全 文 ：园艺学报，2015，42 (6)：1139–1149.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1058；http：//www. ahs. ac. cn 1139
收稿日期：2015–02–03；修回日期：2015–04–23
基金项目：国家自然科学基金项目（31370698）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013A004，2362014xk10）；国家级大
学生创新创业训练计划项目（201410635065）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：limy@swu.edu.cn）
蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析
敬 帆，罗登攀，马 婧，李名扬*
（西南大学园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715）
摘 要：利用hiTAIL-PCR法，从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6
翻译起始位点上游 1 266 bp 的启动子序列。生物信息学分析表明，该启动子序列中存在启动子的基本元件
TATA-box 和 CAAT-box 及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析 CpAGL6 启动子的功能，
构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体，并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS
组织化学染色及 GUS 酶活性定量检测，结果显示，CpAGL6 基因启动子能够驱动 GUS 基因在转基因烟草
的叶、茎、花中表达，并且在不同花期表达强度存在差异，在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤
霉素和 4 ℃低温处理后，GUS 酶活性均有所增加。结果表明，CpAGL6 启动子主要驱动 GUS 报告基因在
花器官和绿色器官组织中表达，推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。
关键词：蜡梅；CpAGL6 基因；启动子；GUS 基因
中图分类号：S 685.17 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）06-1139-11

Cloning and Preliminary Functional Analysis of CpAGL6 Promoter from
Chimonanthus praecox
JING Fan，LUO Deng-pan，MA Jing，and LI Ming-yang*
（College of Horticulture and Landscape，Southwest University，Chongqing Engineering Research Center for Floriculture，
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Chongqing 400715，
China）
Abstract：The regulative sequence（1 266 bp）of the flower development-related gene CpAGL6
promoter was cloned from genomic DNA of Chimonanthus praecox by hiTAIL-PCR. Bioinformatics
analysis revealed that the promoter sequence contained basic cis-elements，such as TATA-box and
CAAT-box and many elements involved in the plant abiotic stress. In order to study the function of
CpAGL6 promoter，a promoter-reporter vector was constructed，and introduced into tobacco by
Agrobacterium-mediated method. Then the transgenic tobacco with GUS histochemical staining and
quantitative detection of GUS enzyme activity were analyzed，the results showed that CpAGL6 promoter
could drive the GUS gene exclusively express in leaves，stems and flowers of transgenic tobacco，and there
were significant differences of GUS enzyme activity among the flowers in different stages，almost no
expression in roots. GUS enzyme activity of transgenic plants have increased under different treatments，
including darkness，gibberellin（GA3）and 4 ℃ low temperature. The results indicated that CpAGL6 promoter

Jing Fan，Luo Deng-pan，Ma Jing，Li Ming-yang.
Cloning and preliminary functional analysis of CpAGL6 promoter from Chimonanthus praecox.
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mainly driven GUS reporter gene expression in floral organs and green organs or tissues of tobacco，
playing a very important role in abiotic stress resistance.
Key words：Chimonanthus praecox；CpAGL6 gene；GUS gene；promoter

