全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：47–55.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0782；http：//www. ahs. ac. cn 47
番茄LemiR828 的克隆表达及其靶基因的鉴定
刘伟伟，于丽丽，方 媛，周 莹，李 洋，周 波*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：以番茄（Lycopersicum esculentum）LA1996（Aft 基因型，紫色花青素积累品系）cDNA 为模
板，对 LemiR828 前体基因和预测到的靶基因 LeTAS4（Trans-Acting SiRNA Gene 4）进行克隆，采用 RT-PCR
技术检测其在番茄果实发育中的差异表达，并用 RLM 5′RACE 技术验证 LemiR828 对预测靶基因 LeTAS4
mRNA 的剪切作用及靶作用位点。结果表明，LemiR828 的前体序列含有完整的茎环结构；在果实发育成
熟的过程中，LemiR828 及 LeTAS4 在番茄中的表达量存在差异。在绿色果阶段的表达量较低且 LemiR828
对 LeTAS4 的负调控关系不明显；而在成熟果阶段，LemiR828 及 LeTAS4 的表达量均升高，且存在明显的
负调控关系。LemiR828 能够靶作用于 LeTAS4 的转录本上调控其降解，其剪切位点为 LemiR828 序列 5′端
的第 10 位碱基。因此，在 LA1996 番茄果实发育过程中，LemiR828 和 LeTAS4 参与果实发育的调控，并
且 LemiR828 负调控其靶基因 LeTAS4 的表达。
关键词：番茄；LemiR828；LeTAS4；花青素合成
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0047-09

Clone and Expression Analysis of LemiR828 and Identification of Its Target
Gene in Tomato
LIU Wei-wei，YU Li-li，FANG Yuan，ZHOU Ying，LI Yang，and ZHOU Bo*
（College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：In order to understand the character of LemiR828 in tomato（Lycopersicum esculentum）
LA1996（with anthocyanin fruit，Aft），the precursor sequence and potential target gene of LemiR828 were
obtained by PCR using cDNA as template. The expression of LemiR828 and its target gene in tomato fruits
were also evaluated by real-time quantitative PCR. LemiR828-guided cleavage and the target site identified
on putative Trans-Acting SiRNA Gene 4（LeTAS4）mRNA were validated using RLM 5′RACE. The
precursor sequence of LemiR828 was shown to contain a complete hairpin structure. Moreover，the
expression of LemiR828 and its target gene LeTAS4 in tomato fruits differed in developmental stages.
During green fruit stages，the transcriptional level of LemiR828 and LeTAS4 were low and did not seem to
be related to negative regulation；However，in mature fruit stages，their expression was high，and LemiR828
negatively regulated the expression of LeTAS4. The mature LemiR828 targeted a sequence of high
complementarity in LeTAS4 mRNA and sheared the 10th position in LeTAS4 mRNA from LemiR828 5 end.

收稿日期：2014–10–27；修回日期：2014–12–15
基金项目：东北林业大学国家基础科学人才培养基金——科研训练及科研能力提高项目子项目（201220A5）；国家自然科学基金项目
（30800082 和 31272200）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（DL11CA03，2572014EA03-02）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：bozhou2003@163.com）
Liu Wei-wei，Yu Li-li，Fang Yuan，Zhou Ying，Li Yang，Zhou Bo.
Clone and expression analysis of LemiR828 and identification of its target gene in tomato.
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Thus，during specific developmental stages in Aft tomato fruits，LemiR828 and LeTAS4 were involved in
the regulation of fruit development and the expression of LeTAS4 was negatively regulated by LemiR828，
probably regulated anthocyanin synthesis at particular stages.
Key words：tomato；LemiR828；LeTAS4；anthocyanin biosynthesis

