全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：99–106 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–08–20；修回日期：2013–12–03
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（200903018-7）；西北农林科技大学唐仲英育种基金项目（A212020911）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chengzh@nwsuaf.edu.cn）
‘改良蒜’抗紫斑病变异株系的离体筛选
李晓敏，程智慧*，孟焕文
（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：以‘改良蒜’品种带蒜瓣基部的茎盘为外植体，在含有不同浓度大蒜紫斑病菌粗毒素的 MS
培养基上采取分步筛选法筛选大蒜抗病变异系，并诱导形成小鳞茎；对小鳞茎繁殖的幼苗叶面喷施病菌
粗毒素进行抗病性鉴定。结果表明，大蒜紫斑病菌粗毒素对‘改良蒜’愈伤组织的诱导有显著抑制作用，
粗毒素浓度越高，抑制作用越强，抗病愈伤组织诱导的适宜病菌粗毒素浓度为 30%；在粗毒素浓度 10%、
20%和 30%的培养基上依次分步培养筛选获得了抗紫斑病变异系。粗毒素接种抗性鉴定表明，抗性系幼苗
的抗病性比对照增强。
关键词：大蒜；紫斑病；病菌粗毒素；离体筛选；抗病变异系
中图分类号：S 633.4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0099-08

In vitro Selection of Resistant Somaclonal Variation of‘Gailiang’Garlic to
Violet Leaf Spot
LI Xiao-min，CHENG Zhi-hui*，and MENG Huan-wen
（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：Using the clove base of‘Gailiang’garlic as explants the disease resistant garlic somaclonal
variation was screened on MS media containing different levels of the violet leaf spot pathogen culture
crude toxin by means of multi-step in vitro selection method. The bulblets of the resistant line were then
induced with the screened disease resistant variations and their disease resistance was tested on seedlings
growing from the bulblets by foliage spraying of the pathogen culture crude toxin. The results showed that
the pathogen crude toxin inhibited garlic callus induction evidently and the inhibition became stronger
with the increase of pathogen crude toxin concentration. The suitable concentration of pathogen crude
toxin is 30% for disease resistant somaclonal variation selection. The somaclonal variations were selected
by step culture on the MS media with different levels（10%，20%，30%）of pathogen crude toxin. The
resistance test by foliage spray inoculation of the pathogen culture crude toxin showed that the resistant
seedlings from the bulblets possessed stronger resistance to violet leaf spot than the control.
Key words：garlic；violet leaf spot；crude toxin of pathogen；in vitro selection；somaclonal
variation