MADS-box 基因广泛存在于植物、动物及真菌中，其编码的转录因子在真核生物的生长发育和
信号转导过程中扮演着重要的角色（Ng & Yanofsky，2001；Becker & Theissen，2003；Messenguy &
Dubois，2003），在植物中，MADS-box 基因具有调节根、叶、花及果实发育的作用，特别是在显花
植物的花器官分化、开花时间的调节和果实发育与成熟等方面起到重要的调控作用（Irish，2003）。
AGL6 亚家族基因属于 MADS-box 基因 MIKC 家族中 AP1/AGL9 组的一个遗传冗余基因，为 SEP
类的姐妹类群。AGL6 类和 SEP 类均可能起源于 AP1 的复制（Alvarez-Buylla et al.，2000；Theissen
& Saedler，2001）。目前在裸子植物、双子叶植物及单子叶植物中都克隆到了一些 AGL6 同源基因，
如欧洲云杉(Carlsbecker et al.，2004，2013)、买麻藤（Shindo et al.，1999；Winter et al.，1999）、欧
洲红豆杉（Lovisetto et al.，2012）、拟南芥（Ma et al.，1991）、玉米（Mena et al.，1995）。目前的研
究表明 AGL6 是与花器官发育相关的基因，具有调节开花时间、花分生组织特性决定、花器官特征
决定 3 方面的功能（王珍华 等，2012）。Rijpkema 等（2009）的研究表明 AGL6 基因在花分生组织
和花器官发育上的功能可能类似于 SEP 基因。樊金会等（2007）的研究证实，AGL6 类基因的异位
表达能够激活 SEP1、AG、SOC1、FT 和 LFY 等基因的表达，从而引起开花提前、植株矮小和花器
官的同源转化等。Melzer 等（2010）认为控制花发育基因调节网络的 4 个中心参与者（SQUA-like、
DEF/GLO-like、AG-like 和 AGL6/SEP1-like）中也包含有 AGL6-like 基因。人们对 AGL6 类基因的功
能及其重要性有了较为充分的认识，但 AGL6 基因与其上下游基因之间的关系还不清楚，特别是该
类基因启动子的相关研究还未见报道。
目前蜡梅（Chimonanthus praecox）的生理生化研究己经有了一定的基础，但是对蜡梅开花的分
子机理了解甚少，对其开花转录调控方面的相关研究报道也不多（Wang et al.，2011）。本实验室对
蜡梅 CpAGL6 基因的相关研究发现，CpAGL6 基因具有参与调控四轮花器官和花分生组织的决定性
的 E 功能基因（Ditta et al.，2004）的功能，与蜡梅花器官发育和开花时间有关，其功能类似于其他
单子叶、双子叶植物的 AGL6-like 基因，该基因在蜡梅花中瓣中优势表达，是开花过程中的必要基
因（Wang et al.，2011）。CpAGL6 基因已被克隆，但该基因启动子克隆及功能分析未见报道。
本研究中利用 hiTAIL-PCR 法从蜡梅中克隆到 CpAGL6 的启动子，利用生物信息学手段分析了
启动子的顺式作用元件，用该启动子与 GUS 基因融合的植物表达载体转化烟草，并研究该启动子
GUS 基因的表达部位及对非生物协迫的响应，为初步了解 CpAGL6 在植物发育过程中的表达模式提
供试验依据，并为蜡梅的基因工程遗传改良提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 蜡梅材料及其 CpAGL6 启动子的克隆与调控元件分析
供试蜡梅品种为罄口蜡梅，采自西南大学园林花卉研究所资源圃。用于转化的烟草（Nicotiana
tabacum‘Wisconsin 38’）组培苗、根癌农杆菌菌株 GV3101、大肠杆菌感受态细胞 TOP10 及植物表
达载体 pBI121 均由本实验室保存。
于 2013 年 6 月采集生长健壮的幼嫩蜡梅叶片，采用天根公司的 DNA 小量提取试剂盒提取蜡梅
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蜡梅 CpAGL6 基因启动子的克隆及功能初步分析.
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表 1 TAIL-PCR 引物
Table 1 Primers of TAIL-PCR
引物名称
Name of primer
序列（5′–3′）
Primer sequence
LAD1 ACGATGGACTCCAGAGVNVNNNGGAA
LAD2 ACGATGGACTCCAGAGBNBNNNGGTT
LAD3 ACGATGGACTCCAGAGVVNVNNNCCAC
LAD4 ACGATGGACTCCAGAGBDNBNNNCCAA
LAD5 ACGATGGACTCCAGAGBDNBNNNCGGT
AC0 GGACGATGGACTCCAG
AC1 ACGATGGACTCCAGAG
CpAGL6RB0 TCCAAGTAGATGCCTTTGTGAACGC
CpAGL6RB1 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTTCCGA
ACTCGTAGAGCTTCCCGC
CpAGL6RB2 TTCAGCATCGCAGAGAACGGAGAGC
基因组 DNA。利用 Liu 和 Chen（2007）改良
的 hiTAIL-PCR 法扩增蜡梅花发育相关基因
CpAGL6 的启动子序列，以已知 CpAGL6 基因
5′端序列为基础，设计 3 条特异的巢式引物
RB0、RB1 和 RB2，结合 5 条 LAD 简并引物
及 AC0、AC1（表 1）进行 3 轮 PCR 扩增。
以 50 ng 的蜡梅基因组 DNA 为预扩增模
板，LAD1 ~ LAD5、AC0、RB0 为引物进行预
扩增；以预扩增的产物稀释 50 倍后作为模板，
AC1、RB1 为引物进行第 1 轮扩增；再以第 1
轮扩增产物稀释 10 倍后作为模板，AC1、RB2
作为引物进行第 2 轮扩增。将所得 PCR 产物利
用离心柱型琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（BioFlux 公司）进行回收，连接到 pMD19-T 载体后转化
大肠肝菌，送阳性克隆到上海英骏公司进行测序。最后将测序结果运用 DNAstar 软件进行分析。