microRNA（miRNA）是一类内源性的、长度为 21 ~ 24 个碱基的小分子非编码 RNA，是调节
生物体生长发育的一种重要调控因子，它通过对靶基因 mRNA 的降解或者抑制其翻译等方式，在转
录后水平上特异调控靶基因的表达（Bartel，2004；Jones-Rhoades & Bartel，2004）。目前已在很多
植物，如拟南芥（Hsieh et al.，2009）、玉米（Zhang et al.，2009；Pei et al.，2013）、萝卜（Xu et al.，
2013）、小麦（Li et al.，2013）、毛白杨（Ren et al.，2013）、番茄（Karlova et al.，2013）、芜菁（Zhou
et al.，2014）中发现和鉴定了大量 miRNA。已有研究表明植物 miRNA 能参与调控植物对多种生物
及非生物胁迫的响应，包括病原菌侵染（Lu et al.，2008）、高盐胁迫（Ding et al.，2009）以及干旱
胁迫（Kantar et al.，2011）等。通过研究 microRNA 的结构和功能，有助于揭示生物体内复杂的发
育调控机制，理解其复杂的分子调控网络。
miR828 在植物中是比较保守的家族。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，miR828 介导调控的
靶基因 TAS4 与花青素合成有关，miR828 能够诱发 TAS4 转录本的剪切，进而调控下游靶基因所编
码的 MYB 转录因子以调控花青素的合成（Hsieh et al.，2009；Chen et al.，2010）。MYB 是植物转
录因子中最大的家族之一，它可参与植物的苯丙烷类次生代谢途径的调节（Gonzalez，2009；Kui et
al.，2010；Albert et al.，2011；Petroni & Tonelli，2011）。已有研究证明，在拟南芥中，miR828 负调
控蔗糖诱导的花青素合成（谢烨 等，2013）。Luo 等（2012）在拟南芥中发现 miR828 可靶向 TAS4
和 MYB113，参与花青素合成代谢的调控。Xia 等（2012）运用生物信息学技术结合降解组数据分析
发现在苹果中 10 个 miR828 靶向的 MYBs 基因，这些基因可被 miR828 介导，按 21nt 相位排列切割，
产生超过 100 个以上不同的 siRNA，通过降解组数据分析发现这些 siRNA 又可靶向 77 个基因，其
中包括 6 个 MYB 基因。贾小云等（2013）从模式植物拟南芥中分离到 pri-miR828 基因，在番茄植
株过表达导致其靶基因 Sly-myb-like1 转录因子表达量和花青素含量降低，表明 miR828 可能通过类
似的机制参与拟南芥和番茄植株体内花青素合成途径的调控。
Anthocyanin fruit（Aft）基因型番茄‘LA1996’为果实花青素积累品系。本研究中从‘LA1996’
番茄果实中分离与鉴定到 LemiR828 及其靶基因 LeTAS4，为后期研究 LemiR828 在 Aft 基因型番茄果
实生长发育和花青素合成代谢中的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 番茄材料及其总RNA提取和cDNA的合成
番茄（Lycopersicum esculentum）‘LA1996’（Aft 基因型，紫色花青素积累品系）种子为本实验
室保存。
利用植物总 RNA 提取试剂 TRNzol A+，按照试剂盒说明书，提取开花后 1 ~ 7 周的番茄果实总
RNA，以 RNA 为模板，Random 为引物通过反转录 PCR 合成 cDNA。

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1.2 番茄LemiR828 前体基因预测及克隆
在数据库 miRNA Registry Database（http：//mirbase.org/search.shtml）下载拟南芥的 miR828 序
列（miRBase 登录号：MI0005384），基于小 RNA 序列的保守性，将其在番茄基因组数据库（http：//
solgenomics.net/tools/blast/index.pl）中利用 Blast 工具（E-value 为 1e-0）进行比对，寻找番茄 LemiR828
可能的前体序列。对与 LemiR828 成熟序列 22 nt 完全匹配的基因组序列进一步筛选，采用 RNA
Structure 4.6 软件分析 LemiR828 两端约 180 nt 的核苷酸序列是否存在典型的发夹二级结构。若能形
成完整的茎环结构且成熟序列完全位于 5′端，则推测该茎环结构对应的核苷酸序列为潜在的
LemiR828 前体（LepremiR828）。以番茄 cDNA 为模板，根据 LemiR828 含有茎环结构的基因序列，
设计特异性引物（表 1）进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系为 50 μL：包含 25 μL 的 master mix（2×）、1 μL 上游引物（10 μmol · L-1）、1 μL
下游引物（10 μmol · L-1）、1 μL 的 cDNA、22 μL 的 ddH2O。PCR 反应程序为：95 ℃预变性 3 min；
95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。反应结束后，
取 5 μL 的 PCR 扩增产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的用于胶回收并纯化与 T 载体连接进行
转化和阳性克隆筛选。
1.3 番茄LemiR828 靶基因预测及克隆
将 LemiR828 序列与 psRNATarget 网站（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）中的番茄
ITAG2.3cDNA 数据库进行 Blast 比对分析。与成熟 LemiR828 高度互补结合的序列初步推测为
LemiR828 的靶基因（最多允许 4 个碱基错配）。
以番茄 cDNA 为模板，根据预测靶基因 LeTAS4 的基因序列，设计特异性引物（表 1）进行 PCR
扩增。反应结束后，取 PCR 扩增产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化目的片段。将所回收
的 PCR 产物与 T 载体连接。将连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，经平板培养蓝白斑筛选后，
随机挑取 5 个单菌落进行 PCR 鉴定。将初步验证为含有阳性转化子的单菌落送北京华大基因科技公
司进行测序验证。

