全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：239–248.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0602；http：//www. ahs. ac. cn 239
收稿日期：2015–10–09；修回日期：2016–02–02
基金项目：重庆市研究生科研创新项目（CYS2015074）；国家科技支撑计划项目（2013BAD02B02）；重庆科技支撑示范工程项目
（cstc2014fazktjcsf80033）；重庆市科委重点实验室项目；西南大学基本科研业务费专项资金项目（XDJKQ015C015）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：heshaolan@cric.cn）
柑橘 CitERF9 和 CitAP2-7 在不同逆境和外源激
素处理下的表达
董翠翠，马岩岩，谢让金，邓 烈，易时来，吕 强，郑永强，何绍兰*
（西南大学/中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要：以‘资阳’香橙（Citrus junos‘Ziyang’）为试材，分别对 CitERF9 和 CitAP2-7 进行了分析。
结果表明：CitERF9 基因的开放阅读框（ORF）为 735 bp，含有 1 个外显子，可编码 244 个氨基酸残基的
多肽。CitAP2-7 的开放阅读框为 1 080 bp，具有 6 个外显子，可编码 360 个氨基酸残基。同源分析结果显
示，这两个基因编码的蛋白与大豆、蓖麻、碧桃、苜蓿等植物中的同源蛋白有 81% ~ 84%的相似性。实时
定量分析表明：CitERF9 和 CitAP2-7 在植株不同组织间的表达具有明显差异。在根中，CitERF9 受各种胁
迫处理诱导，而 CitAP2-7 主要受 ABA、NaCl、脱水等的诱导。在叶中，各种胁迫均对 CitERF9 具有诱导
作用，其模式与根中相似，而 CitAP2-7 的表达则主要受 ABA、ACC、MeJA、SA 等激素以及低温和 NaCl
的抑制。试验结果表明，CitERF9 和 CitAP2-7 参与了激素和非生物胁迫的响应过程。
关键词：柑橘；CitERF9；CitAP2-7；基因表达；激素；逆境胁迫
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0239-10

Expression of Two Citrus AP2/ERF Genes Under Different Hormone and
Stress Treatments
DONG Cui-cui，MA Yan-yan，XIE Rang-jin，DENG Lie，YI Shi-lai，LÜ Qiang，ZHENG Yong-qiang，
and HE Shao-lan*
（Citrus Research Institute，Southwest University–Chinese Academy of Agricultural Scieneces，Chongqing 400712，China）
Abstract：Two AP2/ERF genes，CitERF9 and CitAP2-7 were analyzed in Citrus junos‘Ziyang’. The
data showed that CitERF9 genomic sequence contained a single exon of 735 bp long，which could encode
a protein of 244 amino acid residues. In contrast，CitAP2-7 genomic sequence possessed 5 introns and its 6
exons could encode a protein of 360 amino acid residues. Sequence alignment showed that CitERF9 and
CitAP2-7 shared 81%–84% amino acid identities with corresponding AP2/ERF members from soybean，
castor，peach and alfalfa. Real time quantitative analysis revealed that the expression of CitAP2-7 and
CitERF9 in different tissues exhibited different patterns. In roots，CitERF9 was induced by all hormone
and stress treatments，whereas CitAP2-7 was mainly modulated by NaCl，ABA and dehydration. In leaves，
CitERF9 was up-regulated by all treatments，similar to that in roots. But CitAP2-7 was suppressed by
ABA，ACC，MeJA，SA and NaCl treatments. The results suggested the involvement of both CitERF9 and

Dong Cui-cui，Ma Yan-yan，Xie Rang-jin，Deng Lie，Yi Shi-lai，Lü Qiang，Zheng Yong-qiang，He Shao-lan.
Expression of two citrus AP2/ERF genes under different hormone and stress treatments.
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CitAP2-7 in the responses of citrus to stresses and relevant hormones.
Key words：citrus；CitERF9；CitAP2-7；gene expression；hormone；stress