所获序列经过同源比对确定为 CpAGL6 基因 5′侧翼序列后，设计并合成引物：FCpAGL6pro
（5′-CAAGCTTCAGACCAACAGCTTGATTCATACCG-3′，下划线部分为 HindⅢ酶切位点）和
RCpAGL6pro（5′-CGGATCCTCTCTTACACACAGATGGATAGGAT-3′，下划线部分为 BamHⅠ酶切
位点）。以蜡梅叶片基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，25 个循环；72 ℃延伸 10 min。将获得的 PCR 产物胶回收、连接转化
后送往上海英骏公司进行测序。
将所得的蜡梅 CpAGL6 基因上游启动子序列用在线分析软件 PLACE（http：//www. dna. affrc. go.
jp/PLACE/）和 Plant CARE（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html）进行分析，
寻找该启动子保守区域中潜在的转录调控元件。
1.2 植物表达载体的构建
植物表达载体 pBI121 是一个双元载体，含有 GUS 基因系统和 CaMV35S 启动子。为了研究
CpAGL6 基因启动子的功能，用其替换植物表达载体 pBI121 中的 35S 启动子，与 GUS 报告基因融
合，构建植物表达载体。用 HindⅢ和 BamHⅠ分别双酶切 PCR 扩增所得片段和 pBI121 载体，分别
回收酶切产物后进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌 TOP10，经 PCR 和酶切鉴定后获得阳性
克隆，命名为 pBI121-CpAGL6pro。将阳性质粒用电转法转入农杆菌 GV3101，经 PCR 初步鉴定阳
性菌落后提取其质粒，再反转大肠杆菌 TOP10，提取其质粒进行酶切鉴定。
1.3 农杆菌介导的叶盘法转化烟草及 GUS 瞬时表达鉴定
以 GV3101 空菌株为阴性对照，含 pBI121 载体的菌株为阳性对照，对已构建的蜡梅 CpAGL6
启动子的重组载体进行瞬时表达分析。将切成 1 cm2 的烟草叶块放入农杆菌菌液浓度 OD600 为 0.6 的
侵染液中侵染 10 min，用无菌滤纸将叶片表面的菌液吸干后置于共培养基上培养 3 d 后进行 GUS 染
色（Jefferson，1987），用 75%的乙醇脱色处理至阴性对照为白色时，用实体显微镜进行观察并照相。
1.4 转基因株系的筛选鉴定
提取抗性植株（抗生素 Km 100 mg · L-1，Cb 200 mg · L-1）叶片 DNA，用引物 FCpAGL6pro 和
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RCpAGL6pro 对所提取的 DNA 做 PCR 验证。PCR 扩增反应体系：DNA 模板 1 μL，10 × Ex Taq 缓
冲液 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，特异引物 FCpAGL6pro 1 μL、RCpAGL6pro 1 μL，ExTaq 酶 0.2 μL，加
ddH2O 补足到 25 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 60 s，63 ℃退火 45 s，72 ℃延伸
90 s，30 个循环，72 ℃延伸 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，进一步筛选阳性植株。
1.5 转基因烟草各组织、不同花期完整花及非生物协迫下的组织化学染色及 GUS 酶活性测定
采集 PCR 检测为阳性的转基因烟草植株的根、茎、叶及花器官各组织进行 GUS 组织化学染色，
并设立转 CaMV35S 启动子的烟草为阳性对照，以未转化的野生型烟草为阴性对照。
利用 Varioskan Flash 全波长扫描式多功能读数仪（多功能酶标仪）进行总蛋白浓度和 GUS 酶活
性测定（Bradford，1976；Li et al.，2009）。具体方法简述如下：将 0.1 g 新鲜植物样品用液氮研磨
后立即收集到 1.5 mL 的 EP 中，加入 600 μL GUS 提取缓冲液，充分混匀后离心。取蛋白上清液 10 μL，
加水至 500 μL，混匀后冰上放置 5 min，测定 595 nm 处的光吸收值，根据蛋白标准曲线计算样品蛋
白的含量。取 100 μL 含 GUS 的上清液，加入到 500 μL 在预热的 MUG（2 mmol · L-1）溶液中，迅
速充分混匀后立即取出 50 μL 混合液于 950 μL 反应终止液（0.2 mol · L-1 Na2CO3）中，作为酶促反
应零点。此后在 5、15、30、45 和 60 min 时分别取出 50 μL 反应液，加入到 950 μL 的终止液中终
止反应。用多功能酶标仪在 365 nm 处的激发波长和 455 nm 处的发射波长下，测定各样品不同时间
点的荧光值。求出单位时间内 GUS 酶活性，GUS 酶活力以每分钟每毫克蛋白酶活力表示
（pmol · mg-1 · min-1）。
本试验样品有转基因烟草的不同组织、不同花期花器官、不同协迫条件处理后的转基因烟草叶
片及未处理转基因烟草叶片，各试验均以转化 pBI121 载体的转基因烟草为阳性对照，野生型烟草作
为阴性对照，各样品均设置 3 个重复，最后取其平均值进行验证分析。其中非生物协迫处理过程为：
选取生根 1 个月后长势基本一致的健状转基因烟草苗 9 株，分为 3 组，每组 3 株。向第 1 组转基因
烟草苗叶面喷施 70 μmol · L-1 赤霉素（李燕，2012），于正常条件下培养 3 d；将第 2 组转基因烟草
苗置于 4 ℃培养箱中培养 3 d；将第 3 组转基因烟草苗置于遮光培养箱中培养 3 d。未做处理的对照
转基因植株于正常条件下培养 3 d。
2 结果与分析
2.1 CpAGL6 启动子序列的获得
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 3 轮 PCR 产物，预扩增产物以非特异带为主，电泳结果呈现涂抹状。
将第 1 轮和第 2 轮的 PCR 产物分别点入相邻泳道检测，结果如图 1 所示。