表 1 LemiR828 及 LeTAS4 分析所用的引物
Table 1 Primers used for analysis of LemiR828 and LeTAS4
引物
Primer
序列
Sequence（5′→3′）
5′RACE outer primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5′RACE inner primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
5′RACE NP1（GSP1） TGTGTGCATTGAACCAGAAAACA
5′RACE NP2（GSP2） TATTTACACCCATAACCTAA
5′RACE NP3（GSP3） CATGTTGTCTTTGGGCCATGC
LepremiR828（RT）forward primer CTTTCTCATGGGGGAGACTCA
LepremiR828（RT）reverse primer TGGTTGATCAAACTACCACCTAAG
LeTAS4 forward primer TCCGCCTCTAGGTTCTAAACTTC
LeTAS4 reverse primer TGTGTGCATTGAACCAGAAAACA
LeTAS4 RT forward primer TAACCAACCTCAACCTCGGAC
LeTAS4 RT reverse primer CATGTTGTCTTTGGGCCATGC
CAC RT forward primer CCTCCGTTGTGATGTAACTGG
CAC RT reverse primer ATTGGTGGAAAGTAACATCATCG



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1.4 Real time PCR分析LemiR828 及其靶基因LeTAS4 的表达
根据 LemiR828 前体序列和 LeTAS4 序列设计 RT-PCR 引物（LemiR828 RT 引物同克隆引物），内
标基因引物参照 Expósito-Rodríguez 等（2008）报道的番茄 CAC 基因（SGN-U314153）引物序列进
行合成，序列见表 1。将不同发育阶段番茄果实总 RNA 稀释为 1µg · µL-1，并以此为模板，使用宝
生物工程（大连）有限公司的 PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）试
剂盒进行反转录反应。将反转录得到的 cDNA 产物为模板，利用 DyNAmo ColorFlash SYBR Green
qPCR Kit 试剂盒进行 Real time PCR 反应，反应在 ABI 7500（Applied Biosystems）上进行（参照试
剂盒方法）。以 CAC 基因作为内参，每个模板每种引物做 3 组试验重复、3 组生物重复。相对表达
量用2-ΔCT（ΔCT表示目标基因的CT值与内参基因的CT值的比值）表示，具体参照Livak和Schmittgen
（2001）的方法。
1.5 LemiR828 对靶基因LeTAS4 的剪切位点
鉴定
采用 RLM-5′RACE 方法验证小 RNA 对靶
标基因 mRNA 的切割作用。取果实各时期总
RNA 进行混合，直接连接 5′RACE Adaptor，纯
化后进行反转录获得 cDNA 库，利用 3 条基因
特异引物与试剂盒的接头引物组合（表 1），采
用巢式 PCR 扩增产物并回收纯化克隆测序。具
体方法参照 5′-Full RACE Kit（TaKaRa）说明
书进行。通过序列比对来分析靶基因切割的位
点。
2 结果与分析
2.1 番茄LemiR828 的前体序列预测
利用拟南芥成熟 miR828 序列在番茄基因
组数据库中进行 Blast 序列比对，搜索到 2 个
基因组序列 SL2.40ch10 和 SL2.40ch07 分别与
成熟 miR828 序列匹配，且 SL2.40ch10 匹配度
最高，与拟南芥成熟 miR828 序列仅相差 1 个
碱基。
对预测的成熟 miR828 所对应基因的两翼
序列进行二级结构分析表明，SL2.40ch10 基因
组上对应的序列能够形成完整的茎环结构且符
合植物 miRNA 前体的特征（图 1）。因此推测
该 茎 环 结 构 对 应 的 核 苷 酸 序 列 为 潜 在
LemiR828 前体（LepremiR828）。
图 1 番茄 LepremiR828 基因发夹结构
5′ 端黑色线条标明的序列为成熟 miR828 序列。
Fig. 1 Hairpin structure of tomato LepremiR828
The sequence designated by black line is mature
miR828 sequence.

