全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2237–2243.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0143；http：//www. ahs. ac. cn 2237
收稿日期：2015–08–14；修回日期：2015–11–13
基金项目：国家自然科学基金项目（31170653，31270736，31470700）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yuyixun@scau.edu.cn；Tel：13268200418）
香石竹DcMAPK1和DcMAPK2的克隆及功能初
步分析
马悦悦，肖志娜，汤 娜，刘娟旭，余义勋*
（华南农业大学林学与风景园林学院，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广州 510642）
摘 要：分离了香石竹（Dianthus caryophyllus）两个促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-ac-tivated
protein kinase，MAPK）基因 cDNA 全长，分别命名为 DcMAPK1 和 DcMAPK2，其中 DcMAPK1 与拟南
芥 AtMAPK6 高度同源。DcMAPK1 在香石竹花瓣衰老过程表达增加，乙烯处理显著促进其表达，瞬时抑
制 DcMAPK1 后切花瓶插寿命显著延长。而 DcMAPK2 在花瓣衰老过程中组成型表达，乙烯处理对其表达
无显著影响，瞬时抑制 DcMAPK2 对切花瓶插寿命无显著影响。
关键词：香石竹；切花；衰老；MAPK
中图分类号：S 681.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2237-07

Cloning and Preliminary Function Analysis of DcMAPK1 and DcMAPK2 in
Carnation
MA Yue-yue，XIAO Zhi-na，TANG Na，LIU Juan-xu，and YU Yi-xun*
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangdong Key Laboratory for
Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm，Guangzhou 510642，China）
Abstract：In this study，the cDNAs of two carnation（Dianthus caryophyllus）mitogen-ac-tivated
protein kinase（MAPK）genes，DcMAPK1 and DcMAPK2，were isolated. The transcriptional levels of
DcMAPK1，the homolog of AtMAPK6，increased during flower senescence and after ethylene treatment，
while DcMAPK2 mRNA levels did not significantly change. Transient DcMAPK1 suppression delayed
flower senescence，but DcMAPK2 suppression did not.
Key words：Dianthus caryphyllus；carnation；cut flower；senescence；MAPK

促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-ac-tivated protein kinase，MAPK）是丝氨酸/苏氨酸蛋白质
激酶的一个大家族（Widmann et al.，1999）。近年来研究表明，植物 MAPK 级联途径与不同的生物
及非生物胁迫反应、激素反应、细胞分化和发育过程有关。Stanko等（2014）的研究表明AtMAPK10
与上游的 AtMKK2 互作共同参与调节复杂的叶脉形成。Wang 等（2015a）对黄瓜基因组中的 MAPK
级联进行分析，发现多个 MAPK 级联成员的表达受热、冷、病害以及茉莉酸和脱落酸处理的影
响。香蕉 MaMAPK1、MaMAPK2、MaMAPK3、MaMAPK5 和 MaMAPK6 的表达也受 Fusarium

