全 文 ：园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1079；http：//www. ahs. ac. cn 1285
收稿日期：2015–03–16；修回日期：2015–06–23
基金项目：国家自然科学基金项目（31171946）；教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1155）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：youchunxiang@126.com）
番茄漆酶基因 LeLACmiR397的克隆与表达分析
赵先炎，庞明利，赵 强，任怡然，郝玉金，由春香*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，国家苹果工程技术研究中心，山东泰安 271018）
摘 要：通过 BLAST 分析，获得了番茄漆酶（Laccase，LAC）基因相关的 15 个 EST 片段，并对这
些 EST 进行了同源比较和序列拼接，得到 1 个含有小分子 RNA miR397 识别位点的 LAC 片段，命名为
LeLACmiR397。根据蛋白质结构域推测，LeLACmiR397 蛋白存在 1 个 Cu–氧化酶结构域。LeLACmiR397 时空表
达分析表明，其在番茄根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达，而在叶中不表达。根据该片段的核苷
酸序列信息进行 5′-和 3′-RACE 扩增，得到了番茄 LAC 基因的全长 cDNA（LeLACmiR397，登录号 EU503151），
其在番茄基因组中对应的基因为 Solyc07g049460.2.1。通过在番茄中过表达 miR397a 基因，发现转基因番
茄中 LeLACmiR397 表达量降低，同时其 PPO、POD、SOD 含量也有所下降。用丁香酸和芥子酸处理转基因
植株幼苗，其根系比非转基因植株更长，抗性增强，表明 LeLACmiR397 与番茄植株的抗性反应有关。
关键词：番茄；漆酶；LAC；克隆；抗性
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）07-1285-14

Cloning and Expression Analysis of Tomato LeLACmiR397 Gene
ZHAO Xian-yan，PANG Ming-li，ZHAO Qiang，REN Yi-ran，HAO Yu-jin，and YOU Chun-xiang *
（State Key Laboratory of Crop Biology，National Research Center for Apple Engineering and Technology，College of
Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：Laccases are glycoproteins with polyphenol oxidase acitivity depending on copper. They
ubiquitously exist in plants，fungi，insects，bacteria and other organisms，playing crucial roles in lignin
synthesis，ion absorption and stress responses. It has been documented that several LAC genes were
regulated by microRNAs at post–transcriptional level. In this study，homology BLAST was conducted in
GenBank for LAC ESTs. Resultly，15 tomato ESTs highly similar with LAC genes were obtained，and
spliced into a LAC fragment named as LeLACmiR397 containing a recognition site of miR397. In addition，a
Cu-oxidase domain was predicted to be in the deduced LeLACmiR397 protein. To check the temporal and
spatial expression of LeLACmiR397，semi-quantitative RT-PCR was performed. It was found that
LeLACmiR397 specifically expressed in roots，flowers，ripe fruit and callus，but not in leaves. Then，its full
length cDNA was cloned with RT-PCR and 5′- and 3′-RACEs，and registered as EU503151 in GenBank，
corresponding to Solyc07g049460.2.1 in tomato genome. The data showed that LeLACmiR397 expression
was down-regulated in the transgenic tomato overexpressing miR397a，and the contents of PPO，POD and
SOD were reduced too. When being treated with Syringic acid and Sinapic acid，transgenic tomato

Zhao Xian-yan，Pang Ming-li，Zhao Qiang，Ren Yi-ran，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLACmiR397 gene.
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seedlings overexpressing LeLACmiR397 had longer root system and showed stronger resistance than WT.
These results suggested that LeLACmiR397 was related to resistance to Syringic acid and Sinapic acid in
tomato.
Key words：tomato；laccase；LAC；cloning；LeLACmiR397gene；resistance

