全 文 ：园艺学报，2015，42 (9)：1789–1797.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0246；http：//www. ahs. ac. cn 1789
收稿日期：2015–05–20；修回日期：2015–08–31
基金项目：福建农林大学园艺学院青年学术骨干培养基金项目（FAFU2012YYPY05）；福建省自然科学基金项目（2010J05048）
* E-mail：papayacrazy@yahoo.com.cn
番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因 CpCP 的分离及表
达分析
申艳红*，陈晓静，蔡雪玲，叶一江，耿姣姣，杨菲颖
（福建农林大学园艺学院，园艺植物遗传育种研究所，福州 350002）
摘 要：采用 cDNA-AFLP 技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段，经生物信息学分
析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease，CP）基因。将差异片段序列在 NCBI 中的番木瓜
基因组序列中搜索，获得了半胱氨酸蛋白酶基因 DNA 序列。设计开放型阅读框上、下游引物，以木瓜果
肉 RNA 逆转录的 cDNA 为模板扩增该基因全长 cDNA 序列，命名为 CpCP（登录号：JN689334）。该基因
属于C1肽酶家族中的C1A亚家族，编码471个氨基酸，含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。
Real-time PCR 结果显示 CpCP 在果实中大量表达，是根、茎、叶、花中表达量的几十倍；CpCP 受乙烯
处理诱导，受 1-MCP 处理抑制，表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致，说明 CpCP 参与了番木瓜果
实成熟衰老进程。
关键词：番木瓜；半胱氨酸蛋白酶；基因克隆；cDNA-AFLP；荧光定量 PCR
中图分类号：S 668.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）09-1789-09

Cloning and Expression Analysis of Cysteine Protease Gene CpCP from
Papaya
SHEN Yan-hong*，CHEN Xiao-jing，CAI Xue-ling，YE Yi-jiang，GENG Jiao-jiao，and YANG Fei-ying
（College of Horticulture，Institute of Genetics & Breeding in Horticultural Plants，Fujian Agriculture and Forestry
University，Fuzhou 350002，China）
Abstract：A polymorphic fragment associated with fruit ripening in papaya was obtained by
cDNA-AFLP analysis and identified as a CP（Cysteine Protease）gene according to bioinformatic analysis.
The sequence of open reading frame of CP was obtained from reference papaya genomic sequence in
NCBI using the polymorphic fragment as a query. The full-length cDNA of CP was isolated from fruit
（primers were designed according to open reading frame of CP），and the cloned gene was designated as
CpCP（GenBank No.：JN689334）. Using bioinformatic analysis，this gene was identified as a member of
the C1A gene subfamily of C1 Peptidase family，which encodes 471 amino acids and has active sites of
Cys166-His302-Asn322. Real-time PCR analysis revealed that the expression level in fruits was the
greatest，which has dozens of times than that in root，stem，leaf，and flower. In addition，the expression
level was highly induced by ethylene and inhibited by 1-MCP. The expression pattern is consistent with

Shen Yan-hong，Chen Xiao-jing，Cai Xue-ling，Ye Yi-jiang，Geng Jiao-jiao，Yang Fei-ying.
Cloning and expression analysis of cysteine protease gene CpCP from papaya.
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the fruit senescence process，indicating that CpCP is involved in the fruit senescence in papaya.
Key words：Carica papaya；cysteine protease；gene clone；cDNA-AFLP；real-time PCR