近年来研究发现，在植物逆境响应过程中，转录因子发挥着关键作用，如 MYB（Kranz et al.，
1998）、GRAS（Tian et al.，2004）、NAC（Lijavetzky et al.，2003）、AP2/ERF 类（Sakuma et al.，2002）
等。其中 AP2/ERF 类转录因子受到研究者的广泛关注，并成为研究热点。AP2/ERF 类转录因子为
超基因家族，其含有 1 个由 60 ~ 70 个氨基酸构成的 AP2/ERF 特征结构域，该结构域可以特异识别
GCC 启动子元件（AGCCGCC）来调控相关基因的表达。根据特征结构域可将 AP2/ERF 类转录因
子分为 3 个家族（Nakano et al.，2006），即 AP2 家族（含有两个重复的 AP2/ERF 结构域）、ERF 家
族（含有 1 个 AP2/ERF 结构域）和 RAV 家族（含有 1 个 AP2/ERF 结构域和 1 个 B3 结构域）。另外，
根据 AP2/ERF 结构域保守氨基酸的不同，又将 ERF 转录因子家族进一步划分为 ERF 亚家族和
CBF/DREB 亚家族（Sakuma et al.，2002）。当前已对拟南芥（Stockinger et al.，1997；Lasserre et al.，
2008；Nakano et al.，2012）、大豆（Mazarei et al.，2002）、葡萄（Zhuang et al.，2009；Licausi et al.，
2010）、桃（Zhang et al.，2012）、黄瓜（Hu & Liu，2011）和番茄（Upadhyay et al.，2013；Liu et al.，
2014）等中的 AP2/ERF 类转录因子进行过鉴定分析，Xie 等（2014）在柑橘中鉴定出 126 个 AP2/ERF
家族成员，并对各成员的基因结构以及在果实发育阶段的表达量进行了分析，但各成员在激素处理
和生物、非生物等胁迫下的响应模式至今尚未见研究报道。
大量研究表明：AP2/ERF 家族成员参与了植物的生长发育与逆境响应过程，但不同成员间的生
物学功能存在明显差异。Wang 等（2007）发现 MdERF1 主要在苹果成熟果实组织中表达，在其他
组织仅有少量表达，而 MdERF2 只在成熟果实中表达，意味着 MdERF1 和 MdERF2 可能是调控苹果
成熟的特异转录因子；在大豆中，GmERF089 的表达量受高盐、干旱、乙烯、水杨酸、茉莉酸等胁
迫上调（Zhang et al.，2008），表明该基因参与了逆境响应过程；过量表达大豆 GmERF3 基因可增
强烟草转基因植物对高盐、干旱、烟草花叶病毒的抵抗能力（Zhang et al.，2009），含 CitERF1 基
因的转基因烟草植株可增强对冷害的抗性（Ma et al.，2014）；在转基因番茄植株中，Sl-ERF2 通过
诱导 mannanase2 基因的表达而促进种子提前萌发（Pirrello et al.，2006）；拟南芥中的 AP2 调控着
第一轮和第二轮的花器发育（Drews et al.，1991）。
前期工作中对柑橘所有 AP2/ERF 家族成员基因与拟南芥相应家族基因聚类分析发现，CitERF9
和CitAP2-7与拟南芥AtERF14和AtANT逆境响应基因同源性较高（Klucher et al.，1996；Oñate-Sánchez
et al.，2007），推测这两个基因可能参与了柑橘的抗逆过程。本试验中以柑橘常用抗碱、抗旱砧木
‘资阳’香橙为试材，利用生物信息学和基因表达等方法，对 CitERF9 和 CitAP2-7 的基因结构、蛋
白质性质以及在激素和非生物胁迫下的表达进行分析，以期为进一步解析 CitERF9 和 CitAP2-7 的生
物功能提供新的依据，为柑橘抗逆新品种选育和发掘奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试材及其处理
2014 年 12 月在国家柑橘种质资源圃（重庆）采集‘资阳’香橙（Citrus junos‘Ziyang’）种子，
依次用 1 mol · L-1 的 NaOH 处理 30 min，3%次氯酸消毒 30 min，无菌水清洗 3 ~ 5 遍，置于 MS 培
养基上，在 28 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗条件下培养 4 周。待幼苗长出第 2 片真叶时，选取生长势一
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表 1 本试验所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Forward primer
CitERF9-F
CitERF9-R
CitAP2-7-F
CitAP2-7-R
Actin-F
Actin-R
ATGGTGAAGACTGAGCAAAGGAT
TACTTTCTGGTGGCTTTT
TGTAGACATCAAGCAATAAGT
AGCCTGGTAAGAAGCACA
CCCCATCGTTACCGTCCAG
CGCCTTGCCAGTTGAATATCC
致的健壮幼苗，用无菌水清洗干净。擦干之后在室温 25 ℃条件下进行激素和非生物胁迫处理，每
处理选取 10 株幼苗，重复 3 次。
激素包括 ABA（100 μmol · L-1）、ACC（20 mg · L-1）、MeJA（2 mg · L-1）和 SA（100 mg · L-1），
将清洗干净的幼苗放入含有激素的密闭瓶中，每种激素分别处理 0（对照）、1、4、8、12 和 24 h。
非生物胁迫处理包括 NaCl（250 μmol · L-1）、生理脱水和 4 ℃低温处理。NaCl 处理方法与激素
相同，4 ℃低温处理在冰箱中进行，处理时间都为 0（对照）、1、4、8、12 和 24 h。生理脱水采用
吸水滤纸包裹植株根部，夹子夹紧，使其自然脱水 0（对照）、0.5、1、3 和 6 h。
分别收集各处理幼苗的根和叶，立即放入液氮中速冻后保存于–80 ℃冰箱中备用。
1.2 总 RNA 提取与 cDNA 合成
使用 RNA prep pure Kit 试剂盒（天根生化科技有限公司）提取‘资阳’香橙总 RNA，使用 TaKaRa
公司的 Prime ScriptTM RT reagent Kit 反转录试剂盒合成第一条 cDNA 链。上述操作过程均按照试剂
盒说明书进行。
1.3 基因结构与序列分析
从 phytozome 数据库中获得 CitERF9 和 CitAP2-7 的 mRNA 及其相应的基因组序列，使用 GSDS
（http：//gsds. cbi. pku. edu. cn/）工具进行基因结构分析。用 BLASTp（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/
Blast. cgi）分析氨基酸序列同源性，使用在线软件 Conserved Domains（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/
cdd）进行蛋白保守结构域分析，用 EXPASY 软件（http：//web. expasy. org/protparam/）分析蛋白的
相对分子量和等电点（Artimo et al.，2012），使用软件 CLUSTALX 进行多重序列比对。系统进化树
采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），由 MEGA6.0 构建。利用 ProtScale Tool 软件（http：//cn. expasy.
org/tools/pwtscMe. html）分析 CitERF9 和 CitAP2-7 蛋白的疏水性/亲水性（Kyte & Doolittle，1982）。
1.4 实时荧光定量 PCR 分析
采 用 软 件 Beacon Designer 7.0 设 计
CitERF9 和 CitAP2-7 的实时定量引物，内参引
物为柑橘 Actin 基因，引物信息见表 1。在
CFX96 Touch 荧光定量 PCR 仪上检测 CitERF9
和 CitAP2-7 基因的表达量。10 μL 反应体系：5
μL 荧光染料（Bio-Rad 公司）、3 μL H2O、0.5 μL
引物、1 μL cDNA。反应程序：95 ℃ 10 min，
95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，40 个循环。每处理
设 3 次生物学重复和 3 次平行样重复。相对表达量采用 2-∆∆Ct 法计算，用 SPASS19.0 软件对数据显
著性分析。
2 结果与分析
2.1 CitERF9 和 CitAP2-7 基因的序列分析
基于柑橘全基因组，获得了 CitERF9 和 CitAP2-7 的 mRNA 及其相应的基因组 DNA 全长，结果
（图 1）表明 CitERF9 的开放阅读框为 735 bp，有 1 个外显子，不具有内含子，可编码 244 个氨基
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酸，预测蛋白的分子量为 26.7 kD，等电点 6.73；而 CitAP2-7 的开放阅读框长 1 080 bp，有 6 个外
显子，5 个内含子，可编码 360 个氨基酸残基，分子量为 40.3 kD，等电点 9.27。








