全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：557–563.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0659；http：//www. ahs. ac. cn 557
收稿日期：2015–11–09；修回日期：2016–03–04
基金项目：吉林省科技发展计划项目（20100249）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：aijun1005@163.com）
蓝靛果忍冬转录组 SSR 信息分析及其分子标记
开发
张庆田，李晓艳，杨义明，范书田，艾 军*
（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）
摘 要：利用 MISA 软件筛选蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）转录组测序获得的 45 656 条 Unigene，
共检测出 14 841 个 SSR 位点，分布于 11 251 条 Unigene 中，出现频率为 32.51%，平均分布距离为 2.58 kb。
优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，分别占总 SSR 位点的 34.81%，42.79%和 20.64%。二
核苷酸重复基元中以 AG/CT 为优势重复基元，占总位点 27.2%，三核苷酸重复基元以 AAG/CTT 为主，
占 6.18%。利用 Primer 3.0 共设计出 21 867 对 SSR 引物。随机选择 20 对引物进行 PCR 扩增，其中 8
对扩增出清晰可重复的条带，5 对在 16 个蓝靛果忍冬材料中表现出多态性。利用 UPGMA 作图，将 16
份供试材料分为 3 类。丰富的 SSR 多态性为蓝靛果忍冬遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可
靠的标记选择。
关键词：蓝靛果忍冬；SSR；转录组；多态性
中图分类号：S 663 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0557-07

Analysis on SSR Information in Transcriptome and Development of
Molecular Markers in Lonicera caerulea
ZHANG Qing-tian，LI Xiao-yan，YANG Yi-ming，FAN Shu-tian，and AI Jun*
（Institute of Special Wild Economic Animals and Plants，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130112，
China）
Abstract：Forty-five thousand six hundred and fifty-six unigenes from fruit transcriptome of Lonicera
caerulea L. were screened using MISA software. A total of 14 841 SSRs that occurred in 11 251 unigenes
were identified，and the frequency of these SSRs was 32.51% and mean distance was 2.58 kb in the
unigenes. Mononucleotide，dinucleotide and trinucleotide were major types，accounting for 34.81%，
42.79% and 20.64%，respectively. The dinucleotide repeat motifs of AG/CT were the predominant repeat
types（27.2%）. The trinucleotide repeat motifs of AAG/CTT were the predominant repeat types（6.18%）.
Twenty-one thousand eight hundred and sixty-seven pairs of SSR primers were designed using Primer 3.0.
Randomly 20 pairs of primers were selected for PCR amplification，8 amplified on clear and reproducible
bands，5 in 16 different types showed polymorphism in materials. Sixteen plants were divided into 3
groups by UPGMA. Abundant SSR polymorphisms provide more reliable markers for Lonicera caerulea L.

Zhang Qing-tian，Li Xiao-yan，Yang Yi-ming，Fan Shu-tian，Ai Jun.
Analysis on SSR information in transcriptome and development of molecular markers in Lonicera caerulea.
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fruit genetic diversity analysis and genetic map construction.
Key words：Lonicera caerulea；SSR；transcriptome；polymorphism

蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）别称蓝靛果、山茄子、黑瞎子果等（张启昌 等，2014）。在
植物分类学上属于忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera Linn.）忍冬亚属（Subgen. Lonicera）
囊管组（Sect Isika DC.）蓝果亚组（Subsect caerulea Rehd.），为落叶灌木（徐炳声和王汉津，1988），
主要分布在俄罗斯、中国、日本和朝鲜，其果实富含花青素、氨基酸、儿茶酸、槲皮苷等生理活性
物质，营养成分与越橘极为相似，具有很高的经济价值和营养保健价值（霍俊伟和睢薇，2009），成
为继越橘、黑穗醋栗、醋栗、树莓、沙棘等之后的又一新兴小浆果树种，在俄罗斯、日本及美国等
国家栽培比较普遍（霍俊伟 等，2005）。蓝靛果忍冬是一个多变异的种，关于其分类一直存在着争
议。运用 RAPD 技术研究发现，蓝果亚组内存在着比较丰富的遗传多样性（霍俊伟和睢薇，2009），
利用 SRAP 技术研究表明中国东北地区蓝靛果忍冬具有较高的遗传变异，是蓝靛果忍冬遗传多样性
中心之一（孙丰，2011）。SSR 标记因其位点特异、复等位、呈共显性，在基因组序列中分布广泛等
优点已经成为最为广泛的分子标记手段（Kumar et al.，2015）。
本研究中利用转录组测序获得的数据进行 SSR 标记的搜索，分析其分布、组成特征，并进行初
步的可用性评价，以期为蓝靛果忍冬的鉴定、亲缘关系研究、核心种质的建立及种质资源利用提供
参考依据。
1 材料与方法
1.1 转录组数据来源
蓝靛果忍冬转录组数据来源于本课题组 2014 年对果实进行 Illumina 高通量深度测序的结果。测
序时采取 4 个发育时期（花后 5、10、15 和 20 d）的蓝靛果忍冬果实，液氮速冻，–80 ℃保存。RNA
提取采用改良 CTAB 法（宗晓娟 等，2012），检测合格后委托诺禾致源生物信息科技有限公司经
Illumina HiSeqTM 2500 PE125 系统进行 RNA-Seq 转录组测序（无参），经过滤获得 6.26 G 的有效数
据，并通过 De Novo 方法（Grabherr et al.，2011）组装得到 45 656 条 Unigene，作为分析背景数据。
1.2 植物材料及其 DNA 提取
用于对所设计的引物进行筛选和可用性评价的材料为中国农业科学院特产研究所蓝靛果忍冬
资源圃的 16 份野生优选种质资源，其中来自长白山 7 份（L1 ~ L7）、黑龙江勃利县 7 份（L8 ~ L14）
和吉林汪清县 2 份（L15、L16）。
基因组 DNA 提取采用天根生化科技有限公司植物基因组 DNA 提取试剂盒（DP305）进行。
1.3 转录组 SSR 位点鉴别及 SSR 引物设计
使用 MISA 程序（http：//pgrc. ikp-gatersleben. de/misa）进行 SSR 位点搜索，搜索标准为：二核
苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为 6、4、3、3 和 3 次。用 Primer
3.0 软件对 SSR 重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条 SSR 产生 5 条引物。引物序列长度
12 ~ 25 bp，预计扩增产物长度 80 ~ 300 bp，GC 含量 40% ~ 70%，退火温度 55 ~ 65 ℃，上、下游引
物的退火温度值相差不大于 5 ℃。尽量避免出现发卡结构、二聚体、错配和引物二聚体等。
张庆田，李晓艳，杨义明，范书田，艾 军.
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1.4 EST-SSR 引物筛选
扩增程序为 94 ℃预变性 3 min；然后进行 35 个循环，每个循环包括 94 ℃变性 40 s，55 ℃退
火 40 s（退火温度因不同引物而异），72 ℃延伸 1 min；最后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物利用 8%
变性聚丙烯酰胺凝胶于 70 W 恒定功率电压下电泳 90 min，银染显色。
1.5 数据统计
用 SSR 出现频率和 SSR 平均分布距离来描述 EST-SSR。SSR 出现频率，fc（%）= c/n × 100，c
为搜索到的 SSR 数量，n 为无冗余 EST 数量；SSR 平均分布距离，fN = N/c，N 为无冗余 EST 数量
的总碱基数。人工读带，将电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱带
计为“0”，建立原始数据矩阵。利用软件 NTsys 2.10e 对 16 份蓝靛果忍冬进行 UPGMA 聚类分析。
2 结果与分析
2.1 转录组中 SSR 的分布及结构特点
通过对蓝靛果忍冬转录组的 45 656 条 Unigene（序列总长约 38 210 925 bp）序列进行搜索，发
现其中 11 251 条 Unigene 序列中含有 14 841 个 SSR 位点，其中 2 764 条 Unigene 含有两个或两个以
上 EST-SSR 位点。总体上，SSR 发生频率为 32.51%，平均每 2.58 kb 出现 1 个 SSR。SSR 的类型丰
富，单核苷酸至六核苷酸重复类型均存在。其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复出现频率占优
势，分别占总 SSR 的 34.81%、42.79%和 20.64%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较
少，分别占总数的 1.50%、0.13%和 0.13%（表 1）。蓝靛果忍冬转录组 SSR 重复单元的重复次数分
布在 5 ~ 25 次之间，其中 5 ~ 10 次重复的 SSR 位点有 11 609 个，占总个数的 78.22%；11 ~ 20 次重
复的有 3 013 个，占 20.30%；20 次重复以上的有 219 个，只占 1.48%（表 1）。
蓝靛果忍冬转录组 SSR 的长度主要集中在 10 ~ 264 bp 范围，其中长度在 12 ~ 20 bp 的 SSR
有 8 222 条，占 SSR 总数的 55.40%；而长度在 20 bp 以上的 SSR 达到 2 894 条，占 SSR 总数的 19.50%。