Ma Yue-yue，Xiao Zhi-na，Tang Na，Liu Juan-xu，Yu Yi-xun.
Cloning and preliminary function analysis of DcMAPK1 and DcMAPK2 in carnation.
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oxysporum 菌侵染的影响（Wang et al.，2015b）。在拟南芥中超表达玉米 ZmMAPK1 增强了转基因
植株的抗热和抗干旱的能力（Wu et al.，2015）。另外 MAPK 家族成员参与叶片衰老的调控。Berberich
等（1999）报道玉米 ZmMAPK5 在叶片衰老过程中表达增加，活性增强。Guo 等（2004）的研究表
明拟南芥衰老的叶片中有 3个AtMAPK表达。拟南芥AtMAPK6可以与EIN3互作，与上游的MAPKK9
一起调节 EIN3 的稳定性，从而调节乙烯信号的下游反应（Ouaked et al.，2003；Yoo et al.，2008）。
Liu 和 Zhang（2004）提出 AtMAPK6 可以调节 ACS 的稳定性，从而参与乙烯生物合成。Zhou 等（2009）
的研究表明在拟南芥 AtMAPK6 级联在叶片衰老调控中起重要作用，AtMAPK6 被敲除后，叶片衰老
推迟。
乙烯是植物的衰老激素，一般来讲植物的花比叶片对乙烯更敏感，然而 MAPK 在花瓣衰老中是
否具有调节作用还不清楚。香石竹（Dianthus caryophyllus）为典型的乙烯敏感性花卉，也是花瓣衰
老研究方面的模式材料。本研究中分离了香石竹两个 MAPK 基因，初步分析了它们在切花衰老中的
表达及功能。
1 材料与方法
1.1 基因分离
‘Master’香石竹切花购于广州市岭南花卉市场缤纷园艺公司。试验于 2013 年 1 月到 2014 年
12 月在华南农业大学进行。
根据天根公司总 RNA 提取试剂盒说明书提取花瓣组织的总 RNA，以提取的总 RNA 为模板，
根据反转录试剂盒 Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time 说明书反转录成 cDNA 第 1 条链，
–20 ℃保存备用。
根据拟南芥 AtMAPK6 等基因的保守序列，设计简并引物 5′-GGNGCWTAYGGHATYGTBTG-3′
和 5′-CAACCNACNGACCAHACATCDAT-3′。利用香石竹花瓣 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，获得
约 570 bp 的条带，连入 pMD19-T 载体测序，得到两条不同序列的片段。根据这两个片段再设计上
游和下游特异引物 5′-CTCTGCCAATGTTCTTCACAGGGAT-3′和 5′-CGCGTCCCTTTTAGGCGGCG
GTATA-3′，以及 5′-GATTGGACCGTATTATTTGATG-3′和 5′-TTCACAGGGATTTGAAGCCTAG-3′，
利用 3′RACE-PCR 和 5′RACE-PCR 技术，分离两个 DcMAPK 基因的 cDNA 全长。
PCR 体系：花瓣 cDNA 为模板（100 ng · µL-1）0.5 µL，上游引物（20 µmol · L-1）0.5 µL，下游
引物（20 µmol · L-1）0.5 µL，10 × PCR Buffer 2.5 µL（含 20 mmol · L-1 Mg2+），dNTPs（10 mmol · L-1）
0.5 µL，Taq 酶（2 U）0.5 µL，加 ddH2O 至 25 µL。
PCR 程序：94 ℃ 3 min，变性 94 1 min℃ ；退火 56 1 min℃ ；72 ℃延伸 1 min。共 35 个循环；
72 ℃延伸 7 min。4 ℃冰箱保存。PCR 产物经凝胶回收试剂盒回收，插入 pMD19-T 载体，转化 DH5α
感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，菌液经过 PCR 检测正确后送上海生工生物技术服务有限公司测
序。
1.2 乙烯处理
瓶插的香石竹切花完全开放后转移到密封箱中，用 2 μL · L-1 的乙烯利处理 0、4、8、12 和 24 h。
分别提取花瓣总 RNA，并反转录，荧光定量 PCR 测定 DcMAPK1 和 DcMAPK2 mRNA 水平。
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1.3 荧光定量 PCR