图 1 CitERF9 和 CitAP2-7 基因组序列结构
Fig. 1 The genomic structure of the CitERF9 and CitAP2-7

使用 BLASTp 程序分别对 CitERF9、CitAP2-7 的蛋白序列进行同源性比对，结果显示与大豆、
蓖麻、碧桃、苜蓿等相应蛋白序列的同源性达 81% ~ 84%。通过多重序列比对发现，CitERF9 蛋白
序列含有 1 个 AP2/ERFs 家族特征结构域，并且其中存在 1 个 WLG 保守元件（图 2），区域外含有
两个保守元件，分别为 CMII-1 和 CMII-3。CitAP2-7 蛋白序列含有两个 AP2 结构域，在第 2 个结构
域中存在 1 个 YRG 保守元件（图 3）。
为了进一步研究 CitERF9 和 CitAP2-7 的亲缘关系，本试验中利用拟南芥的 AP2／ERF 类转录因
子构建了 NJ 进化树。结果（图 4）表明 CitERF9 与拟南芥 AtERF14 蛋白同源性较高（84%），而
根据 Nakano 等（2006）对拟南芥 ERF 家族成员分类可知，CitERF9 基因属于 ERF 亚家族中的第
A-5 亚组 a 组。CitAP2-7 与 AtAIL1 和 AtANT 的蛋白同源性较高，属于 AP2 家族（Klucher et al.，
1996）。
