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease，CP）作为一类重要的蛋白酶家族，存在于动物、植物以及
一些病毒和细菌中，广泛参与各种生理过程（Maciel et al.，2011），例如胚胎发育（Aberlenc-Bertossi
et al.，2008）、管状细胞分化（Ye & Varner，1996；Zhao et al.，2000）、木质部分化、通气组织形成
（闫龙凤 等，2005）、种子萌发（Mikkonen et al.，1996；Davy et al.，1998）、叶和花的衰老（Guerrero
et al.，1998）以及胁迫应激反应（Lopez et al.，2007）和细胞程序化死亡等（CouPe et al.，2004；
李思滨 等，2008）。木瓜蛋白酶家族是植物半胱氨酸蛋白酶中研究最为详尽的（Nallamsetty et al.，
2003），与动物半胱氨酸蛋白酶同源，有着类似的功能，参与了细胞程序性死亡的蛋白降解，而且也
可以诱导细胞凋亡过程（Shen et al.，2004）。
番木瓜（Carica papaya L.）果实采后迅速成熟，变黄软化，在运输和储藏中的损失可达 20%之
多（谢庆昌，2001），研究番木瓜果实成熟衰老机理有重要理论和实践意义。采用 cDNA-AFLP 技术
在番木瓜果肉中分离了能被乙烯诱导表达，与番木瓜果实成熟衰老密切相关的木瓜半胱氨酸蛋白酶
基因，并进行了序列特征分析和差异表达分析，为进一步深入研究木瓜 CP 基因功能，了解其在果
实成熟中的作用以及最终利用基因工程改良木瓜品质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
2010 年 11 月，在福建闽侯木瓜园选择表面完好、无机械损伤、大小均匀一致的绿熟期‘大白 8
号’番木瓜果实为试验材料。将果实用清水洗净晾干，在 25 ℃采用 3 种方式进行处理：（1）乙烯
利处理，将果实浸泡在含 0.5 g · L-1乙烯利水溶液中 3 min，自然晾干，装箱密封 2 h；（2）1–甲基
环丙烯（1-MCP）处理，将果实置于密闭黑暗的 1 μL · L-1 1-MCP 气体中 18 h；（3）对照，将果实浸
泡在清水中 3 min，自然晾干，装箱密封 2 h。将不同处理后的果实分别放在 25 ℃房间储藏，于处
理后 6 h、12 h、24 h、3 d、6 d、9 d 取样。将果实去除果皮和种子，把果肉切成小块立即投入液氮
中速冻，–80 ℃保存备用。采集番木瓜幼嫩的根、茎、完全伸展的叶片、盛花期的全花，投入液氮
速冻后–80 ℃保存备用。每个处理设置 3 个生物学重复，进行 RNA 提取和荧光定量分析。
1.2 菌株与试剂
大肠杆菌菌株 DH5α 为本实验室保存，ExTaq、dNTPs、pMD18-T 载体购自 TaKaRa 公司，琼脂
糖胶回收试剂盒、植物基因组 DNA 提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，Super SMARTTM PCR
cDNA Synthesis Kit 购自 BD Biosciences Clontech 公司，SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit、荧光染料购
自 TaKaRa 公司，1-MCP 安喜布购自台湾利统股份有限公司，其他试剂为国产分析纯。
1.3 cDNA-AFLP 差异片段的获得
用改良热硼酸小量法（申艳红和陈晓静，2009）分别提取处理后 3 d 的番木瓜果肉 RNA，用 Super
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 逆转录为 cDNA，参照 Bachem 等（1998）的方法取 200 ng 分别
进行 AseⅠ和 TaqαⅠ双酶切，与接头连接，预扩增，选择性扩增和电泳，进行 cDNA-AFLP 分析。割
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取差异条带，在 50 μL TE 高盐溶液中 94 ℃水浴 30 min，取 2 μL 上清液作为模板进行 PCR 扩增、
电泳检测、回收、测序。用 DNAMAN 软件将测序结果去掉载体和引物序列，获得差异片段序列。
1.4 番木瓜 CpCP 基因引物设计及 PCR 扩增
在 NCBI 上将 cDNA-AFLP 差异片段序列与番木瓜基因组序列进行比对，获得一段番木瓜基因
组 DNA 序列。用 softberry 网站在线预测基因软件 FGENESH 对这段 DNA 序列进行基因预测，找到
1 个 CP 基因的编码区。参照该序列设计编码区引物。CP-U：CGATTCATCAACCGCATTAGCCAT；
CP-D：GTTAAGCACTG CTGACAAGCTCG。20 μL PCR反应体系包含 1× PCR 缓冲液，0.2 mmol · L-1
dNTPs，2 U Ex Taq，0.25 μmol · L-1 引物和 10 ng 模板。PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 3 min；35 个
扩增循环的 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min；72 ℃继续延伸 7 min。PCR 产物经
1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带割胶回收，连接 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌感受态细胞，
挑取阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。
1.5 生物信息学分析
用 DNAMAN 软件进行基因片段的拼接和蛋白质翻译；用 NCBI 网站的 Blastn 和 Blastx 进行基
因及蛋白质同源性搜素；用 FGENESH（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）进行基因预测；利
用 Protparam 预测编码蛋白的分子式、相对分子质量、氨基酸组成和等电点（http：//web.expasy.org/
protparam/）；用 SignalP 3.0 Server 进行信号肽预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；用
NCBI 网站的 CDD 进行氨基酸序列结构域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/
cdd_search.html）；用 MEGA 4.0 构建分子进化树。
1.6 番木瓜 CpCP 基因在不同器官以及不同处理果实中的表达分析
分别取各样品的 RNA1 μg，用 SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit 进行逆转录。在 CP 基因 3′端非保
守区设计一对引物。上游：5′-TTGGTGGATG AGAGTGCCGT-3′；下游：5′-CGTAACAGTATCAC
ATTACAATCTCTGG-3′。以番木瓜 Actin 基因为内参进行荧光定量 PCR 扩增。反应总体积为 20 μL，
包含 SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，双蒸水 8.0 μL。扩增
程序为 95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 15 s，55 ℃退火 30 s，39 个循环。每个样品重复 3 次，以根
为对照，分析 CpCP 基因在不同组织器官中的相对表达；以清水处理后 6 h 的果肉为对照，分析该
基因在不同处理果实中的相对表达。采用 2-ΔΔCT 法分析 qRT-PCR 数据，用 SPSS 进行邓肯氏多重比
较，Excel 软件作图。
2 结果与分析
2.1 差异片段的获得
利用 AseⅠ和 TaqαⅠ酶切组合的 128 对引物分别对 1-MCP、乙烯利和清水处理后 3 d 的番木瓜
果实进行 cDNA-AFLP 分析，图 1 为部分选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。3 个处理的条带
大部分一致，说明表达的基因大部分相同，也有一些基因在表达量上有明显差异。用刀片将图 1 箭
头所指方框内的差异条带割下，经 2 次扩增得到 1 条长约 500 bp 的片段（图 2），经测序获得长 490
bp 的序列。在 NCBI 网站上同源性分析，确定其为半胱氨酸蛋白酶基因片段。