图 1 CpAGL6pro 的第 1 轮和第 2 轮扩增
Fig. 1 Primary and secondary amplification of CpAGL6pro
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图 2 蜡梅 CpAGL6 启动子的 PCR 扩增
Fig. 2 Amplification of CpAGL6 promoter
回收泳道 LAD3-2 中约 1 200 bp 的特异片
段，测序后与蜡梅 CpAGL6 基因进行同源性比
对，确认其为 CpAGL6 基因 5′侧翼序列。再以
蜡梅基因组 DNA 为模板，通过 PCR 扩增最终
获得 CpAGL6 基因启动子序列 1 266 bp（图 2），
并命名为 CpAGL6pro。
2.2 启动子序列分析及顺式作用元件预测
通过 PLANTCARE 对启动子 CpAGL6pro
进行分析，结果（表 2，图 3）显示，该启动子
具有 55 个 TATA-box，18 个 CAAT-box，还含
有提高转录水平顺式作用元件 5′UTR Py-rich stretch，蛋白结合位点 BoxⅢ，热应答元件 HSE，赤霉
素应答元件 P-box，低温顺式元件 LTR，胁迫相关应答元件 TC-rich repeats，多个光应答元件如
AE-box、ATC-motif、Box-4 等。

表 2 启动子调控区元件分析
Table 2 Cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequence
编号
No.
位点名称
Site name
数量
Amount
序列
Sequence
位点功能
Function of site
1 5′UTR Py-rich stretch 2 TTTCTTCTCT 提高转录水平 Improve the level of transcription
2 AAGAA-motif 4 GGTAAAGAAA，GAAAGAA
3 AC-I 2 (T/C)C(T/C)(C/T)ACC(T/C)ACC
4 AE-box 1 AGAAACAA 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
5 ARE 2 TGGTTT 厌氧诱导的必须顺式调控元件
Cis-regulatory elements necessary for anaerobic induction
6 ATC-motif 1 GCCAATCC 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
7 ATCT-motif 1 AATCTAATCC 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
8 Box-4 1 ATTAAT 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
9 BoxIII 2 CATTTACACT 蛋白结合位点 Protein binding sites
10 CAAT-box 18 CAATT/CAAT/CCAAT/CAAAT 启动子、增强子区域常见顺式作用元件
Common cis-acting elements of promoter and
enhancer regions
11 F-box 1 CTATTCTCATT
12 GATA-motif 1 GATAGGA 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
13 GT1-motif 2 GGTTAA 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
14 HSE 2 CNNGAANNTTCNNG/AAAAAATTTC 热应答元件 Thermally responsive element
15 I-box 1 GATATGG 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
16 LAMP-element 1 CTTTATCA 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
17 LTR 2 CCGAAA 低温顺式元件 Low cis-elements
18 P-box 1 CCTTTTG 赤霉素应答元件 GA response element
19 Sp1 1 CC(G/A)CCC 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
20 TATA-box 55 TATA（核心序列 Core sequence） 转录起始处是启动子核心元件
Transcription initiation is that the core promoter elements
21 TATCCAT/C-motif 1 TATCCAT
22 TC-rich repeats 1 ATTTTCTCCA 胁迫相关应答元件 Stress-related response element
23 TCT-motif 1 TCTTAC 部分光应答元件 Part of the light-responsive element
24 Unnamed-15 1 CCTCTCCCGTC
25 Unnamed-4 17 CTCC

