全 文 ：园艺学报，2015，42 (12)：2341–2352.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0399；http：//www. ahs. ac. cn 2341
梨自交不亲和基因cDNA芯片制备及对部分砂
梨品种S基因型的鉴定
江 南 1,2,*，谭晓风 2，张 琳 2，张靖国 3，胡红菊 3
（1 湖南工业大学包装与材料工程学院，湖南株洲 412007；2 中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，
经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，长沙 410004；3 湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉 430064）
摘 要：利用东方梨中已鉴定的 52 个 S 等位基因 HV 区 cDNA 序列作为靶基因序列设计探针，制备
梨 S 基因 cDNA 检测芯片，每张芯片上含有 240 个位点 55 个 cDNA 探针，包含所有序列完善的 S 基因
HV 区特异的 cDNA 序列。以被检测品种雌蕊 cDNA 为模板，采用 Cy3 荧光修饰引物经 S 基因特异 PCR
扩增标记被检测品种的 cDNA 序列，并与芯片杂交以检测不同品种的 S 基因型。结果表明：利用 cDNA
检测芯片与‘丽江黄酸梨’、‘秀玉’、‘弥渡玉梨’、‘白面梨’和‘德胜香’等已知 S 基因型品种杂交，
杂交结果显示与 S 基因寡核苷酸芯片检测信号一致，与各品种已知 S 基因型相符合。利用 cDNA 芯片和
进一步完善的 S 基因寡核苷酸芯片并行检测鉴定了‘文山红梨’等 24 个未知 S 基因型的砂梨品种，获得
各品种的 S 基因型。梨 S 基因 cDNA 芯片的构建进一步完善了梨 S 基因检测平台。
关键词：梨；自交不亲和；S 基因型；cDNA 芯片；寡核苷酸芯片
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）12-2341-12

Preparation of S-RNase cDNA Microarray and Its Application in
Identifying Pear Cultivars S-genotypes
JIANG Nan1,2,*，TAN Xiao-feng2，ZHANG Lin2，ZHANG Jing-guo3，and HU Hong-ju3
（1School of Packing and Material Engineering，Hunan University of Technology，Zhuzhou，Hunan 412007，China；2Key
Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest of Ministry of Education，the Key Laboratory of Non-wood
Forest Product of Forestry Ministry，Central-south University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；
3Institute of Fruit and Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
Abstract：Using the cDNA sequences from Hyper variable（HV）regions of 52 S-alleles in Oriental
pear cultivars，cDNA microarray for S-RNase detections was established. Totally 240 dots and 55 cDNA
probes，which includes all the HV specific cDNA sequences of perfected S-RNase gene，were spotted on
the chip. By Cy3-labeled primers and cDNA template of tested cultivars pistils，the Cy3-labeled specific
cDNA PCR products of S-RNase were amplified and hybridized with the cDNA microarray in order to
detect the S genotype of pear cultivars. Cultivars with known S-genotype such as Lijiang Huangsuanli，
Xiuyu，Midu Yuli，Baimianli and Deshengxiang were S-genotyped using the cDNA microarray and the
results showed that the microarray analyses were consistent with their oligonucleotide genechip analyses

收稿日期：2015–07–28；修回日期：2015–12–14
基金项目：国家自然科学基金项目（31272124）
* E-mail：namijiangnan@126.com
Jiang Nan，Tan Xiao-feng，Zhang Lin，Zhang Jing-guo，Hu Hong-ju.
Preparation of S-RNase cDNA microarray and its application in identifying pear cultivars S-genotypes.
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and their RFLP and DNA sequenced results. Then the S-RNase cDNA microarrays and the oligonucleotide
genechips were used to parallel S-genotyping 24 sand pear cultivars with unknown S-genotype and their
S-genotypes were determined. In conclusion，the construction of cDNA microarrays has further improved
the pear S-RNase detection platform.
Key words：pear；self-incompatibility；S-genotype；cDNA microarray；oligonucleotide genechip