表 1 蓝靛果忍冬 EST-SSR 的类型、数量及分布频率
Table 1 Type，number and frequency of EST-SSRs in Lonicera caerulea
重复次数 Repeat number 重复基元长度
Repeat motif length 5 6 7 8 9 10 11 ~ 20 > 20
总计
Total
比例/%
Ratio
单核苷酸 Mono 0 0 0 0 0 2 091 2 858 217 5 166 34.81
二核苷酸 Di 0 1 905 1 249 1 175 1 141 729 152 0 6 351 42.79
三核苷酸 Tri 1 707 850 473 30 0 0 1 2 3 063 20.64
四核苷酸 Tetra 193 29 0 0 0 0 0 0 222 1.50
五核苷酸 Penta 16 3 0 1 0 0 0 0 20 0.13
六核苷酸 Hexa 4 7 1 2 2 1 2 0 19 0.13
总计 Total 1 920 2 794 1 723 1 208 1 143 2 821 3 013 219 14 841 100.00
比例/% Ratio 12.94 18.83 11.61 8.14 7.70 19.01 20.30 1.48 100.00

2.2 转录组 SSR 基序重复类型和频率特征
在 14 841 个蓝靛果忍冬转录组 SSR 位点中。共观察到 197 种重复基元，单核苷酸至六核苷酸
重复分别有 4、11、60、83、20 和 19 种。从出现的频率来看，占优势的前 3 种重复基元类型是二核
苷酸、单核苷酸和三核苷酸重复基元；在二核苷酸重复基元中，以 AG/CT、AC/GT 和 AT/AT 为主，
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占二核苷酸总数的 99.98%，单核苷酸重复基元中以 A/T 为主，占 97.54%，三核苷酸重复基元中以
AAG/CTT、ATC/ATG、ACC/GGT 占优势，分别占三核苷酸总数的 29.94%、14.20%和 13.29%，四
核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元类型分布相对分散，出现频率均较低（表 2）。