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图 4 表达载体 pBI121-CpAGL6pro 的酶切验证
Fig. 4 The identification of pBI121-CpAGL6pro by
digesting with BamHⅠand HindⅢ

































图 3 CpAGL6pro 的序列分析
Fig. 3 Sequence analysis of CpAGL6pro
2.3 表达载体 pBI121-CpAGL6pro 成功构建
用 HindⅢ和 BamHⅠ对重组质粒进行酶切
鉴定，获得约 1 200 bp 的预期目的片段（图 4），
证明该启动子片段已经正确插入 pBI121 载体
中，表达载体 pBI121-CpAGL6pro 构建成功。
2.4 瞬时表达技术检测启动子的活性
转 CaMV35S 启动子和转化 pBI121-
CpAGL6pro 的烟草叶片经 GUS 组织化学染色
后均有蓝色斑点呈现，而阴性对照没有呈现出
蓝色斑点（图 5），表明所克隆的 CpAGL6 基因
的启动子能够驱动下游 GUS 报告基因表达。
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图 6 转基因烟草的 PCR 检测
CK+：质粒；CK-：野生型烟草；1 ~ 8：转基因烟草。
Fig. 6 The identifiction of transgenic tobacco plants by PCR
CK+：CpAGL6pro plasmid；CK-：Wild tobacco；
1–8：Transgenic tobacco plants.