紫斑病是葱蒜类作物主要真菌病害之一，其病原为葱链格孢菌[Alternaria porri（Elliott）Cif.]，

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在世界各地种植区均普遍发生（McDonald et al.，2004；邹燕 等，2009），尤其是高温和潮湿的天气
容易爆发。链格孢菌的主要致病机理是由侵入寄主植物的病原菌产生多种致病毒素，引起被侵染植
物组织的病理反应和伤害（Liakopoulou et al.，1997；Masunaka et al.，2005）。
自 Carlson（1973）利用植物组织培养技术首次成功地筛选出抗烟草野火病体细胞突变体之后，
通过在组织培养微环境中施加特定的生物、生物毒素或化学胁迫因子离体筛选植物抗性变异体的研
究迅速发展。
张恩让和程智慧（2003a，2003b）以 4 个不同生态型大蒜品种的蒜瓣基部为外植体，以不同浓
度的除草剂草甘膦为筛选因子，通过分步培养筛选，获得抗 0.10%草甘膦且抗性稳定的愈伤组织；
以 5 个不同生态型大蒜品种的蒜瓣基部为外植体，以不同浓度 NaCl 为筛选因子，通过分步培养在
含 2.0% NaCl 培养基上筛选出可部分存活且抗性稳定的愈伤组织。程智慧和邢宇俊（2005）以 3 个
马铃薯叶片愈伤组织为对象，以马铃薯晚疫病菌培养粗毒素为筛选因子，离体筛选获得可抗 40%和
50%粗毒素的抗性苗；程智慧等（2006）以 4 个马铃薯茎段外植体为筛选对象，在含不同浓度 NaCl
培养基上诱导愈伤组织，获得可抗 0.8% NaCl 的变异株。Zhang 等（2011）以 2 个大蒜品种蒜瓣基
部为外植体，以大蒜白腐病病菌粗毒素为筛选因子，离体培养筛选获得可抗 50%粗毒素的大蒜抗病
苗；程智慧等（2012）以 2 个品种蒜瓣基部诱导的愈伤组织为筛选对象，以大蒜叶枯病菌粗毒素为
筛选因子，通过离体分步筛选培养获得可抗 30%粗毒素的抗病苗。赵明敏等（2006）以茄子茎段为
外植体，以茄子黄萎病菌粗毒素为选择剂，在 15%粗毒素浓度下离体筛选出了抗茄子黄萎病愈伤组
织。Sengar 等（2009）以甘蔗红腐病菌培养滤液离体筛选获得抗病变异系；Savita 等（2011）以柑
橘疫霉菌滤液离体筛选抗病愈伤变异系并获得再生植株，接种病菌鉴定 81%植株可以存活。
利用离体筛选技术已在多种植物上获得抗病变异体（Gayatri et al.，2005；敖世恩 等，2006；
胡玉林 等，2008），但利用大蒜紫斑病菌粗毒素筛选大蒜抗病无性系变异的研究尚未见报道。‘改
良蒜’是中国陕西等地主栽大蒜品种之一，其蒜薹和蒜头商品性好，但不抗紫斑病。本研究旨在确
定离体筛选‘改良蒜’抗紫斑病变异无性系的病菌粗毒素浓度并筛选抗紫斑病变异系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2010—2012 年在陕西杨凌进行。供试‘改良蒜’属于紫斑病感病品种，由本课题组在
西北农林科技大学园艺场大蒜种质资源圃种植保存。供试大蒜紫斑病原菌由本课题组 2009 年从陕西
杨凌大蒜田间典型紫斑病叶上分离获得，并鉴定、保存。
1.2 病菌粗毒素制备
在制备病原菌粗毒素前，先将紫斑病病原菌在 PDA 培养基上活化，使其保持较高的活性。病菌
粗毒素采用改良 Fries 液体培养基（每 1 L 蒸馏水中含蔗糖 30 g，酒石酸铵 5 g，NH4NO3 1 g，MgSO4
0.5 g，NaCl 0.5 g，结晶 CaCl2 0.1 g，酵母膏 0. 5 g，配好后调 pH 值至 7.0）培养获得。具体方法是：
用 0.5 cm 灭菌的打孔器从 PDA 培养基上打取紫斑病菌菌饼，接种于 Fries 液体培养基中，每瓶接种
5 块，在温度 26 ℃条件下连续黑暗振荡培养 6 d（沈永杰 等，2007），再由砂芯过滤装置经 0.22 µm
无菌滤膜过滤除去菌丝体，获得 100%的无菌粗毒素。
1.3 病菌粗毒素致病性的测定
从试验田采取生长健康、均匀一致的 4 叶期‘改良蒜’的叶片若干，用针刺法进行离体致病性
1 期 李晓敏等：‘改良蒜’抗紫斑病变异株系的离体筛选 101