表 2 蓝靛果忍冬转录中不同微卫星重复基元（motif）出现的频率
Table 2 Occurrence frequency of different microsatellites motifs of Lonicera caerulea
重复基元类型
Repeat type
重复基元
Repeat motif
数量
Number
频率/%
Frequency
比例/%
Proportion
A/T 5 039 11.04 33.95 单核苷酸 Mono
C/G 127 0.28 0.86
AC/GT 324 0.71 2.18
AG/CT 4 038 8.84 27.21
AT/AT 1 988 4.35 13.40
二核苷酸 Di
CG/CG 1 0.002 0.007
AAC/GTT 167 0.37 1.13
AAG/CTT 917 2.01 6.18
AAT/ATT 357 0.78 2.41
ACC/GGT 407 0.89 2.74
ACG/CGT 27 0.06 0.18
ACT/AGT 163 0.36 1.10
AGC/CTG 198 0.43 1.33
AGG/CCT 359 0.79 2.42
ATC/ATG 435 0.95 2.93
三核苷酸 Tri
CCG/CGG 33 0.07 0.22
四核苷酸 Tetra AAAC/GTTT，AAAG/CTTT，AAAT/ATTT，AACC/GGTT，AAGG/CCTT，
AATC/ATTG，AATG/ATTC，AATT/AATT，ACAG/CTGT，ACAT/ATGT，
ACCT/AGGT，ACGG/CCGT，ACTC/AGTG，ACTG/AGTC，AGAT/ATCT，
AGCG/CGCT，AGCT/AGCT，AGGG/CCCT，ATCC/ATGG
222 0.49 1.50
五核苷酸 Penta AAAAG/CTTTT，AAAAT/ATTTT，AACTG/AGTTC，AAGGG/CCCTT，
AAGTG/ACTTC，AATCG/ATTCG，AATGG/ATTCC，AATGT/ACATT，
AATTC/AATTG，ACAGC/CTGTG，ACATC/ATGTG，ACCAT/ATGGT，
ACCCC/GGGGT，ACCTC/AGGTG，ACGAG/CGTCT，ACTCG/AGTCG，
AGATG/ATCTC，AGGAT/ATCCT，ATATC/ATATG
20 0.04 0.13
六核苷酸 Hexa AAAATC/ATTTTG，AAAGGG/CCCTTT，AACCAG/CTGGTT，AACGAT/ATCGTT，
AAGCAT/ATGCTT，AAGCCG/CGGCTT，AAGGGG/CCCCTT，AATAGT/ACTATT，
ACACTC/AGTGTG，ACAGGG/CCCTGT，ACAGTC/ACTGTG，ACATGG/ATGTCC，
ACCATC/ATGGTG，ACCGCC/CGGTGG，ACGCTC/AGCGTG，ACTCCC/AGTGGG，
AGCCTC/AGGCTG，AGCCTG/AGGCTC，ATGCCC/ATGGGC
19 0.04 0.13

2.3 EST-SSR 引物的有效性及多态性检测
利用 Primer 3.0 共设计出 21 867 对 SSR 引物，为了验证其有效性，随机挑选 20 对不同重复单
元（二、三、四、五、六核苷酸）的引物对蓝靛果忍冬 DNA 进行 SSR-PCR 扩增。
结果表明，其中的 8 对引物能产生理想的 PCR 产物，5 对 SSR 引物（表 3）呈现出多态性，占
有效引物的 62.5%。共得到 27 条带，其中多态性片段 22 个，每对引物平均产生 4.4 个多态性片段，
多态性信息量（PIC）范围为 0.22 ~ 0.75，平均为 0.50。

表 3 PCR 筛选引物
Table 3 Filtering primers with PCR
引物编号
Primer No.
来源
Source
SSR 类型
SSR motif
引物序列
Primer sequence
产物长度/bp
Length of product
1 comp34262_c3 (AG)10 F：GTTCAACCCTACCTCTCCCC；R：AGAGTACCAAGTGTGCGTGT 202
2 comp34630_c0 (AT)10 F：CCAAATCCATGGCTGATGCG；R：CCTCCCCTAAACACCAACCA 171
3 comp25673_c0 (CTT)7 F：GCCTCTCATTGCTCATCCCA；R：TGGTAACTCCCACTTGGCTG 255
4 comp24675_c1 (CTT)7 F：CCGGTGGTGAACGACAGTAA；R：TGAGGCCGGGTACTGTCATA 211
5 comp30894_c0 (AAAG)5 F：CATCATCCCTCCCTGCTCAC；R：CCGGGCCATACTGTGTAGTC 232
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图 1 为 SSR 引物 1 号和 3 号在 16 份蓝靛果忍冬种质的扩增情况。利用 SSR 多态性对 16 个蓝
靛果忍冬材料进行聚类分析，在相似系数 0.63 处供试材料被聚成 3 类（图 2），第一类为采自黑龙
江勃利县的样品，第二类采自吉林汪清县的样品，第三类为采自吉林长白山的样品。