梨是典型的配子体自交不亲和植物，其自交不亲和反应由单一 S 位点复等位基因控制，现已知
梨雌蕊花柱内的 S 基因产物为具有核酸酶（RNase）活性的糖蛋白 S 核酸酶（S-RNase），特异地控
制花粉和雌蕊识别过程（Ishimizu et al.，1996；张绍铃 等，2001，2002），因此鉴定梨 S 基因型不
仅可以为梨栽培授粉品种的选择提供科学依据，也为梨品种的遗传改良奠定基础。目前确定梨品种
S 基因型的方法有田间杂交试验、PCR-RFLP 技术、DNA 测序及序列分析、cDNA 克隆、花粉管生
长检测、蛋白质电泳分析及基因芯片杂交等（江南 等，2014），采用这些技术已分别从东方梨中获
得 52 个 S 等位基因并确定了少部分梨品种 S 基因型，从西洋梨中获得 53 个 S 等位基因，均已登录
GenBank。PCR-RFLP 技术和 S 基因 DNA 序列分析法在梨 S 基因鉴定中应用较为广泛，能准确快速
鉴定品种和 S 等位基因资源较少的梨品种（如日本梨和韩国梨）的 S 基因型。中国梨品种丰富，砂
梨品种占梨品种 1/3 以上（Zhang et al.，2007，2009a，2009b；邓建军 等，2010；王立新 等，2010），
大量的地方品种或野生型个体中蕴含着种类丰富的 S 基因资源。
基因芯片技术具有快速并行检测的特点，作者在前期研究中根据已分离鉴定的 S 等位基因序列
制备了 S 基因寡核苷酸芯片（Tan et al.，2007；江南 等，2008，2014），利用芯片成功检测了 27
个梨品种 S 基因型，并结合 PCR-RFLP 技术和 DNA 序列分析方法发现了砂梨 6 个新的 S 基因，分
别命名为 S47 ~ S52，GenBank 登录号依次为 KP867051、KP890691、KP890692、KP902676、KP902677
和 KP998819。但研究中发现 S 基因寡核苷酸芯片是用梨品种 DNA 序列进行杂交的，如果芯片探针
设计位置在内含子部位，内含子的序列不同，杂交信号也会不同，根据杂交信号判断为不同的 S 基
因，但其氨基酸序列一致，授粉仍会表现为自交不亲和。针对此种情况，本研究中拟进一步研究制
作梨 S 基因的 cDNA 芯片，对同一梨品种用梨 S 基因的 cDNA 芯片和寡核苷酸检测芯片进行并行检
测，比较分析杂交结果，以保证利用基因芯片鉴定梨品种 S 基因型的准确性和可靠性。
1 材料与方法
1.1 材料
24 个未知 S 基因型和 24 个已知 S 基因型的梨供试品种均种植在湖北省农业科学院果树茶叶研
究所国家果树种质武汉砂梨圃。
2013 年 4 月采 24 个已知 S 基因型梨品种的新鲜嫩梢（带嫩叶 5 ~ 6 片），冰盒保鲜，带回实
验室后取幼嫩叶片–80 ℃保存备用。
2014 年 3 月中下旬采 24 个未知 S 基因型的梨供试品种和已知 S 基因型品种（用于芯片探针制
备及芯片质量检测）的铃铛期花枝，水插保养，带回实验室取雌蕊于–80 ℃超低温冰箱冷冻保存备
用。
引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，DNA 测序由上海铂尚生物技术有限公司完
成。
江 南，谭晓风，张 琳，张靖国，胡红菊.
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1.2 梨品种雌蕊总RNA的提取及cDNA合成
TaKaRa 公司的 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 分别提取各品种雌蕊总 RNA，取 2 μL RNA
1.5%琼脂糖电泳检测，Beckman DU-640 核酸蛋白分析仪测定浓度，取 OD260/OD280 值在 1.8 ~ 2.0
之间，且电泳检测 28S 和 18S 清晰，28S 亮度是 18S 2 倍的 RNA 于–80 ℃储存备用。
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录获得各品种雌蕊 cDNA 用于 S 基因 cDNA 特
异片段 PCR 和芯片探针制备。
1.3 基因组DNA提取及S基因特异片段PCR扩增
用 BIOER 公司 DNA 提取试剂盒从梨品种幼嫩叶片中提取 24 个供试品种的基因组 DNA，进行
DNA 检测、浓度测定及各品种 S 基因特异片段 PCR 和扩增产物荧光物质标记（江南 等，2014）。
1.4 S基因cDNA探针制备及S基因cDNA特异片段扩增
S 基因高变区（Hyper variable region，HV 区）是 S 基因富有多态性的识别部位，不同 S 基因
HV 区 cDNA 序列具有特异性。采用未进行 Cy3 荧光标记的正向引物 PF：5′-TTTACGCAGCAATATC
AG-3′（Ishimizu et al.，1999）和反向引物 PR：5′-ACRTTYGGCCAAATARTT-3′（张琳，2008）分
别以已知 S 基因型的梨品种雌蕊 cDNA 为模板，Ex Taq DNA 聚合酶进行 S 基因 HV 区 cDNA 特异
片段扩增，反应程序：94 2 min℃ ；94 30 s℃ ，50 ℃退火 30 s，70 ℃延伸 2 min，15 个循环；70 ℃
延伸 2 min 30 s，25 个循环；70 ℃总延伸 7 min。1.5%琼脂糖电泳检测，对理想 PCR 产物用 OMEGA
公司纯化试剂盒纯化回收，TA 克隆，挑选阳性克隆测定基因序列，保留各 S 基因序列准确测序稳
定的克隆，提取质粒，以质粒为模板 PF/R 再次扩增即获得各 S 基因 HV 区特异 cDNA 探针，纯化
回收 PCR 产物，浓度检测后–20 ℃储存备用，质粒–80 ℃保存。
采用合成时 Cy3 修饰的引物 PF/R 特异扩增 24 个未知 S 基因型的梨品种和对照品种[丽江黄酸
梨（S22S42）、秀玉（S4S5）、弥渡玉梨（S12S19）、白面梨（S15S19）和德胜香（S3S29）]的 S 基因
HV 区 cDNA 特异片段，1.5%琼脂糖电泳检测，对扩增理想产物回收纯化，浓度检测，–20 ℃储存
备用。
1.5 S基因cDNA芯片制备及芯片杂交
根据各 S 基因 cDNA 特异探针浓度加入适量 100% DMSO 作为点样液，调节终浓度为 300
ng · μL-1，点样仪按设计阵列将探针点样至氨基硅烷化玻片（普通载玻片经 APTES 处理）上，点样
后待玻片稍干（室温干燥玻片 30 min 左右），紫外交联仪中总能量为 350 mJ 的紫外光下照射，使
探针交联到氨基硅烷包被的玻片上，然后烘箱内 80 ℃烘烤 1 h 后，暗盒保存备用。芯片阵列共包含
GenBank 和现有相关文献报道的东方梨已鉴定的 52 个 S 基因 55 条特异 cDNA 探针，阵列设计及各
探针对应位置如图 1，图中 1 ~ 15 和 A ~ P 分别为阵列中的 15 行和 16 列编号。阵列矩形含 16 × 15
个位点，其中 PpSn、PbSn、PsSn、PuSn 和 PcSn 分别对应已鉴定的登录 GenBank 中砂梨（Pyrus pyrifolia
Nakai）、白梨（P. bretschneideri Rehd.）、新疆梨（P. sinkiangensis Yü）、秋子梨（P. ussuriensis Maxim.）
和部分西洋梨（P. communis L.）各 S 基因，以 Actin 为内参基因。引物 F5′-TGGTGTCATG GTTGGT
ATGG-3′和 R5′-CAGGAGCAACACGAAGTTCA-3′（合成时 Cy3 修饰）扩增，扩增片段 173 bp（Zhang
et al.，2014）作为阳性对照，人类高血压基因（HRG）作为阴性对照，50% DMSO 点样液作为空白
对照。