测定。从叶片中部截取 7 cm 长叶段，经表面消毒后放在直径为 9 cm 的培养皿中。设 2 个处理，处
理 1 在离体叶片正面用无菌针刺一个伤口，然后用微注射器注滴 100%粗毒素 5 µL，处理 2 用 0.5 cm
打孔器从 PDA 培养基上取病原菌菌饼，置于离体叶片正面，每个培养皿放 3 个叶片，重复 3 次，以
无菌水为对照，室温下培养，4 d 后观察叶片发病情况（邹燕 等，2009）。
1.4 大蒜离体培养基
‘改良蒜’外植体愈伤组织诱导培养基为 MS + 2.0 mg · L-1 2,4-D + 1.0 mg · L-1 6-BA，愈伤组织
继代培养基为 MS + 1.0 mg · L-1 NAA + 1.0 mg · L-1 6-BA，愈伤组织增殖以及芽分化培养基为 MS +
1.0 mg · L-1 NAA + 5.0 mg · L-1 6-BA，生根培养基为不加激素的 MS 培养基。
1.5 抗紫斑病变异系筛选
1.5.1 外植体诱导愈伤组织对病菌粗毒素的耐受浓度测定
将去皮的‘改良蒜’蒜瓣经过表面消毒后，取带 0.5 cm 蒜瓣基部的茎盘为外植体，纵向划十字
切成 4 块，分别接种到粗毒素体积分数为 10%、20%、30%、40%的愈伤诱导培养基上，每瓶接种 4
块，每处理接 5 瓶，重复 3 次，共计 15 瓶。以未加毒素的培养基为对照，对照共计 15 瓶。培养 45 d
后统计愈伤组织的诱导率及发育状态，确定大蒜离体组织对病菌粗毒素的耐受浓度。
愈伤组织诱导率（%）=（出愈外植体数/接种外植体数）× 100。
1.5.2 抗病愈伤组织分步筛选和抗病变异系诱导
将去皮的‘改良蒜’蒜瓣经过表面消毒后，取带 0.5 cm 厚蒜瓣基部的茎盘为外植体，纵向划十
字切成 4 块，接种到含粗毒素浓度 10%的培养基上，每处理 30 瓶，重复 3 次，共计 90 瓶，进行抗
病筛选；25 d 后将产生的愈伤组织或不定芽切去叶子后，转接到含粗毒素浓度 20%的培养基上，培
养 25 d 后形成抗性愈伤组织；将该愈伤组织再转接到含粗毒素浓度 30%的培养基上进一步筛选，期
间每隔 25 d 继代 1 次。在不同浓度病菌粗毒素培养基上筛选培养期间，观察愈伤组织生长状况，测
定相对生长量。
相对生长量（%）=（培养后鲜质量–接入时鲜质量）/接入时鲜质量 × 100。
将经过 30%粗毒素筛选的抗病愈伤组织在无毒培养基上继代培养 4 次，每代培养 25 d，然后进
行不定芽诱导和生根培养，形成抗性试管苗，并在培养瓶中诱导形成试管小鳞茎；或将抗性试管苗
移栽在营养钵中培养形成小鳞茎。
以相同外植体在不加病菌粗毒素的培养基上培养为对照，对照设置 30 瓶，其继代时间与各处
理相同，诱导形成对照试管苗和小鳞茎。
1.6 再生植株的抗病性鉴定
选取大小一致的抗性小鳞茎和对照小鳞茎各 2 个，置 4 ℃打破休眠后种植在灭菌基质（嘉卉牌
蔬菜育苗基质，山东省高唐县泉林生态科技有限责任公司生产）中，待其长到 3 叶时活体喷施 100%
病菌粗毒素，观察比较抗性苗与对照苗的发病情况。
2 结果与分析
2.1 病菌粗毒素的致病性及其诱导大蒜抗性愈伤组织的适宜浓度
‘改良蒜’叶片离体接种病菌粗毒素后 4 d 观察叶片发病情况，注滴 100%粗毒素的叶片发病病
斑明显，叶片变黄（图 1，A），与直接接种病原菌菌饼的叶片发病初期症状（图 1，B）相同；而
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注滴无菌水的叶片无病症（图 1，C），说明该病菌粗毒素具有较强的致病能力。


图 1 接种紫斑病病原菌或粗毒素 4 d 后大蒜叶片发病症状
A：接种100%病菌粗毒素；B：接种病原菌菌饼；C：对照，接种无菌水。
Fig. 1 Symptoms on garlic leaves 4 days after inoculation of the pathogen or its crude toxin of violet leaf spot
A：Inoculation of crude toxin；B：Inoculation of pathogen；C：Control，inoculation of sterilized water.

随着病菌粗毒素浓度的增加，愈伤组织诱导率显著降低，当病菌粗毒素浓度提高到 30%时，愈
伤组织诱导率降低为 20%；当病菌粗毒素浓度提高到 40%时，愈伤组织诱导率仅为 7%。病菌粗毒
素浓度越高，大蒜愈伤组织诱导越困难（表 1）。

表 1 不同浓度紫斑病菌粗毒素对‘改良蒜’愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of different concentration crude toxin of violet leaf spot pathogen on callus inducement of‘Gailiang’garlic
粗毒素浓度/%
Crude toxin concentration
接种外植体数
Number of explants inoculated
出愈外植体数
Number of explants induced callus
愈伤诱导率/%
Callus induction rate
0 60 57 95.0 ± 0.13 a
10 60 49 81.7 ± 0.18 a
20 60 34 56.7 ± 0.27 b
30 60 15 25.0 ± 0.23 c
40 60 4 6.7 ± 0.11 d
注：表中‘愈伤诱导率’列不同小写字母表示差异显著（P < 0. 05）。
Note：Different letters in the column of‘callus induction rate’show significant difference at P < 0. 05 level.