根据所分离的两个 DcMAPK 序列，用 Primer 5.0 软件设计定量引物。RT-1F：5′-CAGAGGAGC
AAATGAGGGA-3′；RT-1R：5′-TGAAGGTGACGCATACAAA-3′以及 RT-2F：5′-GTATCGCTCGAA
GTCTCGT-3′；RT-2R：5′-AATCATCAATCTGCCCTTT-3′。以香石竹 DcActin1（序列号：AY007315）
为内参基因（引物为 Actin-F：5′-CCCTACCACACGCTATTTTA-3′，Actin-R：5′-ATGTACGCCA
GCTTCTCCTT-3′）。
实时荧光定量 RT-PCR 按照 TaKaRa 公司 SYBR-Green 试剂盒进行。按照说明书配制 20 µL 反应
体系：SYBR® Premix 10.0 µL，上、下游引物（10.0 µmol · L-1）各 0.8 µL，cDNA 1.0 µL，Sterile Water
7.4 µL。在 Biorad 荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 扩增，反应条件为 95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃
30 s，72 ℃ 30 s，40 次循环；在 72 ℃延伸步骤收集荧光信号，每个样品重复 3 次。
结果由 SPSS Statistics 17.0 软件进行数据分析，显著性差异分析使用 LSD 法。
1.4 瞬时侵染
根据所分离的两个 DcMAPK 3′UTR 序列，用 Primer 5.0 软件设计定量引物。AS-1F：5′-CGGAA
TTCTGAAAACGTTGTTGCCATTAGAG-3′；AS-1R：5′-GCGGATCCTGTAGGGGTGCCAATCAGCT
CC-3′以及 AS-2F： 5′-GCGGATCCCATTTGGTTGGAGTCTGTG-3′；AS-2R： 5′-CGGAATTCTTC
GAAATCTACATCAACAGT-3′。所分离的片段反向连接到 pBI121 植物表达载体上。导入农杆菌
GV3101 菌株。
侵染参考 Tan 等（2014）和 Spitzer 等（2010）的方法。将已经震荡 8 h 左右的携带不同植物表
达载体的根癌农杆菌 GV3101 菌液离心后，将其用缓冲液（0.05 mol · L-1 MES，0.5%蔗糖，1 mmol · L-1
Na3PO4，5 mL · L-1 乙酰丁香酮）稀释到 OD 值为 2.0，倒入烧杯中，将开放前 1 d 的香石竹切花倒立
浸没在菌液中，于干燥器中真空浸染。真空泵型号为德国凯恩孚。–60 000 Pa 保持 15 min 后，取
出花材，置于 24 ~ 26 ℃条件下瓶插，完全开放（外层花瓣与茎轴垂直）后开始统计瓶插寿命（余
义勋和包满珠，2004）。
每个处理 10 ~ 15 朵切花，3 个重复。
1.5 生物信息学分析
氨基酸多序列比对使用 DNAMAN 软件。聚类分析使用 MEGA（version 3.1）软件。NCBI 比对
网站为 http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi。
2 结果与分析
2.1 DcMAPK1 和 DcMAPK2 全长 cDNA 分离
利用同源克隆以及 RACE-PCR 技术，分离了 DcMAPK1（序列号：KT364527）和 DcMAPK2（序
列号：KT364528）的 cDNA 全长，分别编码 394 个和 371 氨基酸，预测的分子量分别为 45.1 和 42.7 kD。
DcMAPK1 与 DcMAPK2 的氨基酸同源性为 66.2%，DcMAPK1 与拟南芥中同源性最高的两个蛋
白分别为 AtMAPK6 和 AtMAPK3，同源性分别为 87.2%和 74.3%。DcMAPK2 与拟南芥中同源性最
高的两个蛋白分别为 AtMAPK11 和 AtMAPK4，同源性分别为 80.5%和 79.5%。以上 6 个 MAPK 的
氨基酸序列比对见图 1。香石竹两个 DcMAPK 与拟南芥 20 个 AtMAPK 的树状聚类见图 2。
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图 1 香石竹 DcMAPK1 和 DcMAPK2 与拟南芥 AtMAPK 的氨基酸序列比对
Fig. 1 Comparison of the deduced DcMAPK1，DcMAPK2，AtMAPK3，AtMAPK4，AtMAPK6，and
AtMAPK11 amino acid sequences


