等 6 个基因的表达量均有不同程度的显著降低。ClabHLH73 的表达量在处
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理后 1 h 显著降低，处理后 4 h、12 h 也基本维持在这一水平；ClabHLH9、ClabHLH46 和 ClabHLH93
的表达量变化趋势与 ClabHLH73 相似，不同的是，ClabHLH46 的表达量下降幅度较小，约为处理
前的 60%；ClabHLH11 的表达量在处理后 4 h、12 h 显著降低，且与 1 h 的表达量间存在显著差异；
ClabHLH58 的表达量在 1 h 达到最低，而后升高。与之相反，ClabHLH41 的表达量在处理后 4 h 内
没有显著变化，12 h 后表达量显著升高至处理前的 2.5 倍；ClabHLH23 的表达量在 1 h 下降至处理
前的 21%，4 h 后的表达量升高至处理前水平，而 12 h 后又下降至处理前的 25%。



图 5 西瓜 bHLH 基因在低温胁迫下的表达特性
柱形图上的不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）。
Fig. 5 Expression profiles of different bHLHs members in watermelon under low temperature stress
Different letters in the pillars indicate significant different at the 0.05 level.

在候选的 21 个西瓜 bHLH 基因中，有 13 个基因的表达量受到 100 μmol · L-1 ABA 的诱导（表 3）。
ClabHLH9、ClabHLH12、ClabHLH25、ClabHLH32、ClabHLH40、ClabHLH71 和 ClabHLH73 等 7
个基因的表达量具有相似的变化趋势，表达量在处理后 1 h 显著降低，其中 ClabHLH73 在 1 h 的表
达量仅为处理前的 1.8%，除 ClabHLH32 和 ClabHLH71 外，随着处理时间的延长，其余基因在处理
12 h 后表达量显著升高。ClabHLH46 的表达量在处理后 4 h 降至最低，12 h 后显著升高且超过处理
前表达量，ClabHLH93 表达量表现明显的下调趋势。与之相反，ClabHLH56 和 ClabHLH64 的表达
量在处理后表现上调趋势，表达量最高时分别达到处理前的 2.4 倍和 3.2 倍。ClabHLH41 和
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ClabHLH58 的表达量表现先上调后下降趋势，在处理后 1 h 即显著升高，且升高幅度大，分别达到
处理前的 18.4 倍和 12.6 倍，4 h 后又表现下降趋势。

表 3 西瓜 bHLH 基因在 ABA 胁迫下的表达特性
Table 3 Expression profiles of different bHLHs members in watermelon under ABA
基因 相对表达量 Relative expression
Gene 0 h 1 h 4 h 12 h
ClabHLH9 1.000 ± 0.000 a 0.020 ± 0.000 c 0.034 ± 0.012 c 0.277 ± 0.028 b
ClabHLH12 1.000 ± 0.000 a 0.156 ± 0.016 c 0.139 ± 0.065 c 0.390 ± 0.044 b
ClabHLH25 1.000 ± 0.000 a 0.438 ± 0.035 c 0.255 ± 0.009 d 0.728 ± 0.039 b
ClabHLH32 1.000 ± 0.000 a 0.233 ± 0.171 b 0.347 ± 0.056 b 0.732 ± 0.266 ab
ClabHLH40 1.000 ± 0.000 a 0.313 ± 0.018 b 0.171 ± 0.003 b 1.109 ± 0.024 a
ClabHLH41 1.000 ± 0.000 b 18.406 ± 0.968 a 5.230 ± 4.248 b 5.747 ± 1.824 b
ClabHLH46 1.000 ± 0.000 b 0.631 ± 0.024 b 0.103 ± 0.022 c 1.993 ± 0.159 a
ClabHLH56 1.000 ± 0.000 b 0.878 ± 0.616 b 2.159 ± 0.500 a 2.426 ± 0.063 a
ClabHLH58 1.000 ± 0.000 b 12.582 ± 1.388 a 0.222 ± 0.048 b 2.162 ± 2.402 b
ClabHLH64 1.000 ± 0.000 b 2.043 ± 0.637 ab 1.811 ± 0.370 ab 3.248 ± 0.681 a
ClabHLH71 1.000 ± 0.000 a 0.205 ± 0.025 b 0.313 ± 0.016 b 0.821 ± 0.058 ab
ClabHLH73 1.000 ± 0.000 a 0.018 ± 0.001 c 0.015 ± 0.008 c 0.128 ± 0.004 b
ClabHLH93 1.000 ± 0.000 a 0.056 ± 0.019 b 0.005 ± 0.002 b 0.041 ± 0.002 b
注：同行数据后不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）。下同。
Note：Different letters in the same line indicate significant different at the 0.05 level. The same below.