图 5 CpAGL6pro 的瞬时活性检测
Fig. 5 Detection of transient expression of CpAGL6pro

2.5 转基因烟草的 PCR 检测
选取 8 株健壮的卡那霉素抗性转基因烟草
植株进行 PCR 检测（图 6），均扩增出与阳
性对照大小一致的特异片段，而野生型烟草
DNA 未扩增出任何片段，说明成功得到了转
化 CpAGL6 启动子,将其命名为 pBI121-
CpAGL6。
2.6 转基因烟草各组织 GUS 组织化学染色
GUS 活性组织化学染色结果（图 7）表明，野生型烟草各组织均无蓝色斑点；转 CaMV35S 启
动子烟草各组织均检测到蓝色斑点；而在转 pBI121-CpAGL6 启动子烟草的花瓣、雌蕊、茎、叶均检
测到蓝色斑点，其中茎上蓝色斑点着色最深，根部几乎检测不到蓝色斑点，而雄蕊中则完全检测不
到蓝色斑点，说明转 pBI121-CpAGL6 启动子烟草的花瓣、雌蕊、茎和叶均具有 GUS 活性，在茎中
的 GUS 活性表达量最强。


图 7 CpAGL6 启动子烟草 GUS 组织化学染色
Fig. 7 Characterization of GUS reporter gene expression under the control of the CpAGL6 promoter and
35S promoter in transgenic tobacco plants
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图 10 不同胁迫和诱导处理后的转基因烟草 GUS 酶的活性
Fig. 10 Quantitative detection of GUS enzyme activity of
hormone-treated and stress-treated transgenic tobacco
2.7 转基因烟草 GUS 酶活性检测
为了进一步精确地分析转基因烟草中 GUS 报告基因的表达差异，对 GUS 酶活性进行定量测定。
结果（图 8）显示，阴性对照烟草各组织中几乎检测不到 GUS 酶活性；转基因烟草不同组织之间
GUS 酶活力差异显著，茎中最高，其次是花，根中最低，几乎检测不到，同阳性对照烟草各组织的
GUS 酶活性表达强度规律一致。这些结果与 GUS 组织化学染色结果一致。
由图 9 可见，转 pBI121-CpAGL6 启动子烟草在不同花期的完整花 GUS 酶活性在 80.89 ~ 284.93
pmol · mg-1 · min-1 之间，在初开期最高，现蕾期最低，GUS 酶活性表达强度依次为：初开、含蕾、
盛开、衰老、现蕾。

图 8 转基因烟草各组织中 GUS 酶的活性 图 9 转基因烟草不同花期完整花 GUS 酶的活性
Fig. 8 Quantitative detection of GUS enzyme activity Fig. 9 Quantitative detection of GUS enzyme activity
in different tissue of transgenic tobacco in different florescence of full flower