漆酶（laccase，LAC）最先发现于漆树的树液中，可将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌，是酚
氧化酶的一种，亦被称为对苯二酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族（万云洋和杜予民，2007；王
祎宁 等，2009）。漆酶能催化多种芳香族化合物特别是酚类的氧化，能催化酚酸类物质转化成毒性
较小的寡聚物（王国栋和陈晓亚，2003；曹立芳和冯有胜，2008；王祎宁 等，2009）。目前已经在
植物、真菌、昆虫和细菌中发现了漆酶（Martins et al.，2002；王国栋和陈晓亚，2003；赵敏 等，
2008；左斌 等，2009）。漆酶基因 LAC 在木质化的组织中表达量较高，参与木质素的生物合成
（O’Malley et al.，1993；Dean et al.，1998；Gavnholt et al.，2002），并且能使木质素单体聚合成木
质素（Gavnholt & Larsen，2002；Mayer & Staples，2002）。在已知的 17 个拟南芥漆酶基因中（McCaig
et al.，2005；Turlapati et al.，2011），有４个漆酶基因（LAC4、LAC11、LAC15 和 LAC17）与木质素
的合成有关（Liang et al.，2006；Wang et al.，2008；Berthet et al.，2011；Zhao et al.，2013）。另外，
植物漆酶除了参与木质素的生物合成外，还与水分胁迫有关（路运才，2004）。
LAC 基因家族受到多种 microRNA 介导的转录后调控。已知的 microRNA 中，miR408、miR398、
miR397 和 miR857 的靶基因是拟南芥 LAC 基因家族的成员，其中 miR397 在拟南芥中存在 3 个靶基
因，分别是 AtLAC2、AtLAC4 和 AtLAC17（Abdel-Ghany & Pilon，2008；Yamasaki et al.，2009）。杨
树中 Ptr-miR397a 基因过表达会引起杨树体内 17 个漆酶基因的表达量下调，从而影响杨树中木质素
的含量（Lu et al.，2013）。拟南芥 AtmiRNA397b 基因过量表达会使 AtLAC4 基因的表达量降低，减
少木质素的含量（Wang et al.，2014）。
番茄和茄子等多种具有叶表皮毛的植物富含多酚类物质（Kowalski et al.，1992；Yu et al.，1992；
Thipyapong et al.，1997）。LAC 负责聚合生成这些多酚化合物，保护植物免受病菌和昆虫攻击（Lavid
et al.，2001）。在拟南芥中过量表达棉花的一个 LAC 基因后，转基因拟南芥对酚类物质的抗性增强，
并且漆酶活性的高低与它对酚酸类物质的抗性大小呈正相关，表明漆酶基因的表达提高了植物的抗
性（Wang et al.，2003）。另外，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中提高白腐菌（Trametes
versicolor）漆酶的表达能使转基因菌株对芥子酸的抗性增强（Larsson et al.，2001）。
研究表明，LAC 基因的表达是植株产生抗性的直接原因之一。体外酶活分析表明，酵母表达的
GaLAC1 底物广泛，对阿魏酸、芥子酸、丁香酸、香草酸等酚酸类物质都有一定的催化活性，而植
物体内的酚酸类物质能破坏或阻止植物对营养物质的消化，将棉花 GaLAC1 在拟南芥中过量表达后
主要在根部积累，提高了拟南芥对芥子酸、丁香酸的抗性，GaLAC1 在植物体外可以催化酚酸类物
质氧化形成毒性较小且较难进入植物体内的寡聚物（王国栋，2004）。这表明棉花 GaLAC1 基因增
强了植株对酚酸物质的抗逆性（王国栋，2004）。
本研究从番茄中克隆了 1 条 miR397 的靶基因 LeLACmiR397（GenBank 注册号为 EU503151），并
通过遗传转化获得了 miR397a 和 LeLACmiR397 转基因番茄。已有研究表明，LAC 基因可以增强植物
对酚酸类物质的抗性。为了进一步研究 LeLACmiR397 在番茄中对酚酸类物质是否具有抗性，对转基因
番茄进行丁香酸和芥子酸处理试验，为进一步鉴定该基因的功能和作用机理，并将其应用于番茄抗
逆基因工程奠定理论基础。
赵先炎，庞明利，赵 强，任怡然，郝玉金，由春香.
番茄漆酶基因 LeLACmiR397 的克隆与表达分析.
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1 材料与方法
1.1 试验材料
2007 年，将‘中蔬 4 号’番茄种植于山东农业大学园艺科学与工程学院玻璃温室内。采集根、
茎、叶、花和果实，经液氮冷冻后贮于–80 ℃保存备用。番茄子叶分化后形成的愈伤组织，经液氮
冷冻后贮于–80 ℃保存备用。
克隆载体为 pMD18-T，表达载体为 pBI121。大肠杆菌（E. coli）DH5α，农杆菌 LBA4404 均为
本实验室保存。引物由上海生工（Sangon）合成（表 1）；测序由北京博尚生物技术有限公司完成。