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以番茄 cDNA 为模板，利用 LepremiR828
克隆引物进行 PCR 扩增，经 1%琼脂糖凝胶电
泳确认 DNA 片段与预期大小一致，为 160 bp
左右（图 2）。将片段克隆测序后得到 162 bp
长的前体序列，比对分析发现其与预测序列完
全一致。
图 2 番茄 LepremiR828 基因 PCR 电泳图
Fig. 2 PCR products of LepremiR828 in tomato
2.2 LemiR828 靶基因的预测及克隆
试验结果表明，SL2.40ch05 基因序列与成
熟 LemiR828 序列相互结合位点有 2 个碱基错
配，预测该序列为 LemiR828 的靶基因。对所
预测到的靶标基因序列进行BLAST比对分析，
结果表明 SL2.40ch05 与拟南芥中的 TAS4 同源
相似性达 61%。因此，将番茄中 LemiR828 的
潜在靶基因命名为 LeTAS4。
以番茄 cDNA 为模板，利用 LeTAS4 序列特
异性引物进行 PCR 扩增，DNA 片段大小与预
期的一致，为 868 bp（图 3）。
图 3 LeTAS4 基因全长 PCR 产物电泳图
Fig. 3 Electrophoresis of PCR product for the full-length
LeTAS4 gene 回收目的条带进行测序，将序列与拟南芥
TAS4 基因（AT3G25795）比对，发现其有很高的相似性。图 4 中蓝色箭头标注的分别为成熟 miR828
结合位点以及 TAS4-siR81（Jones-Rhoades & Bartel，2004）互补位点。



图 4 番茄 LeTAS4 基因全长与拟南芥同源基因序列的比对
蓝色箭头为 miR828 结合位点及 TAS4-siR81 互补位点。
Fig. 4 Sequence alignment of TAS4 paralogs in Lycopersicum esculentum and Arabidopsis thaliana
Blue arrow shows the binding site of miR828 and the complementary site of TAS4-siR81.


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2.3 LemiR828 及其预测靶基因LeTAS4 的表达
分析 LemiR828 和 LeTAS4 在不同发育时期番茄果实（图 5）中的表达模式。如图 6 所示，LemiR828
在果实发育前期表达量低，在成熟中后期表达量相对较高，而完全成熟果实表达量又下降。与
LemiR828 相似，靶基因 LeTAS4 在未成熟果实中表达量低，而在果实成熟过程中表达量呈上升趋势。
对比 LemiR828 与靶基因 LeTAS4 的表达模式，在果实发育前期（花后 7 ~ 35 d）二者的表达量
都较低，LemiR828 表达量高时，靶基因 LeTAS4 表达量相对低；在后期（花后 42 d 和 49 d）果实中，
二者的表达量都相对较高，LemiR828 表达量在花后 42 d 果实中高，在花后 49 d 果实中低，靶基因
LeTAS4 则相反。由此证明，LemiR828 在一定程度上负调控靶基因 LeTAS4 的表达。



图 5 番茄‘LA1996’花后发育 7 ~ 49 d 的果实
Fig. 5 The 7–49 d after flowering fruits of tomato‘LA1996’




图 6 番茄‘LA1996’果实不同发育阶段 LepremiR828 及靶基因 LeTAS4 表达模式
Fig. 6 The development stages of tomato（LA1996）and expression patterns of LepremiR828 and LeTAS4


2.4 LemiR828 对靶基因LeTAS4 剪切位点的鉴定
为了鉴定番茄体内的 LemiR828 对潜在的靶基因 LeTAS4 转录本的调控，利用 RLM 5′RACE 方
法分析靶基因 mRNA 的 3′端剪切产物，目的片段经过 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果与预期片段
120 bp 大小一致（图 7）。

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测序结果表明，LemiR828 对靶基因 LeTAS4 存在剪切调控作用，且剪切作用位点位于成熟
LemiR828 与靶基因 LeTAS4 结合序列的第 10 位和第 11 位（LemiR828 序列 5′端起始）的 A 碱基之间
（图 8），从而确定 LeTAS4 为 LemiR828 的靶基因之一。