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图 1 S 基因 cDNA 探针在 cDNA 芯片阵列中的位置
Fig. 1 S-RNase gene cDNA probe location of cDNA microarray

制备好的芯片 95 ℃变性 3 min，迅速浸入预冷的无水乙醇中，离心机干燥玻片。调整各梨品种
荧光标记的 S 基因 HV 区 cDNA 特异扩增产物和 Actin PCR 产物终浓度至 200 ng · μL-1，等比例混合，
混合 PCR 产物与杂交液和灭菌水等比例混合，95 ℃水浴变性 5 min 后迅速冰上冷却，室温 3 ~ 5 min
后取适量混合液加至芯片阵列中，于杂交盒内（加 30 μL 的 3× SSC 溶液）恒温水浴 42 ℃避光杂
交 8 ~ 10 h 后，2× SSC + 0.1% SDS、0.1× SSC + 0.1% SDS、0.1× SSC 溶液依次避光洗涤 3 min，蒸
馏水冲洗 2 ~ 3 次（每次不超过 10 s），离心机干燥玻片。AXON-4100A 芯片扫描仪使用 Cy3 光源（580
nm）进行信号检测，GenePix 分析软件分析杂交点阵 Cy3 的荧光强度，信号强度扣除背景值后以各
探针重复点的平均值计算，各品种视杂交信号重复杂交 1 ~ 2 次。
1.6 S基因寡核苷酸芯片并行检测未知S基因型梨品种
根据新发现的 S 基因 S47 ~ S52 的 HV 序列分别设计各 S 基因特异的寡核苷酸探针，设计芯片（江
南 等，2008，2014），将探针按顺序补充到阵列中（按 S47 ~ S52 的顺序点样于 S46 和 5′PF1 之间的位
点），此外对应 cDNA 阵列的探针内容按顺序补充原来 S 基因寡核苷酸检测芯片中不含有的 PbS12、
PsS28、PpS32、PpS34、PsS35、PpS37、PpS38、PpS39、PbS43 等寡核苷酸探针（包括错配探针）以完善
芯片。芯片阵列重新设计含 20 × 18 个位点，按 cDNA 芯片探针位置编号方法寡核苷酸芯片各探针
对应位置如图 2。
寡核苷酸芯片杂交鉴定梨品种未知 S 基因型按江南等（2014）的步骤进行。
1.7 砂梨品种中未知S基因的鉴定
对 S 基因 cDNA 芯片和寡核苷酸芯片并行检测发现的杂交信号不一致的梨品种，纯化回收 S 基
因 PF/R DNA 特异片段并进行 TA 克隆、DNA 测序和序列分析（包含碱基序列和推导的氨基酸序列），
最终鉴定砂梨品种 S 基因型。