表 1 PCR 引物
Table 1 PCR primers
引物用途
Usage
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence
5′-RACE 锚定引物 5′-RACE adaptor primer AAP
AUAP
5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′
5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
3′-RACE 锚定引物 3′-RACE adaptor primer B26
B25
5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′
5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′
3′ 锚定引物 3 sites adaptor primer 3 sites adaptor primer 5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
参照基因 Reference gene Actin-F
Actin-R
5′-CTTCAGTCCACAATCGGTGG -3′
5′-CATTCCGAGTTGAGCTGCTG -3′
扩增 LAC 中间片段 Amplification middle fragment of LAC Lac-f：
Lac-r：
5′-CAATGTTGTGGATGTGGAGAATGC-3′
5′-GTTAGCCGCCATGTAGTACGAC-3′
扩增 LAC 3′端序列 Amplification 3 sites fragment of LAC LAC3′-F1：
LAC3′-F2：
5′-CTTGACGGCCGATCAGCTAC-3′
5′-GACAACACCACAACTAGAGG-3′
扩增 LAC 5′端序列 Amplification 5 sites fragment of LAC LAC5′-F1
LAC5′-F2
5′-GGAGCAAGGGTAAAGATCGCC-3′
5′-CGCTGCATTCTCCACATCCAC-3′
扩增 LAC cDNA 全长序列 Amplification cDNA of LAC LAC5′-F：
LAC3′-R：
5′-GTTCTATAGTCTTTACACATTG-3′
5′-ATGACTCACTTGTACAATTG-3′
扩增 miR397a 前体序列 Amplification Pre-miR397a miR397a-F
miR397a-R
5′-GCGTACATTACAAACACTTGGAC-3′
5′-CCAGATTGATTACGTAAAGAACC-3′
表达载体上通用引物 Universal primers of expression vector 35S-F： 5′-CGCACAATCCCACTATCCTT-3′
pBI121 载体中抗卡那霉素的基因
PBI121 kanamycin resistant gene in the vector
NPTII-F
NPTII-R
5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′
5′-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3′