图 8 LemiR828 对 LeTAS4 靶结合剪切位点示意图
Fig. 8 A diagram of cleavage site between
LemiR828 and LeTAS4
图 7 LeTAS4 5′RACE 扩增产物电泳分析
Fig. 7 Electrophoresis of LeTAS4 5′RACE product
3 讨论
miR828 具有高度保守性，不同植物间 miR828 序列基本一致（Luo et al.，2012），而植物 miRNA
与靶基因 mRNA 序列之间的高度互补性，有助于进行 miRNA 靶基因的生物信息学预测（Chen，
2005）。本研究中根据已知的番茄基因组数据库，利用拟南芥成熟 miR828 序列成功预测了番茄
LemiR828 基因的前体及其靶基因 LeTAS4。试验证明番茄 LemiR828 能够靶作用于 LeTAS4 剪切其转
录本，并且剪切位点符合大多数植物 miRNAs 对靶基因的剪切常常发生在结合序列中间位置的一般
性规律（Jones-Rhoades & Bartel，2004）。在拟南芥中，miR828 参与花青素合成代谢的调控，它能
够诱发 TAS4 转录本的剪切，从而产生小分子 RNAs（tasiRNAs），其中 TAS4-siRNA81（-）的靶基因
为 PAP1、PAP2（PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT 1 和 2）和 MYB113，而这些靶基因编
码的 MYB 转录因子都参与调控花青素的合成（Hsieh et al.，2009；Chen et al.，2010）。不同植物中
miR828 对目标基因的识别位点是保守的，由此推测番茄 LemiR828 功能与拟南芥 miR828 具有一定
的相似性。在拟南芥中已鉴定出 TAS4 为 miR828 的靶基因之一，参与花青素合成代谢的调控（Chen
et al.，2010），本研究中克隆得到的 LeTAS4 与拟南芥 TAS4 基因相似性很高。因此，推测番茄中
LemiR828 通过调控靶基因 LeTAS4 的表达，进而调控转录因子 MYB 的表达，从而对花青素的合成也
起到相似的调控作用。
LemiR828 及靶基因 LeTAS4 在番茄果实不同发育时期表达量不同，但 LemiR828 的表达丰度远
远低于 LeTAS4 的丰度，这也与 miRNA 的精细调节或微调控作用相关。虽然 miRNA 对靶基因表达
的抑制程度极少超过 2 倍（Seitz，2009），但是其调控速度快，且会引起其靶调控因子对结构基因
转录水平的调控，从而影响植物的发育。LemiR828 能够负调控靶基因 LeTAS4 在番茄果实中的表达，
特别是在果实成熟期，LemiR828 与 LeTAS4 表达量均上升，且 LemiR828 负调控 LeTAS4 的表达，这
可能与果实成熟后期糖的积累有关。在拟南芥中，蔗糖能诱导 PAP1 表达，接着 PAP1 能够直接结合
到 TAS4 的启动子区域来激活 TAS4 的表达（Luo et al.，2012），而 TAS4 的上升反馈负调控 PAP1 的
表达（谢烨 等，2013）；同时 PAP1 还可以正调控 miR828 的表达（Hsieh et al.，2009）。此外，LemiR828
在果实成熟以后表达量逐渐下降，这与已有研究（Cara & Giovannoni，2008；Moxon et al.，2008）
一致。贾小云等（2013）预测番茄 miR828 的另一个靶基因是乙烯不敏感基因 EIN2，并推测 miR828

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另一个重要功能是调控果实成熟，即 miR828 表达量的下降可能会导致乙烯积累，使果实成熟变软；
相反 miR828 表达量的升高会延迟果实采后呼吸跃变发生，使果实耐储性提高，这需要进一步试验
验证。在拟南芥中，miR828 除了靶调控 TAS4，还靶作用于 PAP1/MYB75 和 PAP2/MYB90 以及 MYB113
（Rajagopalan et al.，2006；Luo et al.，2012）。这些 MYB 转录因子在植物发育过程中参与花青素、
黄酮类、苯基丙酸类等次生代谢物的合成（Borevitz et al.，2000；Zuluaga et al.，2008）。
通过对 LemiR828 及其靶基因 LeTAS4 的克隆与分析，揭示了二者之间的作用关系，但需要进一
步研究番茄中 LemiR828 及 LeTAS4 潜在的多种靶调控因子之间的作用，研究这些 miRNA 及其靶基
因的功能才能更好地阐释 Aft 基因型番茄‘LA1996’花青素合成及生长发育调控作用机理。

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