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图 1 cDNA-AFLP 聚丙烯酰胺图谱
1：对照；2：1-MCP 处理；
3：乙烯利处理；箭头所指为割取的差异条带。
Fig. 1 Polyacrylamide gelelectro-phoretogram of cDNA-AFLP
1：Control；2：1-MCP treatment；3：Ethephon treatment；
The arrow refers to differential band were cut.
图 2 差异片段的扩增
M：DL2000 marker；1、2：差异片段。
Fig. 2 Cloning of differential fragment from papaya
M：DL2000 marker；
1，2：Differential fragment.
图 4 CpCP 基因的克隆
Fig. 4 Cloning of CpCP gene from papaya
M：DL2000 marker；1，2：ORF.



2.2 CpCP 基因的 PCR 扩增
在 NCBI 上用差异片段序列搜索番木瓜 Whole-genome shotgun contigs，发现该序列位于番木瓜
LG3 contig 22753（登录号：ABIM01022719.1）上。以葡萄基因组 DNA 为参照，用 FGENESH 软
件对该序列进行基因预测，在 2 546 ~ 5 645 bp 之间有 1 个包含 5 个外显子的基因（图 3）。


图 3 以 FGENESH 软件参照葡萄基因组 DNA 预测番木瓜 LG3 contig 22753
1：末端 polyA 区；2 ~ 6：外显子；7：转录起始位点。
Fig. 3 FGENESH prediction of LG3 contig 22753 sequence by reference to Vitis vinifera genomic DNA
1：Terminal polyA；2–6：Exons；7：Transcription start site.


参照该预测基因序列设计编码区特异引物，
以番木瓜果肉 cDNA 为模板，扩增获得长约
1 400 bp的片段（图 4），经回收、测序长 1 439 bp，
与已知差异片段重叠，有 1 个碱基差异。
将此序列及其编码的氨基酸序列与其它物
种 CP 比较，发现有较高同源性，该序列与甜橙
（XP_006487026）、番茄（XP_004230752）、拟
南芥（AAK62661）、橡胶树（ABG33750）和烟
草（AGV15820）的氨基酸序列同源性分别为
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68.67%、67.16%、65.75%、65.39%、63.27%（图 5）。
因此确认获得了番木瓜 CP 基因全长 cDNA 序列，将其命名为 CpCP，GenBank 登录号为
JN689334。



图 5 6 种高等植物 CP 基因氨基酸序列同源性比对分析
AEZ65082：番木瓜；XP_006487026：甜橙；XP_004230752：番茄；AAK62661：拟南芥；ABG33750：橡胶树；AGV15820：烟草。
倒三角标注的氨基酸为催化活性位点。
Fig. 5 Alignment of deduced amino acid sequences of six CP genes from higher plants
AEZ65082：Carica papaya；XP_006487026：Citrus sinensis；XP_004230752：Solanum lycopersicum；
AAK62661：Arabidopsis thaliana；ABG33750：Hevea brasiliensis；AGV15820：Nicotiana tabacum.
The catalytic sites were marked by triangle.