图 2 CitERF9 与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析
Fig. 2 Amino acid sequence alignment between CitERF9 and its homologous proteins from other plant species
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图 3 CitAP2-7 与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析
Fig. 3 Amino acid sequence alignment between CitAP2-7 and its homologous proteins from other plant species



















图 4 CitERF9 和 CitAP2-7 与拟南芥相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析
分支处的数值表示支持率。
Fig. 4 Phylogenetic tree of CitERF9 and CitAP2-7 and their homologous proteins from Arabidopsis thaliana
Number besides the branches indicate the support rate.
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图 5 CitERF9 和 CitAP2-7 在根和叶中的表达特性
Fig. 5 Expression profiles of CitERF9 and
CitAP2-7 in root and leaf
2.2 CitERF9 和 CitAP2-7 蛋白的亲水性/疏水性分析
CitERF9 第 7 位精氨酸亲水性最强，疏水性分值为–2.456，第 85 位丙氨酸疏水性最强，其值
为 1.689。而 CitAP2-7 疏水性和亲水性最强的氨基酸则位于第 21 位的脯氨酸（2.856）和第 30 位的
精氨酸（–4.1）。另外，CitERF9 和 CitAP2-7 蛋白的氨基酸序列中，具有多个明显的亲水区域。
2.3 CitERF9 和 CitAP2-7 基因的表达分析
2.3.1 在叶和根器官中的表达分析
从图 5 可以看出，CitERF9 在根中表达量高
于叶中，而 CitAP2-7 主要在叶中表达，表明这
两个基因的生物功能在根和叶中存在差异。
2.3.2 对激素处理的响应
CitERF9 和 CitAP2-7 对各激素处理均有响
应，但在根和叶中存在明显差异（图 6，图 7）。
ABA 处理能诱导 CitERF9 表达，在根中
CitERF9 的相对表达量在 4 h 上升至最高（0.28），在 24 h 时下降到 0.07，而在叶中的相对表达量
在 24 h 达到最大值（0.03）；CitAP2-7 基因在根中只是微弱的增加，在叶中 ABA 对其起下调作用。
ACC 是乙烯合成的直接前体物质，直接影响着乙烯在植物中的含量。ACC 处理幼苗后，CitERF9
在根中前期的表达量变化不大，在 12 h 后陡然上升后下降，在叶中的表达量呈先上升后缓慢下降的
趋势，说明 CitERF9 对 ACC 的响应叶早于根；在 ACC 处理下 CitAP2-7 在根中几乎不表达，在叶中，
ACC 处理对其起抑制作用，并且在叶中前期的表达量高于 CitERF9。
MeJA 处理 12 h 时，幼苗根中 CitERF9 的表达量最高，而在叶中 8 h 时表达量达最高，分别是
未处理时的 1.89 和 4.5 倍；CitAP2-7 在根和叶中的表达情况与 ABA 处理时相似。
在 SA 处理下，CitERF9 的表达量在根中呈先上升后下降的趋势，8 h 时表达量最高，在叶中的
变化不明显；而 CitAP2-7 在根中表达量变化不明显，在叶中 SA 处理则明显抑制了 CitAP2-7 的表达。












图 6 外源激素处理下 CitERF9 的表达特性
不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）。下同。
Fig. 6 Expression profiles of CitERF9 under exogenous hormone treatment of different plant hormones
The different letter means significant difference（P < 0.05）. The same below.
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图 7 外源激素处理下 CitAP2-7 的表达特性
Fig. 7 Expression profiles of CitAP2-7 gene under exogenous hormone treatment of different plant hormones

2.3.3 对非生物胁迫的响应
从图 8 可以看出，NaCl 胁迫处理后，根和叶中 CitERF9 的表达量在 12 h 时都达到最高；
CitAP2-7 的表达量在根呈现上升趋势，在 24 h 达到最大，而在叶中却先降低后又上升至正常值。4 ℃
低温处理对 CitERF9 基因的表达有显著影响，在根中 12 h 时表达量处于最大值，是不处理时的 9.57

