在 250 mmol · L-1 NaCl 胁迫处理条件下，在 21 个候选基因中，有 14 个基因的表达量受盐胁迫
的诱导（表 4）。其中，ClabHLH12、ClabHLH39、ClabHLH40、ClabHLH46、ClabHLH73、ClabHLH82
和 ClabHLH93 等 7 个基因的表达量变化趋势相似，在处理后的各时间点均显著低于处理前水平，
ClabHLH82 在处理后 1、4 和 12 h 的表达量仅分别为处理前的 0.93%、0.12%和 0.32%。ClabHLH9、
ClabHLH11、ClabHLH23 和 ClabHLH34 的表达量在处理后 1 和 4 h 显著降低，在 12 h 又显著升高，
除 ClabHLH9 外，升高幅度均较大。ClabHLH64 和 ClabHLH71 的表达量在处理后 1 h 显著升高，分
别为处理前的 5.7 倍和 1.4 倍，4 h 后呈现下降趋势，ClabHLH64 基本降低到处理前水平，ClabHLH71
则降低至处理前的 27%。ClabHLH41 的表达量在处理后 1 h 显著升高，4 h 时下降，基本达到处理
前表达水平，而处理后 12 h 再次升高，达到处理前的 10.7 倍。

表 4 西瓜 bHLH 基因在盐胁迫下的表达特性
Table 4 Expression profiles of different bHLHs members in watermelon under salt stress
相对表达量 Relative expression 基因
Gene 0 h 1 h 4 h 12 h
ClabHLH9 1.000 ± 0.000 a 0.077 ± 0.004 bc 0.027 ± 0.003 c 0.084 ± 0.029 b
ClabHLH11 1.000 ± 0.000 a 0.063 ± 0.005 b 0.054 ± 0.003 b 1.422 ± 0.417 a
ClabHLH12 1.000 ± 0.000 a 0.197 ± 0.023 b 0.141 ± 0.058 b 0.186 ± 0.095 b
ClabHLH23 1.000 ± 0.000 a 0.325 ± 0.188 b 0.303 ± 0.011 b 0.758 ± 0.122 a
ClabHLH34 1.000 ± 0.000 a 0.535 ± 0.099 b 0.266 ± 0.077 b 1.000 ± 0.270 a
ClabHLH39 1.000 ± 0.000 a 0.218 ± 0.077 b 0.096 ± 0.038 b 0.388 ± 0.125 b
ClabHLH40 1.000 ± 0.000 a 0.521 ± 0.125 b 0.175 ± 0.001 c 0.046 ± 0.011 c
ClabHLH41 1.000 ± 0.000 b 10.436 ± 2.389 a 0.592 ± 0.187 b 10.664 ± 3.600 a
ClabHLH46 1.000 ± 0.000 a 0.284 ± 0.023 b 0.177 ± 0.026 b 0.438 ± 0.211 b
ClabHLH64 1.000 ± 0.000 b 5.693 ± 2.011 a 1.926 ± 0.516 b 3.216 ± 0.963 ab
ClabHLH71 1.000 ± 0.000 b 1.381 ± 0.034 a 0.266 ± 0.059 c 0.244 ± 0.115 c
ClabHLH73 1.000 ± 0.000 a 0.070 ± 0.000 b 0.081 ± 0.011 b 0.170 ± 0.007 b
ClabHLH82 1.000 ± 0.000 a 0.009 ± 0.001 b 0.001 ± 0.000 b 0.003 ± 0.001 b
ClabHLH93 1.000 ± 0.000 a 0.056 ± 0.023 b 0.013 ± 0.005 b 0.064 ± 0.048 b
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3 讨论
在西瓜生产中，为提高经济效益，多地实行春提早或秋延后设施栽培，这就对西瓜的抗逆性，
尤其是耐低温与盐害的能力提出了更高的要求。在植物的逆境响应过程中，转录信号的级联在植物
激素 ABA 和非生物胁迫的信号通路之间组成了一个复杂的信号网络，转录因子在其中发挥了重要
作用，明确各转录因子基因在 ABA 处理条件下的表达规律，将有助于研究 bHLH 基因响应逆境的
具体调控机制。本研究中对西瓜 bHLH 转录因子进行了全基因组鉴定，并分析了其序列特征及在非
生物胁迫条件下的表达差异，为深入揭示西瓜响应逆境过程中 bHLH 转录因子的调控机制，明确其
在西瓜逆境响应过程中起到的作用奠定了基础。
西瓜 bHLH 基因编码 81 ~ 710 个氨基酸，基因碱基数的差异较大，为 326 ~ 7 499 bp。此外，基