1.2 LAC cDNA 克隆
1.2.1 CTAB法提取 RNA
RNA 的提取方法参考蒋建雄和张天真（2003）的方法稍有改动：LiCl 浓度由 8 mol · L-1 提高到
10 mol · L-1，加入 LiCl 后冰浴 6 ~ 8 h 改为–20 ℃沉淀 3 h，用预冷（–20 ℃）的异丙醇沉淀 RNA
之前加入 1/10 体积 2 mol · L-1 KAc（pH 5.5）以除去多糖。RNA 提取缓冲液：CTAB：2%；Tris-HCl
（pH 8.0）100 mmol · L-1；NaCl 1.4 mol · L-1；EDTA（pH 8.0）20 mmol · L-1；β–巯基乙醇 0.2%；
DEPC 水定容。
1.2.2 第一链含有锚定引物的 cDNA的合成
在微量离心管中配制反应液：Template RNA 2 μg；10× RNA PCR buffer 4 μL；dNTP Mixture（each
10 mmol · L-1）2 μL；Rnase Inhibitor（40 U · μL-1）1 μL；Oligo（dT）-3sites Adaptor Primer（2.5 μmol · L-1）
2 μL；AMV Transcriptase XL（5 U · μL-1）1 μL；RNase-free H2O 补足到 20 μL。按以下条件进行反
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转录反应：30 ℃ 10 min；50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；5 ℃ 5 min。当使用二级结构较为复杂的模
板 RNA 时，在进行 cDNA 成反应之前将 RNA 溶液于 65 ℃加热 5 min 后迅速置于冰中，利用这种
办法可以减弱二级结构的影响，提高逆转录反应效率。转录产物的质量通过 ACTIN 序列设计的引物
（Actin-F 和 Actin-R）来扩增检测。94 ℃预变性 8 min，然后进行以下循环，94 ℃变性 30 s，52 ℃
煺火 45 s，72 ℃延伸 2 min，共进行 30 个循环。最后 72 ℃延伸 10 min。
1.2.3 LAC cDNA扩增与全长序列的获得
根据番茄 LAC 基因 EST 片段设计特异引物 Lac-f 和 Lac-r。94 ℃预变性 5 min，然后进行以下
循环，94 ℃变性 30 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，共进行 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
5′ 端 cDNA 序列的扩增：首先根据试剂盒说明纯化反转录产物与末端加尾，根据已知的中间片
段序列，设计嵌套式 PCR 引物，LAC 外侧引物为 LAC5′-F1，内侧引物为 LAC5′-F2。第一轮 PCR：
加尾纯化产物 15 μL；10× LA PCR buffer 5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1 LAC5-F1/3
2.0 μL；10 μmol · L-1 AAP 2.0 μL；25 mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq E（5 U · μL-1）0.5 μL；ddH2O
加到 50 μL。94 ℃预变性 5 min，然后进行以下循环，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，
共进行 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。第二轮 PCR：第一轮扩增产物 2 μL；10× LA PCR buffer
5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1 LAC5-F2/4 2.0 μL；10 μmol · L-1 AUAP 2.0 μL；25
mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq 酶（5U · μL-1）0.5 μL；ddH2O 加到 50 μL。94 ℃预变性 5 min，然后
进行以下循环，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，共进行 30 个循环；最后 72 ℃延
伸 10 min。第三轮 PCR 以 2 μL 第二轮扩增产物为模板，其它条件和反应程序同第二轮。
3′ 端 cDNA 序列的扩增：根据获得的中间片段的序列设计嵌套 PCR 引物，LAC 扩增所用外测
引物为 LAC3′-F1，内侧引物为 LAC3′-F2 序列。3′ 端接头引物为 3 sites adaptor primer。PCR 扩增条
件为：AMV 反转录产物 2 μL；10× LA PCR buffer 5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1 正
向引物 2.0 μL；10 μmol · L-1 3 site adaptor 2.0 μL；25 mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq 酶（5U · μL-1）
0.5 μL；ddH2O 加到 50 μL。94 ℃预变性 5 min，然后进行以下循环，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 2 min，共进行 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR 产物的回收根据 TaKaRa 公司的 Agarose Gel DNA Purification Kit 试剂盒操作。
利用正向引物 LAC5′-F 和反向引物 LAC3′-R 扩增获得 LAC cDNA 全长序列。LAC PCR 反应程
序为：94 ℃预变性 5 min，然后进行以下循环，94 ℃变性 30 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，
共进行 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
以幼嫩叶片为植物材料，为检测转基因植株，利用 SDS 法提取 DNA（孙鑫 等，2004）。
1.3 序列测定及分析
用试剂盒将 PCR 产物回收，连接 pMD18-T，转化大肠杆菌 DH5α，选取一个阳性重组子，利用
pMD18-T 载体多克隆位点两侧的 M13-48 和 M13-47 引物对目的基因序列进行自动测序，序列测定
由北京博尚生物技术有限公司完成。测序结果用以下软件进行分析：
序列的 ORF 查找，翻译，酶切位点分析由 http：//us. expasy. org/ tools/ protparam. html 完成。序