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图 2 S 基因寡核苷酸探针在寡核苷酸芯片阵列中的位置
Fig. 2 S-RNase gene oligonucleotide probe location of oligonucleotide gene chip
2 结果与分析
2.1 梨品种S基因特异cDNA探针制备和特异片段PCR
梨品种 PF/R cDNA 特异片段为 S 基因 HV 区不含内含子的 cDNA 序列，虽然不同 S 基因 PF/R
DNA 特异片段长度不一，但去除内含子后 PF/R 序列长度均为 200 bp 左右。24 个供试砂梨品种和
24 个已知 S 基因型梨品种（表 1）PF/R cDNA 特异扩增产物均条带清晰，长度均一（图 3）。对经测
序检测的已知 S1 ~ S52 基因以提取阳性克隆质粒为模板，PF/R 特异扩增后获得各 S 基因 HV 区特异
cDNA 探针，纯化回收后浓度检测均在 380 ng · μL-1 以上。其中 S12 ~ S13、S38 ~ S39 和 S43 分别在砂梨
和白梨品种中、S28 和 S35 分别在白梨和新疆梨品种中、S32 和 S37 分别在砂梨和秋子梨品种中 HV 区
存在明显的碱基和氨基酸序列差别，分别对相应基因不同序列制备 cDNA 探针；GenBank S 基因数
据分析发现 PpS16、PbS16 与 PpS31 基因序列完全相同，为同一 S 基因，保留 PpS16；PpS15 和 PpS38
内含子有两个碱基差别，编码区碱基序列和氨基酸序列完全相同，保留 PpS15；结合他人研究（衡
伟 等，2007，2008）还发现 PpS12 与 PpS36 基因序列完全相同，为同一 S 基因，探针设计保留 PpS12；
同时探针设计中删除不确定或不完善 S 基因序列（如 S11、S14、S23、S24、S33 ）；PpS10、PbS20、PcS25、
PbS28、PsS28、PbS30、PbS31、PpS32、PuS32、PpS34、PsS35、PuS37、PpS39、PbS38、PbS39、PuS40、
PuS41、PbS43、PpS44、PbS45 由于未采集到含相应基因的梨品种，GenBank 获得 HV 区 cDNA 序列后
由华大基因合成，实验室克隆测序检测后用于芯片探针。通过分析比较，最后得到用于 cDNA 芯片
制备点样的特异 cDNA 探针 55 条。
荧光修饰的 PF/R 引物扩增 24 个未知 S 基因型的供试砂梨品种的 S 基因 HV 区 DNA 特异片段，
获得了较好的荧光标记的特异 PCR 产物。24 个砂梨品种 PF/R 特异扩增片段大小 340 ~ 1 500 bp，其
中只有 26 号（长金二十世纪）、27 号（会理小黄梨）、32 号（兴山 23 号）、34 号（兴山 28）、35 号
（兴山 32）、36 号（兴山 40）和 44 号（十里香）品种扩增条带为双带，其他品种均为单带，为方
便杂交，双带品种 PCR 产物 1 管回收，各品种 DNA 特异扩增产物纯化回收后电泳检测如图 4。