因结构类型多样，内含子位置和数量呈现多态性。前人研究表明，超过 50%的植物 bHLH 蛋白质保
守结构域序列的 basic 区域至少含有 5 个碱性氨基酸，并且含有高度保守的 HER 基序
（His5-Glu9-Arg13），其功能预测为结合 DNA（Atchley & Fitch，1997；Massari & Murre，2000；
Toledo-Ortiz et al.，2003）。对西瓜 bHLH 蛋白序列的保守结构域的分析发现，5 号、9 号和 13 号位
点上出现最多的氨基酸分别为组氨酸、谷氨酸和精氨酸，为前人的研究结果提供了有力的证据（Heim
et al.，2003；Feller et al.，2011）。在 HLH 区域，通过比较西瓜与已报道的拟南芥（Feller et al.，2011)、
水稻（Li et al.，2006）、番茄（Sun et al.，2015）和大白菜（Song et al.，2014）的保守结构域序列
发现，在某些位点，例如 Leu-23、Leu-39、Tyr-45、Leu-49 上，不同物种的出现频率最高的氨基酸
种类是相同的，这说明 bHLH 转录因子的结构域序列不仅在西瓜中是相对保守的，而且在不同的物
种间具有高度的保守性，同时推测在 HLH 保守结构域中，这些氨基酸可能在二聚化过程中起着重
要作用。另一方面，植物 bHLH 转录因子的系谱发生具有独立性，而且其研究相对滞后，导致植物
bHLH 转录因子家族分类未有明确定论，每个家族也没有相应的名称。本试验参照 Hemi 等（2003）
的分类方法，将西瓜 bHLH 转录因子成员分成 11 个亚族，但由于目前对西瓜 bHLH 蛋白的功能了
解尚少，还不能根据其功能进行详尽分类，这就需要今后更多研究工作的开展，从而基于结构和功
能对西瓜 bHLH 转录因子家族进行更科学地分类。
实时荧光定量 PCR 结果显示，在不同非生物胁迫条件（低温、ABA 与高盐）处理下，候选的
21 个 bHLH 基因的表达模式不同，这可能是由于在不同的逆境条件下，植株自身具有多种逆境应答
调控途径，而 bHLH 基因分别参与其中。在低温、外源 ABA 与高盐 3 种处理条件下，分别有 8、13
和 14 个 bHLH 基因的相对表达量发生显著变化。ClabHLH41 在低温胁迫下，ClabHLH41、ClabHLH58
和 ClabHLH64 在 ABA 胁迫下，ClabHLH41 和 ClabHLH64 在盐胁迫下的表达量均表现出不同程度
的增加，说明这些 bHLH 基因分别参与了低温、ABA 和盐逆境应答调控过程。其中 ClabHLH41 在
ABA 胁迫和盐胁迫下的表达水平大幅度增加，表明其可能在西瓜耐盐方面发挥了重要作用，并且初
步推测其可能参与了依赖于 ABA 的信号传导途径。此外，进化树分析也表明 ClabHLH41 和
ClabHLH64 蛋白的亲缘关系较近，推测 2 个 bHLH 基因在西瓜逆境响应中可能发挥了类似的作用。
与之相反，在低温、ABA 和盐胁迫下，分别有 6、8 和 10 个基因表现下调，表明不同的胁迫处理对
相应的 bHLH 基因的表达均有抑制作用，推测这些基因分别是不同信号通路中的负响应因子。其中，
ClabHLH73 和 ClabHLH93 在低温、外源 ABA 和盐处理下大幅度下调，其可能作为负调控途径中的
关键基因。进化树分析结果也显示，ClabHLH73 和 ClabHLH93 具有相近的亲缘关系，推测这 2 个
bHLH 基因在西瓜逆境响应中也具有相似的功能。此外，ClabHLH41、ClabHLH64、ClabHLH73 和
何 洁，顾秀容，魏春华，杨小振，李 好，马建祥，张 勇，杨建强，张 显.
西瓜 bHLH 转录因子家族基因的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析.
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ClabHLH93 共同聚在第 3 亚族，该亚族功能主要预测为逆境响应和参与依赖 ABA 的信号传导，此
结果初步表明利用将拟南芥和西瓜的 bHLH 蛋白共同构建进化树，并根据已知功能的拟南芥基因来
推测西瓜中 bHLH 基因功能的方法是可靠的。
研究还发现，不同基因在相同处理条件下和同一基因在不同的处理条件下可能具有相似的表达
模式，并且同一基因在不同的处理条件下，也可能具有不同的表达模式。这表明 bHLH 转录因子基
因在西瓜逆境胁迫中发挥的作用可能涉及多条信号通路的交叉调控，其组成了一个复杂的基因互作
网络。因此，下一步更详细的工作将是阐明在胁迫适应的信号网络中 bHLH 转录因子是如何精确进
行交互作用的，从而为通过基因工程手段提高西瓜抗逆性发挥作用。

References
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