列同源性比较由 GenBank 的 BLAST 程序进行（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/）。氨基酸一级
结构（等电点、分子量）的预测由 Computer pI/MW 完成（http：//www. expasy. ch/ tools/ pi_tool. html）。
蛋白质特性分析和氨基酸的多序列比较、同源树分析由 DNAMAN 5.2 程序完成。蛋白质结构域预测
由 TMHMM2.0 program（http：//myhits. isb-sib. ch/ cgi-bin/ motif_scan）实现。
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番茄漆酶基因 LeLACmiR397 的克隆与表达分析.
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图 2 LAC 时空表达分析
Fig. 2 Temporal and spatial expression of LeLACmiR397
图 1 存在识别位点的番茄 EST 序列与拟南芥 AtLAC2 和
miR397a 序列比较
Fig. 1 Sequences comparison between miR397a recognition
site，tomato EST sequence containing miR397
recognition site and AtLAC2
1.4 表达载体构建
将带有 LeLACmiR397 基因序列的 pMD18-T 载体质粒用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切，得到 LeLACmiR397
基因片段。将此片段与经 BamHⅠ和 SalⅠ酶切的 pBI121 连接，得到 pBI121-LeLACmiR397 表达载体。
利用 CaMV 35S 启动子和 miR397a 基因的前体序列构建番茄部分 miR397a 基因序列的超表达载
体。构建过程为：将带有拟南芥 miR397a 基因前体序列的 pMD18-T 质粒用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切，
得到 miR397a 基因片段，将此片段与经 BamHⅠ和 SalⅠ酶切的 pBI121 连接，得到 pBI121-miR397a
表达载体。
1.5 农杆菌介导的番茄转化与逆境胁迫下转基因植株的生理生化测定
根据文献（陈珍和朱诚，2008），用农杆菌介导法转化番茄。
SOD 活性的测定采用 NBT 还原法（Ginnopolitis & Ries，1977），POD 活性测定参照 Maehly 和
Chance（1954）的方法，PPO 活性测定参照 Wissemann 和 Lee（1980）的方法。
2 结果与分析
2.1 番茄中 miR397 靶基因 LeLACmiR397 片段的分子克隆
在 GenBank 进行 BLAST 分析，共获得 15
个番茄 LAC 基因相关的 EST 片段。对这些 EST
进行同源比较和序列拼接，最后得到 5 个较长
的无重叠的 EST 片段。对这 5 个较长的 EST
片段序列进行 microRNA 识别位点预测分析，
在其中一个长度为 350 bp 的 EST 片段上（图 1）
发现长度为 21 bp 的 miR397a 的识别序列，其
成熟序列与该识别序列的匹配性很好，只有两
个碱基不匹配；与之相似，在拟南芥中，
miR397a 靶基因 LAC 的识别序列中有 3 个碱基与 miR397a 成熟序列不匹配（Abdel-Ghany & Pilon，
2008）；表明该基因可能是 miR397a 的靶基因，并将此基因命名为 LeLACmiR397。
2.2 LeLACmiR397 基因的表达分析
在进行 LeLACmiR397 基因的 5′-和 3′-RACE
扩增时发现，番茄叶片 cDNA 中扩增不到 LAC
基因，而从愈伤组织 cDNA 中则可以。为了进
一步检测番茄 LeLACmiR397 基因的时空表达特
性，从番茄不同组织和器官中提取总 RNA，反
转录 cDNA 为摸板，用半定量 PCR 的方法检测
了 LeLACmiR397 在不同组织和器官中的表达模
式（图 2）。
用 LeLACmiR397 基因特异引物 LAC5′-F 和 LAC3′-R 检测 LeLACmiR397 基因在不同组织和器官中的
表达强度。结果显示，LeLACmiR397 基因在根中的表达水平最高，其次是愈伤组织，在花和成熟果实
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中也有低水平表达，而在叶片中几乎没有检测到表达产物，表明 LeLACmiR397 基因在番茄的根中可能
发挥重要作用。
2.3 RT-PCR 和 RACE 扩增获得 LeLACmiR397 的全长 cDNA
根据电子克隆的 EST 片段，设计了分子克隆该基因的特异引物，通过 RT-PCR 获得了该基因片
段。5′-RACE 扩增后，得到 1 条长度约为 600 bp 的特异性片段（图 3，A），测序后发现其长度为 612
bp，并能够和 EST 片段正确拼接，拼接后的片段包括 1 个含有起始密码子 ATG 的长 ORF（开放阅
读框），且翻译后得到的多肽为 LAC 类蛋白，表明得到的 5′-RACE 扩增产物为目的基因片段，且已
经包含部分 5′-UTR。
3′-RACE 扩增后，得到 1 条长度约为 1 000 bp 的特异性片段（图 3，B），测序后发现其长度为
1 047 bp，含有 Poly-A 序列，并能够和 5′-RACE 拼接产物正确拼接，拼接后的片段包括 1 个含有终
止密码子 TAG 的长 ORF，翻译后得到的多肽为 LAC 类蛋白，表明得到的 3′-RACE 扩增产物为目的
基因片段，且已经包含 3′-UTR。
通过 DNA 数据库搜索、EST 拼接和 RACE 扩增，得到了含有 miR397a 识别位点的 LAC 基因片
段。使用 DNAMAN 软件，把 RACE 扩增产物和 EST 中间序列进行拼接，获得了番茄 LAC 基因全
长 cDNA 序列，序列分析表明，该 LAC 基因全长为 1 952 bp，起始密码子 ATG 和终止密码子 TAG
分别始于第 47 和 1 763 个核苷酸处，全长 cDNA 包括 46 bp 的 5′-UTR（非翻译区）、1 719 bp 的 ORF
和 187 bp 的 3′-UTR，ORF 编码 1 条 572 aa 的多肽，推测分子量为 63 306 Da。
为了克隆该基因，根据其碱基序列设计了 LAC 基因全长特异引物 LAC5′-F 和 LAC3′-R，并从番
茄愈伤组织的 cDNA 中扩增到了全长 LAC 基因（图 3，C），则该基因为 LeLACmiR397，并在 GenBank
登录注册，注册号为 EU503151。另外将 LeLACmiR397 在番茄网上（http：//solgenomics. net/）blast，
找到其对应的基因为 Solyc07g049460.2.1。