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表 1 已知 S 基因型品种和未知供试品种
Table 1 The pear cultivars with known S-genotype and unknown S-genotype
序号
Code
来源
Source
S 基因型
S genotype
种质名称
Cultivar name
制备探针
Probe preparation
1 云南丽江 Lijiang，Yunnan S22S42 丽江黄酸梨（对照 1）
Lijiang Huangsuanli（Control 1）
PbS22，PbS42
2 S1S6 黄蜜（今村夏）Huangmili（Imamuranatsu） PpS1，PpS6，
3 S2S4 早生二十世纪 Wasenijisseiki PpS2，PpS4
4 S3S9 新高 Niitaka PpS3，PpS9
5
日本 Japan
S4S5 秀玉（对照 2）Xiuyu（Control 2） PpS5
6 湖北武汉 Wuhan，Hubei S7S17 安农 1 号 Annong 1 PpS7，PbS17
7 湖北罗田 Luotian，Hubei S8S49 罗田冬梨 Luotian Dongli PpS8，PpS49
8 云南弥渡 Midu，Yunnan S12S19 弥渡玉梨（对照 3）Midu Yuli（Control 3） PpS12
9 四川会理 Huili，Sichuan S12S26 红皮酥 Hongpisu PbS12
10 福建政和 Zhenghe，Fujian S13S43 政和大雪梨 Zhenghe Daxueli PpS13，PpS43
11 福建晋江 Jinjiang，Fujjian S13S34 鹅梨 Eli PbS13
12 陕西镇巴 Zhenba，Shaanxi S15S19 白面梨（对照 4）Baimianli（Control 4） PpS15，PbS19
13 辽宁兴城 Xingcheng，Liaoning S16S19 桔蜜 Jumi PpS16
14 浙江杭州 Hangzhou，Zhejiang S18S34 杭红 Hanghong PbS18
15 河南郑州 Zhengzhou，Henan S21S26 红香酥 Hongxiangsu PbS21，PbS26
16 浙江义乌 Yiwu，Zhejiang S15S27 早三花 Zaosanhua PbS27
17 湖北兴山 Xingshan，Hubei S29S52 兴山 19 号 Xingshan 19 PbS29，PpS52
18 河南郑州 Zhengzhou，Henan S4S35 中梨 1 号 zhongli 1 PbS35
19 云南丽江 Lijiang，Yunnan S36S37 索美梨 Suomeili PpS37
20 广东惠阳 Huiyang，Guangzhou S46S47 惠阳红梨 Huiyang Hongli PpS46
21 S47S48 兴山 20 号 Xingshan 20 PpS47，PpS48
22
湖北兴山 Xingshan，Hubei
S1S50 兴山 26 号 Xingshan 26 PpS50
23 四川汉源 Hanyuan，Sichuan S1S51 梨园麻子梨 Liyuan Mazili PpS51
24 四川 Sichuan S3S29 德胜香（对照 5）Deshengxiang（Control 5）
25 四川汉源 Hanyuan，Sichuan 汉源雪花梨 Hanyuan Xuehuali
26 日本 Japan 金二十世纪 Gold Nijisseiki
27 四川会理 Huili，Sichuan 会理小黄梨 Huili Xiaohuangli
28 兴山 17 号 Xingshan 17
29 兴山 18 号 Xingshan 18
30 兴山 21 号 Xingshan 21
31 兴山 22 号 Xingshan 22
32 兴山 23 号 Xingshan 23
33 兴山 25 号 Xingshan 25
34 兴山 28 号 Xingshan 28
35 兴山 32 号 Xingshan 32
36
湖北兴山 Xingshan，Hubei
未知
Unknown
兴山 40 号 Xingshan 40
37 湖北罗田 Luotian，Hubei 罗田短柄梨 Luotian Duanbingli
38 云南丽江 Lijiang，Yunnan 雄古冬梨 Xionggu Dongli
39 中国台湾 Taiwan，China 台湾赤花 Taiwan Chihua
40 白雪 Baixue
41
湖北武汉 Wuhan，Hubei
黄皮香 Huangpixiang
42 朵朵花 Duoduohua
43 龙团梨 Longtuanli
44
湖北远安 Yuan’an，Hubei
十里香 Shilixiang
45 广东惠阳 Huiyang，Guangdong 细花红梨 Xihua Hongli
46 广东封开 Fengkai，Guangdong 杏花大银梨 Xinghua Dayinli
47 云南晋宁 Jinning，Yunnan 细把清水梨 Xiba Qingshuili
48 云南昆明 Kunming，Yunnan 文山红梨 Wenshan Hongli
注：代号 1 ~ 24 号为已知 S 基因型品种，1、5、8、14 和 24 号为对照品种，其余均为未知供试品种。
Note：Codes 1–24 for known S genotype cultivars. Codes 1，5，8，14 and 24 for control and the others are tested cultivars.

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图 3 已知（1 ~ 24）和未知 S 基因型梨品种 cDNA PCR 产物凝胶电泳图
1 ~ 48 分别对应表 1 中的 48 个品种。
Fig. 3 cDNA PCR products of known S-genotype（1–24）and unknown S-genotype pear cultivars in agarose gel electrophoresis
The accession codes 1–48 are the same as those shown in Table 1.