图 8 非生物胁迫下 CitERF9 和 CitAP2-7 表达特性
Fig. 8 Pression profiles of CitERF9 and CitAP2-7 genes under various abiotic stresses
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倍。在叶中 8 h 就达到了最大值，是不处理时的 16.1 倍；低温处理对 CitAP2-7 在根中的的表达影响
不明显，叶中 CitAP2-7 的表达则受到了抑制。
生理脱水胁迫处理时，CitERF9 表达量在根和叶中的趋势相同，只是在叶中的表达量很低；
CitAP2-7 的表达模式与 NaCl 处理时相似，表明 CitAP2-7 对高盐和干旱胁迫的响应机制可能相同。
3 讨论
CitERF9 的氨基酸序列具有 AP2/ERF 家族特有的保守结构域，在其结构域的 C 端具有一个
CMII-1 元件，这是 ERF 亚家族第 A-5 亚组的特征结构。而 CitAP2-7 的氨基酸序列含有两个保守结
构域，属于 AP2 亚家族。另外，通过亲水性／疏水性分析发现，CitERF9 和 CitAP2-7 都属于亲水性
蛋白，易溶解，其结构不稳定。该结果与前人对 TbAP2 （杨艳芳 等，2014）、CsERF-B3（吴致
君 等，2014）、BnaERF1、BnaERF2、BnaERF3（庄静 等，2008）的研究结果一致。
聚类分析发现，CitERF9 与 AtERF14 聚在一起。使用 BLASTp 程序对 CitERF9 蛋白序列进行同
源性比对发现，与 AtERF14 蛋白同源性达 84%。而 AtERF14 基因在植物的防御反应中发挥着重要
作用，其缺失的突变体易感染尖孢镰刀菌（Oñate-Sánchez et al.，2007），暗示了 CitERF9 可能参与
植物的生物胁迫响应。CitAP2-7 与 AtAIL1 和 AtANT 距离较近，属于 AP2 家族。其中 AtANT 参与了
拟南芥子房和雌配子体的发育过程（Klucher et al.，1996），由此推测 CitAP2-7 可能与植物生长发
育过程中的生殖生长有关，而 CitERF9 和 CitAP2-7 是否具有该功能还有待于进一步研究。
AP2/ERF 家族成员主要参与乙烯信号转导途径，而该途径是由乙烯受体 ERS 以及各级信号转导
元件，如 CTR1、EIN2、EILs 和 AP2/ERF 等组成。在乙烯信号传导途径中，乙烯信号传递到 EIN3
转录因子，使该蛋白特异地结合 ERF 基因上游的 PERE 元件从而启动该基因的表达，所合成的 ERF
以级联放大的方式转录激活下游基因的表达（Guo & Ecker，2004）。但有研究发现一些 AP2/ERF
家族成员不仅参与乙烯信号转导途径，还参与 MeJA（Sears et al.，2014）、SA（Gutterson & Reuber，
2004）、ABA（Zhu et al.，2010）等途径，并且是各信号途径交叉处的重要成分。例如乙烯和茉莉
酸同时诱导拟南芥 AtERF1 基因的表达，两种激素同时处理下的表达量是各激素单独诱导量的叠加
（Koornneef & Pieterse，2008），表明 AtERF1 是乙烯和茉莉酸两信号途径的调控结点。RAP2.6
是拟南芥 AP2/ERF 超家族成员，凝胶阻滞实验和酵母单杂交实验均证实 RAP2.6 基因可以通过
结合 GCC 和 CE1 顺式作用元件来激活下游基因，该基因过表达植株表现出对 ABA 超过敏的症状，
说明 RAP2.6 为乙烯和 ABA 信号传导途径的结点（Zhu et al.，2010）。小麦 TaERF3 基因在病原抗
性反应中首先响应 SA 信号，随后在乙烯和茉莉酸途径中发挥作用，从而激活植物对病原物的
防卫反应（Zhang et al.，2007）。在本试验中，CitERF9 和 CitAP2-7 对 ACC、ABA、MeJA 和 SA
均有不同程度的响应，该结果与前人的研究结论一致，表明 CitERF9 和 CitAP2-7 基因是多种激素的
调控节点。此外，研究还发现 CitERF9 和 CitAP2-7 基因在幼苗根中对 NaCl、生理脱水和 ABA 胁迫
具有相似的表达模式，这与大豆 GmERF6 和 GmERF7 基因在 ABA、NaCl、干旱条件下具有相似的
表达模式（翟莹 等，2012）一致，可能是因为高盐会使植物细胞产生渗透胁迫效应从而使植物脱水，
而脱水会促使植株体内的 ABA 增加，通过信号转导调节相关抗逆基因表达，进而保护植株的正常
生长发育。
综上所述，本试验中通过生物信息学和基因表达对 CitERF9 和 CitAP2-7 进行了系统分析，表明
这两个基因在柑橘生长发育和抗逆生理中发挥着重要作用。本结果为下一步解析 CitERF9 和
董翠翠，马岩岩，谢让金，邓 烈，易时来，吕 强，郑永强，何绍兰.
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CitAP2-7 的生物功能奠定了基础。

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