图 3 番茄 LeLACmiR397 基因的克隆
Fig. 3 The clone of tomato LeLACmiR397 gene

2.4 LeLACmiR397 蛋白序列分析及结构域预测
利用 GenBank 的 BLAST 程序对 LeLACmiR397 基因序列的同源性进行了在线分析，并利用分析软
件 DNAMAN 5.2 进行氨基酸多序列比对（图 4），用 MEGA6 进行同源树分析（图 5）。结果显示，
在不同植物中，与 LeLACmiR397 基因编码蛋白氨基酸同源性较高的基因都属于 LAC 基因家族成员，
其中拟南芥 AtLAC7 和豌豆 PsLAC 与 LeLACmiR397 的氨基酸同源性最高，分别为 64%和 60%，其次
是拟南芥 AtLAC9（NM_120182）和 AtLAC8，同源性均为 55%。这说明克隆的含有 miR397a 识别
位点的 LeLACmiR397 基因属于番茄 LAC 基因家族成员。
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图 4 LeLACmiR397 与其它植物 LAC 氨基酸序列比对
Fig. 4 Alignment of inferred aa sequences of LeLACmiR397 and LACs in other plants

从进化树中可以看到，拟南芥 AtLAC 基因家族的各个成员之间同源性并不是最高的，它们在进
化树中相当分散，分别与不同物种的 LAC 具有就较高的同源性。拟南芥 AtLAC 基因家族的 17 个成
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员功能上不存在冗余，它们分别起不同的作用，说明不同植物中同源性较高的 LAC 基因可能发挥着相
似的功能。
对 LeLACmiR397基因推测蛋白的结构域进行了在线分析（http：//myhits.isb-sib.Ch/cgi-bin/motif_scan），
结果显示，在番茄 LeLACmiR397 基因编码的蛋白中有 1 个 LAC 蛋白普遍存在的 Cu–氧化酶结构域
（109 ~ 221 氨基酸）。这预示了 LeLAC 蛋白的功能与已报道的其他植物中的漆酶蛋白功能类似。


图 5 LeLACmiR397 进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic tree of LeLACmiR397


2.5 pBI121-miR397a 转基因番茄的获得以及 miR397 对番茄中 LAC 基因表达的调控
由于各物种间小分子 RNA 的序列高度保守，miR397 家族包括两个基因：miR397a 和 miR397b。
为了鉴定 miR397a 对番茄中 LAC 基因的转录后调控，将拟南芥中的 miR397a 序列克隆并插入到植
物过表达载体中转化农杆菌，然后转化番茄（图 6）。
为进一步鉴定抗卡那霉素番茄植株确实为转基因植株，根据 pBI121 载体中抗卡那霉素的基因
设计了 1 对能扩增 600 bp 产物的专一引物 NPTII-F 和 NPTII-R，对转基因番茄进行 PCR 检测，确定
确实得到转基因植株（图 7）。将其生根后移至田间大棚种植，与对照植株相比，没有表现出生长异
常，在田间能够正常结果（图 6）。
选取果实和根，探究 LeLACmiR397 基因表达的转录后调控。结果表明，在非转基因番茄的果实和
根中都检测到了 LeLACmiR397 基因的表达（图 8），与时空表达分析结果（图 2）一致；同时，在转基
因番茄的果实和根中检测不到 LeLACmiR397 基因的转录，表明 LeLACmiR397 基因在 miR397a 过量表达
的转基因番茄中可能被特异性切割降解了，miR397a 基因在番茄中的过量表达可能造成了
LeLACmiR397 基因的转录后沉默。

赵先炎，庞明利，赵 强，任怡然，郝玉金，由春香.
番茄漆酶基因 LeLACmiR397 的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298. 1293

图 7 转基因番茄 PCR 检测
Fig. 7 PCR detection of transgenic tomato
图 8 LeLACmiR397 基因的表达量
Fig. 8 Transcripts of LeLACmiR397

图 6 转 miR397a 基因番茄的获得
A：Kan 生根培养基上筛选的幼苗；B：移栽的转基因幼苗；C：转基因（左）和非转基因（右）植株；
D：转基因（左）和非转基因（右）果实。
Fig. 6 Detection of transgenic tomato of miR397a
A：Tomato seedling on rooting medium with Kanamycin；B：A transgenic seedling in soil；C：The growth situation of transgenic（left）and
non-transgenetic（right）tomatos；D：Transgenic（left）and non-transgenetic（right）fruits.