图 4 未知 S 基因型供试品种 DNA PCR 产物纯化后凝胶电泳图
25 ~ 48 分别与表 1 中的对应。
Fig. 4 Purified DNA PCR products of unknown S-genotype pear cultivars in agarose gel electrophoresis
The accession codes 25–48 are the same as those shown in Table 1.

2.2 梨S基因寡核苷酸芯片和cDNA芯片对梨品种S基因型并行鉴定结果
将对照品种丽江黄酸梨、秀玉、弥渡玉梨、白面梨和德胜香的 Cy3 荧光标记的 cDNA 特异扩增
产物分别与 cDNA 芯片阵列避光杂交，1 个品种对应 1 个阵列，杂交结果如图 5。对照图 1 各位点
探针和杂交信号可判断各对照品种所含 S 基因分别为丽江黄酸梨 S22S42、秀玉 S4S5、弥渡玉梨 S12S19、
白面梨 S15S19 和德胜香 S3S29，杂交信号所示 S 基因与寡核苷酸芯片检测各品种出现杂交信号的 S 基
因（江南 等，2014）一致，杂交结果与各品种已知 S 基因型相符。说明 cDNA 芯片检测梨品种 S
基因型可行。
将文山红梨等 24 个未知 S 基因型的梨品种 Cy3 荧光标记的 cDNA 特异扩增产物和 DNA 特异扩
增产物分别对应 S 基因 cDNA 芯片阵列和寡核苷酸芯片阵列避光杂交，1 个品种对应 1 个阵列，重
复杂交 1 次，杂交结果如图 6 和图 7。

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图 5 已知 S 基因型梨品种与 cDNA 芯片杂交信号扫描
Fig. 5 The scanning results of known S-genotypes pear cultivars hybridized with the cDNA microarray




















图 6 未知 S 基因型供试品种与 cDNA 芯片杂交信号扫描
25 ~ 48 分别与表 1 中的对应。34 和 36 S 无杂交信号。
Fig. 6 The scanning results of unknown S-genotype pear cultivars hybridized with the cDNA microarray
The accession codes 25 to 48 are the same as those shown in Table 1. No S-RNase probe signal showed in microarray 34 and 36.

对应芯片阵列中探针位点和杂交信号扫描结果，cDNA 芯片检测 24 个品种中‘会理小黄梨’（27
号）等 15 个品种有两个 S-RNase 基因探针的杂交信号，包含 PpS1、PpS2、PpS3、PpS4、PpS5、PpS13、
PpS15、PpS16、PbS17、PbS18、PbS19、PbS21、PbS22、PbS26、PbS29、PpS37、PpS39、PbS42、PpS48、
PpS52 等已知 S-RNase 基因，兴山 17 号（28）、兴山 21 号（30）、汉源雪花梨（25）、兴山 32 号（35）、
罗田短柄梨（37）、白雪（40）、龙团梨（43）等 7 个品种只有 1 个 S-RNase 基因探针的杂交信号，
分别为：PbS17、PpS37、PpS16、PpS52、PbS29、PpS4、PpS3，兴山 28 号（34）和兴山 40 号（36）无
江 南，谭晓风，张 琳，张靖国，胡红菊.
梨自交不亲和基因 cDNA 芯片制备及对部分砂梨品种 S 基因型的鉴定.
园艺学报，2015，42 (12)：2341–2352. 2349
杂交信号。寡核苷酸芯片检测杂交信号扫描结果中，除兴山 18 号（29）和杏花大银梨（46），其他
22个品种杂交信号与 cDNA芯片杂交信号一致。兴山 18号 cDNA芯片杂交信号显示含PbS18和PpS39
基因，杏花大银梨含 PpS13 和 PpS48，但寡核苷酸芯片均无杂交信号（图 7）。

