图 1 多态性引物在 16 份蓝靛果忍冬材料中的扩增
Fig. 1 PCR product of polymorphism of SSR primers in 16 different Lonicera caerulea varieties















图 2 供试蓝靛果忍冬材料的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 Cluster diagram for tested Lonicera caerulea by UPGMA method
3 讨论
关于蓝靛果忍冬的遗传多样性问题，目前在形态解剖、次生代谢物质、种子蛋白（霍俊伟和睢
薇，2009）和染色体（Tomomi et al.，2011）等多个层次进行了探讨，众多试验均证明了蓝果亚组
存在着丰富的遗传多样性。近年来，随着高通量技术的发展，大量的 SSR 标记被开发并被广泛应用
于遗传连锁图谱的构建（陈浩东，2013）、种质鉴定（葛亮，2012）、遗传多样性及基因定位与克隆
等（杨会 等，2014）。
对蓝靛果忍冬 45 656 条 Unigene（36.4 Mb）序列进行 EST-SSR 搜索，得到 14 841 个 SSR 位点，
发生频率为 32.51%，其 SSR 出现频率高于茶的 14.70%（Wu et al.，2013）、柑橘的 21.74%（Jiang et
al.，2006）和萝卜的 23.79%（Wang et al.，2012）。这种差异可能与 SSR 搜索标准、数据库大小及
物种等有关。在各物种 EST-SSR 结构中，一般三核苷酸频率最高（Liang et al.，2009），少数几种双
子叶植物以二核苷酸重复为主要类型（Kumpatla & Mukhopadhyay，2005）。本研究中蓝靛果忍冬 SSR
重复序列以二核苷酸重复为主，频率最高的是 AG/CT，与刺梨（鄢秀芹 等，2015）、胡杨（Du et al.，
2013）、芝麻（Wei et al.，2011）以及蔷薇科果树杏、桃（Jung et al.，2005）中的研究结果一致。
SSR 分子标记的多态性是判断其可用性的重要依据。SSR 的长度是影响其多态性高低的重要因
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素，当 SSR 长度 ≥ 20 bp 时多态性较高，长度在 12 ~ 20 bp 之间的 SSR 多态性中等，而长度在 12 bp
以下时多态性极低（Temnykh et al.，2001）。本研究随机合成 20 对供试引物，其中的 8 对引物能产
生理想的 PCR 产物，5 对 SSR 引物呈现出多态性，占有效引物的 62.5%。这个比率低于甜瓜的 73.3%
（胡建斌和李建吾，2009）、草莓的 85.71%（董清华 等，2011），但高于刺梨的 52.17%（鄢秀芹 等，
2015）、野三七的 50%（李翠婷 等，2014）和红豆杉的 38.71%（李炎林 等，2014）。多态性的高低
可能与材料数量及材料之间差异程度有关。5 对多态性差异引物对 16 个蓝靛果忍冬样品进行
UPGMA 聚类，被分为 3 类，比较准确地反映了供试样品之间的地域差异，同时结果显示蓝靛果忍
冬不同地域种群内也存在着丰富的遗传变异。
从多态性潜能的角度考虑，利用转录组数据开发 SSR 标记是可行的，研究结果为进一步开发新
的蓝靛果忍冬功能基因 SSR 标记奠定了基础，同时这些标记的开发为蓝靛果忍冬种质资源遗传多样
性分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘等奠定了基础。

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