2.3 CpCP 基因的序列特征分析
将 CpCP 基因核苷酸序列翻译成半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列，编码 471 个氨基酸，分子式为
C2284H3500N628O720S35，分子量约为 52.40 kD，等电点为 5.15。不稳定指数为 41.19，属于不稳定蛋白。
用 SignalP 3.0 Server 进行信号肽预测，发现具有一个含有 24 个氨基酸组成的信号肽序列，在第 24
和 25 个氨基酸之间有一个剪切位点。
用 CDD 分析木瓜半胱氨酸蛋白酶的功能域，发现该基因属于 C1 肽酶家族中的 C1A（木瓜蛋
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图 7 番木瓜 CpCP 基因在不同组织的表达量分析
“A、B”表示 P ≤ 0.01 差异显著。
Fig. 7 Expression analysis of CpCP gene in
different tissues of papaya
“A，B”means significant difference at P ≤ 0.01 level.
白酶）亚家族。在 N 末端的 52-108 位是肽酶抑制剂（Proteinase inhibitor I29）结构域，这个结构域
抑制酶活性，通过蛋白水解去除这一区域，而激活该酶。CpCP 氨基酸序列的 143-356 位为 1 个木
瓜蛋白酶家族 C 端特有的肽酶 C1A 保守区，含有由保守氨基酸残基组成的催化三联体：
Cys166-His302-Asn322，三联体前面的 Gln 残基对催化作用的发挥也很重要（图 5）。
用 MEGA 4.0 软件的 NJ 法构建了 CP 系统进化树，发现番木瓜 CP 与甜橙、毛果杨、苜蓿等 CP
蛋白亲缘关系较近，而与烟草、拟南芥等 CP 蛋白亲缘关系较远（图 6）。


图 6 CP 分子进化分析
Fig. 6 Phylogenic analysis of CP


2.4 CpCP 的表达分析
CpCP 基因在果实中大量表达，是根、茎、
叶、花中的几十倍（图 7）。
乙烯可以诱导果实 CpCP 的表达（12 h ~ 3
d），1-MCP 处理则抑制其表达（24 h ~ 6 d）（图
8）。
番木瓜是呼吸跃变型果实，外源乙烯催化
果实成熟衰老，1-MCP 则与乙烯受体结合抑制
果实成熟。试验中观察到乙烯利处理的番木瓜
果实在 24 h 开始软化，1-MCP 处理则在 9 d 时
才开始软化（数据未列出），CpCP 基因也是在
此时表达量最高。
说明该基因的表达模式与番木瓜果实成
熟衰老进程一致，可能在成熟衰老中起作用。
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图 8 CpCP 基因在乙烯、1-MCP 处理番木瓜果实中的表达量分析
“a、b、c”表示差异显著 P ≤ 0.05。
Fig. 8 Expression analysis of CpCP gene in ethylene-treated or 1-MCP-treated papaya fruit
“a，b，c”means significant difference at P ≤ 0.05 level.
3 讨论
研究获得的 CpCP 基因属于木瓜蛋白酶基因家族，有着该家族的特有功能结构域——N 末端的
肽酶抑制剂结构域和催化三联体：Cys166-His302-Asn322（Beers et al.，2000；Wiederanders，2003）。
木瓜半胱氨酸酶负责降解那些胁迫诱导或自然衰老条件下生成的损伤、折叠错误或变性蛋白
（Grudkowska & Zagdańska，2004），参与植物的衰老过程。拟南芥 SAG12 是研究较透彻的衰老相
关半胱氨酸蛋白酶基因，它的表达谱与叶片衰老进程完全一致，SAG12 被认为是衰老标志性蛋白
（Lohman et al.，1994）。拟南芥 SAG12 的同源基因，例如红薯 SPG31（Chen et al.，2002）、番茄
SENU2 和 SENU3（Drake et al.，1996）、油菜 BnSAG12-1 和 BnSAG12-2（Desclos et al.，2009)，以
及烟草 NtCP1 和 NtSAG12（Carrión et al.，2013）也都参与了该物种的叶片衰老。在豌豆（Kardailsky
& Brewin，1996）、大豆（Alesandrini et al.，2003）、苜蓿（Sheokand et al.，2005）中，半胱氨酸蛋
白酶参与了根瘤的衰老，并且对苜蓿 MsCyp15a 基因的抑制可以延缓根瘤衰老。在草莓果实成熟和
叶片衰老过程中，FaCP 表达量都明显增加，说明 FaCP 可能参与调控草莓果实成熟及叶片衰老（朱
海生 等，2013）。CpCP 是作者在 cDNA-AFLP 分析中筛选出来的能被 1-MCP 抑制，被乙烯利诱导
表达的基因，而该基因的表达模式刚好与果实成熟衰老进程一致，推测 CpCP 参与了番木瓜果实的
成熟衰老。
CpCP 基因在番木瓜不同组织中的表达分析表明，半胱氨酸蛋白酶在果实中富集表达，是根、
茎、叶和花中表达量的几十倍。并且，CpCP 基因受乙烯处理诱导，受 1-MCP 处理抑制，说明该基
因启动子属于果实高表达的诱导型启动子。目前，可利用的植物诱导型和组织特异性启动子还较少。
因此，在番木瓜基因组框架图（Ming et al.，2008）的基础上，克隆 CpCP 启动子序列并进行功能鉴
定，为果实植物分子育种提供新型高效启动子是本课题组以后的研究方向之一。

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