图 7 未知 S 基因型供试品种与寡核苷酸芯片杂交信号扫描
25 ~ 48 分别对应表 1 中的 24 个品种。29、34、36 和 46 S 无杂交信号。
Fig. 7 The scanning results of unknown S-genotype pear cultivars hybridized with the oligonucleotides microarray
The accession codes 25 to 48 are the same as those shown in Table 1. No S-RNase probe signal showed in microarray 29，34，36 and 46.
2.3 芯片检测信号不一致品种S基因的鉴定
S 基因 cDNA 芯片和寡核苷酸芯片并行检测的 24 个品种中，兴山 18 号（29）和杏花大银梨（46）
扫描信号不一致。图 4 电泳检测显示两个品种 S 基因 PF / PR 特异扩增 DNA 片段均为单带。分别对
其 PF/PR 特异 DNA 片段纯化回收，TA 克隆、测序后，发现兴山 18 号含 1 422 bp/1 426 bp 序列，
杏花大银梨含 349 bp/362 bp 序列。GenBank 序列比对 1 422 bp 与 PbS18 有最大同源性（99%），内含
子 1 219 bp，比 PbS18 内含子少 2 个碱基同时还有 3 个碱基差异，且有 2 个突变碱基部位包含于 S18
寡核苷酸探针中，编码区碱基序列及 AA 序列相同，砂梨品种中未发现 S18，可将兴山 18 号含 PF/R
特异序列 1 422 bp 的 S 基因命名为砂梨 S18（P. pyrifolia S18）；1 426 bp 序列与 PpS39 基因同源性 99%，
内含子 1 223 bp，比 PpS39 内含子多 1 个碱基同时还有 13 个碱基的差别，编码区碱基序列及 AA 序
列相同；杏花大银梨 349 bp/362 bp 分别与 PpS13 HV 区/PpS48HV 区内含子有 3 个/2 个碱基不同，但
编码区碱基序列完全一致，根据砂梨 S5a 的命名方法（张琳，2008），兴山 18 号 1 426 bp 序列所属 S
基因可命名为 S39a（P. pyrifolia S39a），杏花大银梨 349 bp 序列命名为 S13a（P. pyrifolia S13a），362 bp
命名为 S48a（P. pyrifolia S48a）。最后确定兴山 18 号和杏花大银梨 S 基因型分别为 S18（Pp）S39a和 S13aS48a。
综合芯片杂交结果，可确定 24 个未知 S 基因型品种（25 ~ 48 号）的 S 基因型芯片并行检测结果（表
2）。