10%和 20%的病菌粗毒素对‘改良蒜’愈伤组织诱导抑制作用不明显，仅少量外植体表面有褐
化。大蒜健康的愈伤组织呈淡绿色，新鲜、均匀、疏松。在含 10%病菌粗毒素的培养基上，愈伤组
织呈黄绿色，较新鲜、疏松，质量较好（图 2，A）。



图 2 不同浓度紫斑病菌粗毒素对‘改良蒜’愈伤组织诱导的影响
A：10%粗毒素；B：20%粗毒素；C：30%粗毒素；D：40%粗毒素。
Fig. 2 Influence of different concentration crude toxin of violet leaf spot pathogen on callus inducement of‘Gailiang’garlic
A：10% crude toxin；B：20% crude toxin；C：30% crude toxin；D：40% crude toxin.
1 期 李晓敏等：‘改良蒜’抗紫斑病变异株系的离体筛选 103

在含 20%病菌粗毒素的培养基上，大蒜愈伤组织呈黄色，质量稍差（图 2，B）。由于 10%和
20%病菌粗毒素对大蒜愈伤组织诱导的抑制作用弱，愈伤组织生长受影响也较小，因此不利于有效
筛选抗病变异系。
在 30%病菌粗毒素培养基上，多数外植体表面褐化或坏死，且愈伤组织诱导率显著降低，诱导
的愈伤组织呈黄褐色，致密，生长受到明显抑制（图 2，C），但仍能生长增殖。
40%病菌粗毒素则强烈抑制愈伤组织诱导，多数外植体深度褐化坏死（图 2，D），无愈伤组织
诱导，或仅有极少量的愈伤组织诱导且多坏死。
将在含 30%病菌粗毒素的培养基上获得的愈伤组织转到无毒素培养基上继代 4 次，可以分化芽
并再生植株；在 40%病菌粗毒素培养基上筛选的愈伤组织转到无毒素培养基上未能生长再生植株。
因此认为，‘改良蒜’抗紫斑病无性系变异筛选的适宜病菌粗毒素浓度为 30%。
2.2 抗性愈伤组织分步筛选和抗病变异系诱导
在 10% ~ 30%的病菌粗毒素培养基上逐级分步筛选，获得抗 30%病菌粗毒素的抗性愈伤组织。
在此筛选过程中，不同浓度病菌粗毒素对大蒜愈伤组织生长表现出不同程度的抑制作用（表 2）。

表 2 紫斑病病菌粗毒素分步筛选对‘改良蒜’愈伤组织生长的影响
Table 2 Effect of crude toxin of violet leaf spot pathogen on callus induction and growth
of‘Gailiang’garlic in multi-step selection
粗毒素浓度/%
Crude toxin concentration
接种鲜质量/g
Fresh weight inoculated
25 d 后鲜质量/g
Fresh weight 25 days after
相对生长量/%
Relative growth
0 1.00 ± 0.19 2.85 ± 0.56 290.0 ± 0.4 a
10 0.44 ± 0.18 1.88 ± 0.78 283.0 ± 2.0 a
20 1.88 ± 0.78 2.89 ± 1.21 54.0 ± 1.2 b
30 1.51 ± 0.25 1.61 ± 0.21 17.8 ± 0.1 c
注：表中‘相对生长量’列不同小写字母表示差异显著（P < 0. 05）。
Note：Different letters in the column of‘relative growth’show significant difference at P < 0. 05 level.

在 10%病菌粗毒素培养基上相对生长量与对照接近，差异不显著。
在 20%病菌粗毒素培养基上愈伤组织生长受到严重抑制，相对生长量与对照和 10%病菌粗毒素
处理均差异显著。
在 30%病菌粗毒素培养基上，愈伤组织生长受到进一步抑制，相对生长量与对照及 10%和 20%
病菌粗毒素处理均差异显著。
未经病菌粗毒素筛选的大蒜对照愈伤组织在无毒素培养基上继代培养时生长健康，呈新鲜、均
匀、疏松状（图 3，A）。
经逐级分步筛选到 30%病菌粗毒素培养基的抗病愈伤组织，在无毒素培养基上继代培养时，虽
然不如对照愈伤组织生长旺盛，但该抗性愈伤组织状态也比较健康（图 3，B）。
在芽分化培养过程中，对照愈伤组织芽分化率高，分化正常（图 3，C）。
抗性愈伤组织的芽分化率虽然不如对照，但仍有较多的芽分化（图 3，D）。
抗性愈伤组织虽然有个别形态变异的不定芽分化（图 3，E），但大多数不定芽呈丛生状，生长
正常（图 3，F），并能形成抗性试管小鳞茎（图 3，G）。
试验共收获 6 个成熟的抗性试管小鳞茎，均为独头蒜（图 3，H）。