图 2 香石竹 DcMAPK1 和 DcMAPK2 与拟南芥 MAPK 的聚类分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of two carnation MAPKs（Asterisk）aligned with the Arabidopsis MAPK family
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2.2 DcMAPK1 和 DcMAPK2 在花瓣衰老中的表达分析
‘Master’香石竹的瓶插寿命约为 5 d，乙烯跃变也在第 5 天（余义勋和包满珠，2004），分别
采取瓶插 0、2、3、4、5 和 6 d 的花瓣，提取总 RNA 并反转录后，荧光定量 PCR 测定 DcMAPK1
和 DcMAPK2 mRNA 水平。结果表明：DcMAPK1 mRNA 在前 5 d 呈逐渐升高，随后下降；而 DcMAPK2
的 mRNA 水平在花瓣衰老过程中呈组成型表达（图 3）。


图 3 DcMAPK1 和 DcMAPK2 在香石竹切花自然衰老过程中的表达变化
Fig. 3 Expression of DcMAPK1 and DcMAPK2 determined by quantitative real-time PCR during natural flower senescence

10 µmol · L-1 乙烯处理花瓣 0、4、8、12 和 24 h 后，分别提取总 RNA 并反转录，荧光定量 PCR
测定 DcMAPK1 和 DcMAPK2 mRNA 水平。乙烯处理显著促进了 DcMAPK1 的表达，在处理 8 h 后
达到峰值，而乙烯处理对 DcMAPK2 表达几乎没有影响（图 4）。


图 4 乙烯处理对香石竹 DcMAPK1 和 DcMAPK2 表达的影响
Fig. 4 Expression of DcMAPK1 and DcMAPK2 determined by quantitative real-time PCR by exogenous ethylene treatment

2.3 DcMAPK1 和 DcMAPK2 沉默对切花瓶插寿命的影响
为了分析 DcMAPK1 和 DcMAPK2 在切花衰老中的功能，利用 DcMAPK1 和 DcMAPK2 的 3′UTR
区域，构建其反义表达载体 pBI121-DcMAPK1 和 pBI121-DcMAPK2，并导入农杆菌 GV3101 菌株，
对盛开前一天的切花侵染，瓶插。提取侵染后 3 d 的花瓣 RNA，反转录为 cDNA 后进行荧光定量
PCR。结果表明 DcMAPK1 和 DcMAPK2 的 mRNA 水平都分别降低了 80%以上，并且携带反义载体
pBI121-DcMAPK1 的 农 杆 菌 侵 染 切 花 后 没 有 改 变 DcMAPK2 的 表 达 ， 携 带 反 义 载 体
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pBI121-DcMAPK2 的农杆菌处理没有改变 DcMAPK1 的表达（图 5）。如图 6 所示：DcMAPK1 抑制
显著延缓了衰老，瓶插寿命为（6.5 ± 0.6）d，比对照[（4.7 ± 0.4）d]延缓了 1.8 d；而 DcMAPK2 抑
制对衰老没有显著影响，瓶插寿命仅为（4.8 ± 0.4）d（图 6）。










图 5 反义载体 pBI121-DcMAPK1 和 pBI121-DcMAPK2 处理对 DcMAPK1 和 DcMAPK2 表达的影响
Fig. 5 Effects of antisense vectors pBI121-DcMAPK1 and pBI121-DcMAPK2 treatment on the expression of DcMAPK1 and DcMAPK2 in
carnation flowers by quantitative real-time PCR，respectively




图 6 DcMAPK1 和 DcMAPK2 抑制与对照的瓶插寿命比较
Fig. 6 Comparsion of flower vase-life of DcMAPK1 and DcMAPK2 suppression and control
马悦悦，肖志娜，汤 娜，刘娟旭，余义勋.
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3 讨论
本研究的结果表明：香石竹 DcMAPK1 与拟南芥 AtMAPK6 高度同源，DcMAPK1 表达随着花的
衰老而逐渐升高，乙烯处理也正向调节 DcMAPK1 转录水平。该结果暗示 DcMAPK1 与香石竹切花
衰老密切相关。反义 RNA 技术瞬时沉默 DcMAPK1 表达后，切花瓶插寿命显著延长，说明 DcMAPK1
对切花衰老起重要调节作用。同时也说明，AtMAPK6 同源基因参与植物不同器官的衰老调控这一功
能在植物中可能比较保守。以前的研究认为 AtMAPK6 参与了乙烯信号转导和乙烯生物合成（Ouaked
et al.，2003；Liu & Zhang，2004；Yoo et al.，2008），这些研究结果都表明，AtMAPK6 对乙烯信号
起正调控作用，本研究的结果与该观点一致。乙烯处理显著促进 DcMAPK1 表达，并且参与了花衰
老的调节，然而 DcMAPK1 是否参与乙烯反应，仍有待于进一步研究。
DcMAPK2 与拟南芥 AtMAPK11 最同源。目前尚未见到 AtMAPK11 基因功能的报道。DcMAPK2
抑制并未显著改变切花瓶插寿命，同时其在切花衰老过程中为组成型表达，且不受乙烯处理的影响，
说明 DcMAPK2 在切花衰老过程中可能不具有重要作用。

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