为了研究启动子对不同诱导的响应，结合
启动子顺式作用调控元件的预测，用 GA3、低
温和黑暗处理烟草苗，3 d后分别对其进行GUS
酶活性测定（图 10）。
在非转基因植株中，各处理前后 GUS 酶活
性均几乎为 0；转 pBI121-CpAGL6 启动子植株
经 70 μmol · L-1 GA3 处理后，其活性是处理前
的 2.7 倍，经 4 ℃低温和黑暗处理后其活性分
别是原来的 3.2 和 2.0 倍；而阳性对照各处理
前后变化均不大。由以上结果可以推测蜡梅
CpAGL6 基因启动子活性受赤霉素、低温和黑
暗条件诱导。
3 讨论
MADS-box 基因参与花发育各个阶段的调节过程，最重要的功能是参与花形态建成和对开花时
间的调节（Kaufmann et al.，2005），如 MADS-box 基因 FLC、VRN1、OS2 和 SOC1 参与拟南芥、小
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麦和大麦开花时间的调节（Seo et al.，2009）；SEP3 和 AP1 在花器官形成上具有调控功能（Liljegren
et al.，1999；Ferrario et al.，2003）。Koo 等（2010）研究发现拟南芥 AGL6 在四轮花器官、苞叶和
胚珠的原基表达，都局限于近轴一侧，并指出 AGL6 是通过抑制成花阻揭物的功能来调控开花时间，
而不是通过激活成花激活物。这一特征与 AP1 和 SEP 类其他花器官特征基因有明显的区别。由此
推测 AGL6 与 AP1 和 SEP 类可能有不同的功能。AGL6 在植物开花信号转导途径中的位置仍不清楚。
目前对 AGL6 的研究集中在对其结构、功能、进化分析和同源基因的克隆等方面，具体的表达调控
模式还不清楚。启动子的研究对其基因的表达调控具有重要作用。
启动子驱动基因的表达需要多个顺式调控元件，这些元件的种类和数量以及彼此之间的顺序、
距离，都可能影响基因能否转录及转录的程度（付永平 等，2009）。CpAGL6 启动子生物信息学分
析发现，该启动子序列中富含 A/T 序列，Stalberg 等（1996）认为富含 AT 的区段大多是与转录因子
结合的部位,可以调控下游基因的高效表达。CpAGL6 启动子序列中除含基本的启动元件及大量的与
增强转录效率有关的 CAAT 和 RNA 聚合酶Ⅱ结合位点 TATA 盒外，还含有 1 个赤霉素响应元件，
推测 CpAGL6 的表达受赤霉素诱导；1 个低温响应元件，暗示能调控蜡梅在寒冬季节开花；多个光
应答元件等，可能与蜡梅在短日照条件下生长相关。
组织化学染色结果显示，CpAGL6 启动子能驱动 GUS 基因在烟草的茎、花、叶中表达，且表达
强度依次减弱，但在根中几乎无表达，说明其在绿色组织和花器官中的表达较强，不具备组织特异
性。印证了 AGL6 虽是花相关基因，但也表达于营养器官（王珍华 等，2012）。Viaene 等（2010）
也证明了双子叶植物中的 AGL6 家族不仅在生殖结构中表达，还与嫩枝的发育转变相关。Wang 等
（2011）对蜡梅不同组织和不同时期花芽进行 Real-time PCR 定量分析表明，CpAGL6 主要在蜡梅花
瓣、雌蕊和叶片中表达，且在花瓣中的表达量远远高于其他组织，但不能在根、茎和雄蕊中表达；
其在蜡梅单花开放过程中的表现呈连续波动态模式，先升高后降低。该研究结果与本研究中转基因
烟草不同花期 GUS 的表达模式基本一致，推测 CpAGL6 启动子能够通过控制 CpAGL6 来控制蜡梅
的开花过程。不同之处是，CpAGL6 在蜡梅花瓣中的表达量最高，在茎中不能检测到，而本研究中
烟草茎中的 GUS 酶活性最高，花次之。推测其原因是 CpAGL6 来自蜡梅基因组，而蜡梅与烟草存
在木本植物与草本植物的区别，器官组织结构存在差异，二者的基因上游调控序列有所差异，启动
子的效率和作用部位也存在差异。
了解激素诱导和环境变化对启动子的影响在园林植物的转基因研究中有重要的作用。Katahata
等（2014）发现柳杉的 AGL6 在赤霉素诱导处理 1 个月后表达量显著增加，而在本研究中，也发现
蜡梅 AGL6 启动子元件中含有赤霉素响应元件 P-box，进一步对转基因烟草进行赤霉素处理后发现，
蜡梅 AGL6 启动子驱动 GUS 的表达量增强，其酶活性是处理前的 2.7 倍，进一步表明 AGL6 的表达
受赤霉素调控。此外，CpAGL6 启动子序列中还含有低温顺式元件 LTR，LTR 存在于应答低温诱导
的启动子中，对其胁迫下的基因表达起调控作用（Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki，2006），Jiang
等（1996）证实了 LTR 核心元件（CCGAC）对低温诱导下调控甘蓝型油菜 BN115 基因的表达是必
要的。本研究中转基因植株经低温处理后，GUS 酶活性是原来的 3.2 倍，表明 CpAGL6 启动子在低
温诱导下能使报告基因的启动活性增强，并可能通过这一途径调控 AGL6 响应低温胁迫。
后续研究将构建该启动子的系列缺失序列，分析不同缺失启动子片段诱导表达活性的强弱，从
而确定启动子序列中重要的顺式调控元件，精确地分析和了解启动子的表达调控特点，以便更深入
地研究蜡梅花器官发育的分子机理。

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