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Preparation of S-RNase cDNA microarray and its application in identifying pear cultivars S-genotypes.
2350 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (12)：2341–2352.
表 2 梨种质的 S 基因型
Table 2 S-genotypes of pear cultivars
序号 Code S 基因型 S-genotype 序号 Code S 基因型 S-genotype 序号 Code S 基因型 S-genotype
25 S16SX 33 S17S37（Pp） 41 S4S5
26 S2S4 34 SXSX 42 S1S16
27 S19S29 35 S52SX 43 S3SX
28 S17SX 36 SXSX 44 S15S52
29 S18（Pp）S39a 37 S29SX 45 S3S5
30 S37（Pp）SX 38 S21S22 46 S13aS48a
31 S29S52 39 S4S52 47 S26S29
32 S19S42 40 S4SX 48 S3S16
3 讨论
本研究中以东方梨中已鉴定的 47 个序列完善的 S 基因为基础制备了梨 S 基因的 cDNA 检测芯
片，用已知 S 基因型的梨品种与制备的 cDNA 芯片杂交检测芯片质量，芯片扫描结果显示阵列背景
清晰，阵列 S 基因位点杂交信号与对应品种 S 基因型一致，同时阳性对照（Actin）出现杂交信号，
阴性对照无杂交信号，说明探针与片基固定效果好并能与靶基因片段有效结合，制备的 cDNA 芯片
可用于梨 S 基因的检测；补充了 S 基因寡核苷酸芯片探针内容，进一步完善了 S 基因寡核苷酸芯片
结构并利用 S 基因 cDNA 芯片与寡核苷酸芯片成功并行检测了 24 个供试品种的 S 基因型，其中含
已知 S 基因的品种杂交信号一致。前期研究（江南 等，2014）表明 S 基因寡核苷酸芯片能准确检测
梨品种所含的已知 S 基因，S 基因 cDNA 芯片和寡核苷酸芯片对同一品种并行检测显示已知 S 基因
探针杂交信号一致，说明 cDNA 芯片的准确性。利用两种 S 基因芯片并行检测可直接、快速、准确
地鉴定梨品种的 S 基因型。
无论何种芯片，探针的制备及芯片杂交动力学分析是芯片制备和检测中的两个关键问题
（Lipshutz et al.，1999）。cDNA 探针的制备通常采用 PCR 结合克隆的方法完成，全长基因 cDNA
探针因不同基因长度不一致导致杂交的条件不易控制（Kenichi & Akira，1999）。本研究中选择 S
基因 HV 区作为制备 cDNA 探针的备选区域，因为从已知梨 S 基因序列比对和现有绿色开花植物 S
基因研究文献表明 S 基因有着相同的结构，包含保守区（Conserved region）和高变区（HV 区），
内含子包含于 HV 区中（Castillo et al.，2001），HV 区是 S-RNase 特异识别花粉配体的功能区，是
S 基因富有多态性的识别部位，不同 S 基因有 1 个至多个氨基酸序列的碱基差别（Ishimizu et al.，
1996；张绍铃 等，2001，2002）。虽然各 S 基因全长长度不一，但 HV 区 cDNA 长度均在 194 ~ 200
bp 左右，所以 HV 区部位制备 cDNA 探针不仅确保各 S 基因 cDNA 探针的特异性，还可保证 cDNA
探针长度均一性，方便杂交条件控制，特别是杂交温度和杂交时间的控制。经过多次试验对杂交条
件探索（另文报道）后选择用含 50%甲酰胺的杂交液（生工杂交液Ⅳ）与梨品种 cDNA 特异 PCR
产物和灭菌水等比例混合，杂交体系 42 ℃杂交 8 ~ 10 h，杂交结果表明用以上 cDNA 特异探针制备
的 S 基因 cDNA 芯片检测梨品种 S 基因型，芯片信噪比较高，假阳性率低，各阵列探针杂交信号与
S 基因寡核苷酸芯片检测相应品种出现 S 基因探针杂交信号一致，同时具备较宽的杂交动力学范围
（李亚莉 等，2002）。但由于 cDNA 探针较寡核苷酸探针（长度 32 bp）长，相对于 S 基因的寡核
苷酸芯片检测 cDNA 芯片杂交时间相对较长，如何通过进一步优化杂交体系，适当缩短时间，提高
杂交检测的效率，是 S 基因 cDNA 芯片下一步要完善的内容。
S 基因 cDNA 芯片和寡核苷酸芯片并行检测梨品种 S 基因型过程中，兴山 18 号和杏花大银梨两
个品种出现了两种芯片杂交信号不一致现象，表现为 cDNA 芯片有较好的杂交信号而寡核苷酸芯片
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无杂交信号。从芯片杂交原理分析存在以下情况：一是梨品种所含 S 基因 HV 区变异位点发生在内
含子区域，包含于寡核苷酸探针设计部位，如兴山 18 号和杏花大银梨所包含的 P. pyrifolia S18、S39a
和 S13a、S48a；二是寡核苷酸探针设计部位跨 S 基因 HV 区外显子和内含子区域，内含子部分存在变
异位点，芯片和品种 DNA 特异 PCR 产物杂交后，在同等洗脱条件下探针由于只有外显子部分序列
完整结合而容易被洗脱，出现杂交信号弱或无杂交信号。而以上情况 HV 区 cDNA 序列（不包含内
含子）稳定，因而 cDNA 芯片杂交信号好。这是寡核苷酸芯片检测梨品种 S 基因型的不足之处（江
南 等，2014）。同时在这种变异位点发生在内含子区域情况下，若无寡核苷酸芯片杂交信号作为对
照，单独根据 cDNA 芯片的杂交信号很容易出现错误判断，如兴山 18 号和杏花大银梨很容易误判 S
基因型分别为 S18S39 和 S13S48，这也是 cDNA 芯片检测梨品种 S 基因的局限性。以上分析表明利用
cDNA 芯片和寡核苷酸芯片并行检测鉴定梨品种 S 基因型正好弥补了单独利用 cDNA 芯片或寡核苷
酸芯片检测梨品种 S 基因的不足，利用两种芯片并行检测梨品种 S 基因，比较分析杂交信号，能保
证利用 S 基因芯片快速检测的准确性和可靠性。
但不管是 S 基因 cDNA 芯片还是寡核苷酸芯片，都只能检测梨品种中所含已知的 S 基因，新的
S 基因只能根据芯片杂交信号推测其存在的可能性，这是两种 S 基因芯片并行检测梨 S 基因的不足
之处。如本研究中的兴山 17 号 S17SX、兴山 21 号 S37SX、汉源雪花梨 S16SX、兴山 32 号 S52SX、罗田
短柄梨 S29SX、白雪 S4SX、龙团梨 S3SX，这些品种可能为纯合子，也可能含有新 S 基因，需辅以酶切
和 DNA 测序进行鉴定；对芯片检测无杂交信号或杂交信号不一致的品种，如兴山 28 号（SXSX）、
兴山 40 号（SXSX）、兴山 18 号和杏花大银梨，对其 PF/R 特异片段回收纯化，直接进行 TA 克隆、
DNA 测序和序列分析，可最终鉴定梨品种的 S 基因型。后续研究中将一方面根据芯片检测梨品种 S
基因型过程中出现的问题继续优化芯片内容和杂交条件，另一方面对检测过程中不断发现的新的 S
基因序列鉴定后设计和制备探针，不断完善芯片结构和芯片内容。

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