如图 9 所示，对转基因和非转基因番茄中的多酚氧化酶（PPO）活性进行了检测，转基因番茄
低于非转基因对照，进一步证明了 LeLACmiR397 基因在 miR397a 过量表达的转基因番茄中被沉默。转
基因植株中 SOD 和 POD 酶活性均比非转基因植株中相应的酶活性降低。相同质量蛋白质的粗酶液
中，转基因植株的 SOD 和 POD 酶活性分别占非转基因植株的 70%和 59%。SOD、PPO 和 POD 均


图 9 野生型和转基因番茄中氧化酶活的分析
Fig. 9 Analysis of oxidases activity in wild type and transgenic tomato
Zhao Xian-yan，Pang Ming-li，Zhao Qiang，Ren Yi-ran，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLACmiR397 gene.
1294 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.
图 10 转基因和野生型番茄 LeLACmiR397 的半定量 RT-PCR 分析
Fig. 10 Analysis of LeLACmiR397 expression in transgenic tomato
and wild tomato with semi-quantitative RT-PCR
与植物抗逆性相关，在转基因番茄中它们的活性都有所降低，但在正常生长条件下，转基因与非转
基因番茄之间没有出现明显的表型差异（图 6）。
2.6 LeLACmiR397 转基因番茄的植株获得及抗性研究
将拟南芥 LeLACmiR397 基因序列 PCR 产物与克隆载体 pMD18-T 连接，选择正向连入克隆载体的
目的片段，通过 SalⅠ和BamHⅠ双酶切后经T4 DNA连接酶连入用同样两种酶切的表达载体 pBI121，
得到含 LeLACmiR397 嵌合基因的 pBI121-LeLACmiR397 植物表达载体。在 pBI121-LeLACmiR397 中，原本
在 pBI121 上的 GUS 基因被 LeLACmiR397 基因取代，这样 miR397a 基因的表达直接受 CaMV 35S 启动
子和 NOS 转录终止序列（NOS-T）的调控。
为了进一步验证 LeLACmiR397 参与番茄植
株的抗性反应，将构建的植物表达载体转化农
杆菌，侵染番茄叶片，对野生型和获得的转基
因番茄分别提 RNA，反转录，半定量 RT-PCR
检测发现，L1、L3、L4 株系表达量较低，L2、
L6 株系表达量较高， L5 株系未检测到
LeLACmiR397 的表达（图 10）。
获得转 LeLACmiR397 基因的番茄株系后，分
别用 1/2MS、1/2MS + 0.5 mmol · L-1 丁香酸、1/2MS + 2 mmol · L-1 芥子酸处理，结果显示，无论 1/2
MS 还是其添加 0.5 mmol · L-1 丁香酸、2 mmol · L-1 芥子酸处理，转基因番茄根系比野生型更长，长
势更好（图 11），说明转 LeLACmiR397 基因的番茄株系增强了对丁香酸和芥子酸的伤害抗性，这表明
LeLACmiR397 基因参与番茄植株的抗性响应。



图 11 野生型（WT）和转基因番茄（L4，L6）株系在 1/2MS 及其添加丁香酸和芥子酸培养基上的生长状态
Fig. 11 The growth phenotypes of transgenic tomato（L4 and L6）and wild tomato in medium 1/2MS，
1/2MS + 0.5 mmol · L-1 syringic acid and 1/2MS + 2 mmol · L-1 sinapic acid

赵先炎，庞明利，赵 强，任怡然，郝玉金，由春香.
番茄漆酶基因 LeLACmiR397 的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298. 1295