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图 3 ‘改良蒜’抗紫斑病无性系变异筛选过程
A：对照愈伤组织（无毒素）；B：抗性愈伤组织；C：对照芽（无毒素）；D：抗性芽；E：形态发生变异的抗性芽；
F：丛生抗性芽；G：抗性试管小鳞茎；H：抗性小鳞茎。
Fig. 3 Selection process of the resistant variation to violet leaf spot pathogen from‘Gailiang’garlic
A：Control callus（No crude toxin）；B：Resistant callus；C：Control shoots（No crude toxin）；D：Resistant shoots：E：The deformed resistant
shoots；F：Resistant multiple shoots；G：Resistant bulblets in tube；H：Resistant bulblets.

2.3 抗病变异系抗病性鉴定
将抗性小鳞茎和未经抗病筛选的对照小鳞茎盆栽生长至 3 叶期，叶面喷施病菌粗毒素 7 d 后观
察比较其抗病性差异，对照植株叶片变黄，表现明显的发病症状（图 4，A），与离体叶片喷施粗毒
素症状一致。经过抗性筛选的抗性植株生长势良好，叶片未见发病症状（图 4，B），说明筛选的抗
性植株具有一定的抗病性。


图 4 ‘改良蒜’抗紫斑病变异系活体接种病菌粗毒素抗性鉴定
A：对照植株；B：抗病植株。
Fig. 4 Resistance in vivo identification of the screened resistant variation by inoculation of pathogen crude toxin
A：Control plant；B：Resistant plant.
3 讨论
植物病原菌代谢产生的毒素是导致寄主植物发病的因子，在植物组织培养过程中加入适当剂量
的病原菌培养液滤液或粗毒素作为筛选压力，可以筛选获得抗病体细胞变异（Thakur et al.，2002；
1 期 李晓敏等：‘改良蒜’抗紫斑病变异株系的离体筛选 105

Kumar et al.，2008；Rao & Ramgoapl，2010；Zhang et al.，2011；程智慧 等，2012）。但是利用病
菌粗毒素筛选抗病体细胞时，必须明确毒素是否能引起植株产生典型症状（赵蕾 等，2001）。本研
究通过在供试大蒜品种离体叶片的正面注滴病原菌粗毒素，测定其致病性，注滴病原菌粗毒素的叶
片发病病斑明显，叶片变黄，与接种病原菌的叶片发病初期症状相同，说明供试大蒜紫斑病病原菌
培养液粗毒素具有较强的致病能力，用于抗病筛选是有效的。
利用病原菌的致病粗毒素筛选抗病突变体，其剂量大小是筛选的另一关键因素。粗毒素剂量太
高，容易导致一些抗病材料死亡；粗毒素剂量太低，则不易获得高抗材料（赵蕾 等，2001；Kumar
et al.，2008）。不同材料适用的病原菌粗毒素剂量也不一致。林丛发等（2010）确定了离体筛选太子
参抗叶斑病愈伤组织的病菌粗毒素浓度为 15% ~ 20%。本研究通过在大蒜外植体诱导愈伤组织的培
养基质中添加不同浓度（10% ~ 40%）的大蒜紫斑病病原菌粗毒素，根据外植体受毒素伤害情况和
愈伤组织诱导率，确定 30%病菌粗毒素为筛选抗病变异系的适宜浓度。病菌粗毒素浓度太高导致‘改
良蒜’大量外植体深度坏死和死亡，难以分化愈伤组织；病菌粗毒素浓度太低，选择压力不够，难
以筛选出抗病的变异系。
抗病变异系的抗病稳定性鉴定至关重要。利用粗毒素筛选抗病植株的研究中一般采用病菌粗毒
素接种进行抗病性鉴定。本研究中将获得的抗性小鳞茎种植后，在大蒜幼苗上叶面喷施病菌粗毒素
进行抗性鉴定。喷施病菌粗毒素 7 d 后对照植株发病，而抗性植株生长正常，表明筛选的抗病变异
系获得了抗病性。大蒜抗病变异系的抗病性可能与其抗氧化活性的提高及叶片解剖结构的改变有关
（李晓敏 等，2012）。
本研究结果表明，‘改良蒜’抗紫斑病变异系离体筛选适宜的病菌粗毒素浓度为 30%，通过 10%、
20%、30%病原菌粗毒素逐级分步培养愈伤组织，可以筛选获得抗性愈伤组织，并分化再生植株，
获得抗病变异系。

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