3 讨论
3.1 番茄 LeLACmiR397 的基因特征
本文根据具有 miR397a 识别位点的番茄 LAC 基因相关的 EST 片段，进行 5′-和 3′-RACE 扩增，
从‘中蔬四号’番茄的愈伤组织中克隆到了番茄 LeLACmiR397 基因的全长 cDNA，该基因编码漆酶类
（Laccases）蛋白，并具有 miR397 的识别序列。为了判明该基因是否属于番茄 LAC 基因家族，首
先根据推测氨基酸序列构建番茄 LeLACmiR397 系统发育进化树。在进化树上，与 LeLACmiR397 相近的
都是不同植物的 LAC 蛋白，其中，关系最近的是拟南芥 AtLAC7 和豌豆 PsLAC，对番茄 LeLACmiR397、
拟南芥 AtLAC7 和豌豆 PsLAC 进行氨基酸同源性比较分析，它们的同源性都在 60％以上。
拟南芥 LAC 蛋白结构中含有 4 个 Cu 离子，铜离子在 LAC 把底物氧化成水和低聚物的过程中
起关键作用（LaFayette et al.，1999）。在液体培养条件下，铜离子能够诱导除 vv‐lac2、vv‐lac3
和 vv‐lac7 之外的其余 8 个草菇漆酶基因的表达，且适宜浓度的铜离子有助于草菇漆酶活性的增加
（吴林 等，2014）。对 LeLACmiR397 的氨基酸序列进行蛋白质结构域预测发现，其蛋白质结构中存
在 1 个 Cu–氧化酶结构域，在其它植物上的研究表明，LAC/漆酶是一种含铜的糖蛋白（多酚氧化
酶），都具有 Cu–氧化酶结构域（109 ~ 221 氨基酸）。这表明番茄 LeLACmiR397 基因和拟南芥 LAC 基
因编码的蛋白质具有相似的结构域，在植物中可能发挥着相似的作用。
拟南芥上的研究表明，有些 LAC 基因的表达模式是组成型，有些则只在特异组织或特定发育时
期表达（McCaig et al.，2005）。用半定量 RT-PCR 的方法检测 LeLACmiR397 在不同组织和器官中的表
达发现，发现该基因在番茄的根中表达最高，其次是愈伤组织、花和成熟果实，在叶和茎中不表达。
说明番茄 LeLACmiR397 可能只影响特定组织或器官的生长发育。
3.2 miR397a 对番茄 LeLACmiR397 基因的转录后调控
拟南芥、水稻和杨树的 LAC 基因都受到 microRNA 介导的转录后调控（Jones-Rhoades & Bartel，
2004；Sunkar & Zhu，2004；Lu et al.，2005；Sunkar et al.，2005）。miRNAs（miR408、miR397 和
miR957）及其靶基因 mRNA 的水平负相关（Abdel-Ghany & Pilon，2008），如果 miRNA 的表达量
增高，靶基因 mRNA 的水平就会相应的降低。过量表达 miR397a 的转基因番茄中，LeLACmiR397 的
表达量几乎检测不到，而且转基因 miR397a 番茄中 PPO，SOD 和 POD 的含量也有所降低，这表明
miR397 可能抑制了番茄体内 LeLACmiR397的转录表达，从而造成 LeLACmiR397的沉默。基于 LeLACmiR397
的氧化物酶的作用，LeLACmiR397 的沉默引起了一些氧化酶的合成减少。LeLACmiR397 基因表达降低或
沉默，说明 LeLACmiR397 基因可能是 miR397a 的靶基因。本研究中， miR397a 在番茄中过量表达能
同时影响 SOD、POD 和 PPO 酶活性，至于在番茄中是否也存在着多个被 miR397a 识别的 LAC 基因
还有待进一步研究证实。
3.3 番茄 LeLACmiR397 基因的功能分析
以前的研究表明，LAC 基因在植物中的功能是多种多样的，LAC 基因在高等植物中含量较高，
在木质素合成（Sterjiades et al.，1992；Dean et al.，1998；Ranocha et al.，1999）、伤口愈合（Dean et
al.，1998）、逆境响应（Liang et al.，2006）、细胞壁结构和完整性的维持（Ranocha et al.，1999）等
方面都起到重要作用。
漆酶活性与酚酸类物质的抗性呈正相关，LAC 基因的表达是植株产生抗性的直接原因之一。王
Zhao Xian-yan，Pang Ming-li，Zhao Qiang，Ren Yi-ran，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLACmiR397 gene.
1296 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.
国栋（2004）将棉花 GaLAC1 基因在拟南芥中过量表达，发现转基因拟南芥对芥子酸、丁香酸、香
草酸及芥子酸/丁香酸，芥子酸/香草酸等抗性增强。过表达 miR397a 造成 LeLACmiR397基因沉默，能
用来研究 LeLACmiR397 基因在番茄中的功能。本文通过在番茄中过量表达 LeLACmiR397，研究了番茄中
该基因的功能。LeLACmiR397 基因过表达后，在丁香酸和芥子酸胁迫下转基因植株幼苗根系变长，说
明 LeLACmiR397 基因可能提高了番茄的抗性。LeLACmiR397 基因在番茄不同组织和器官中表达程度不
同，说明其在不同组织和器官中发挥的作用存在差异，特别是在根中有着重要作用。

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“中国园艺学会 2015 年学术年会”征文通知
“中国园艺学会 2015 年学术年会”即日起征集：①研究论文摘要，②有关园艺学进展的综述。经审查合格的摘
要将收入《园艺学报》2015 年增刊，综述将收入 2015 年第 9 期，均于会前出版。
征文内容：有关果树、蔬菜、西瓜甜瓜、观赏园艺植物及其它园艺植物的种质资源、遗传育种、生物技术、栽
培技术与生理、采后技术与生理等方面未曾发表过的研究论文摘要和文献综述。
投稿要求：摘要稿件需将电子文件发送至本刊电子邮箱（ivfyyxb@caas.cn），综述稿件需登录本刊网站（http：//
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