全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2291–2298.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0464；http：//www. ahs. ac. cn 2291
收稿日期：2015–08–11；修回日期：2015–10–31
基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2012CM020）；山东省高等学校科技计划项目（J03I51；J13LF11）
* E-mail：lianyuji@lyu.edu.cn
朝鲜白头翁不定根分生结节形态学和解剖学观
察
廉玉姬 1,*，赵小梅 1，林光哲 1，刘 林 2，曲元刚 1
（1 临沂大学生命科学学院，山东临沂 276005；2 临沂大学药学院，山东临沂 276005）
摘 要：以朝鲜白头翁幼嫩叶片诱导产生的不定根为材料诱导分生结节。采取 Epon 812 树脂和石蜡
包埋切片技术分别对诱导初期的单个分生结节和培养 5 ~ 6 周的组织进行组织切片研究。结果显示：（1）
不定根在诱导培养基上分化形成独立的表面光滑的球形分生结节。（2）单个分生结节顶端为 3 ~ 4 层分生
细胞，其表皮和皮层上也观察到分生细胞。（3）分生结节分化后，结构上存在两种类型，一种为由分生
细胞、维管束、薄壁细胞和分化形成的小芽原基组成的结构，芽原基基部由排列整齐的表皮细胞组成，
不定芽之间结合较松散，与母体结合不紧密，易脱离，为独立的个体；另一种结构由排列规则的表皮细
胞环绕而成，其表皮细胞上广泛分布染色较深的球形、椭圆形或心形的体细胞胚状体，整个结构细胞大
小一致，无内部结构。结果证实，朝鲜白头翁不定根来源的分生结节上同时发生器官分化和直接体细胞
胚分化，分生结节也可分化形成胚性愈伤组织，通过愈伤组织间接再生体细胞胚。
关键词：朝鲜白头翁；不定根；分生结节；器官分化；体细胞胚；组织解剖
中图分类号：S 576 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2291-08

Morphological and Histological Examination of Meristematic Nodules from
Adventitious Root of Pulsatilla koreana
LIAN Yu-ji1,*，ZHAO Xiao-mei1，LIN Guang-zhe1，LIU Lin2，and QU Yuan-gang1
（1College of Life Sciences，Linyi University，Linyi，Shandong 276005，China；2School of Pharmaceutical Sciences，
Linyi University，Linyi，Shandong 276005，China）
Abstract：In order to investigate the in vitro morphologic pathway of meristematic nodules from
adventitious root of Pulsatilla koreana Nakai，young leaves were used as materials to induce adventitious
root，then meristematic nodules were induced using adventitious roots. Top of the early stage of
meristematic nodule consisted of 3–4 meristematic cells，small and deeply stained small cells were widely
distributed at epidermal layers and cortex. Two kinds of tissue type were observed at paraffin section，one
type tissue with meristematic cell，vascular component，parenchymatous cells，leaf primordia and shoot
apex. The other type tissue consisted of parenchymatous cells were surrounded by regularly arranged
epidermal layers. Globular，heart，oval stage somatic embryo were widely distributed on the surface of
tissue. Finally，shoot organogenesis and somatic embryogenesis were developed from meristematic nodules.

Lian Yu-ji，Zhao Xiao-mei，Lin Guang-zhe，Liu Lin，Qu Yuan-gang.
Morphological and histological examination of meristematic nodules from adventitious root of Pulsatilla koreana.
2292 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2291–2298.
Key words：Pulsatilla koreana；adventitious root；meristematic nodule；organogenesis；somatic
embryogenesis；histological examination

朝鲜白头翁（Pulsatilla koreana Nakai）为多年生草本植物，属于毛茛科（Ranunculaceae）白头
翁属（Pulsatilla），主要分布于中国东北地区，俄罗斯、朝鲜、日本也有分布。其根入药，全草含三
萜皂苷，具镇静、抑制肿瘤、杀菌、杀精、预防艾滋病等功能（Kim et al.，2004），治疗老年性痴呆
效果显著（Bang et al.，2005），此外，朝鲜白头翁还可作观赏花卉美化环境，可用于制造生物农药
和除草剂。朝鲜白头翁野生资源的匮乏已严重影响到中医临床用药及制药企业的生产，应用组织培
养技术缓解这一状况成为迫切需要。
植株离体再生，是指在一定条件下已分化的植物体细胞恢复分裂能力先形成愈伤组织，然后分
化出新的器官或胚，或者不经过愈伤组织而直接发育成新的器官或胚。愈伤组织是在人工培养基上
由外植体组织的增生细胞产生的一团无一定形态结构的排列疏松的薄壁细胞。然而，离体培养的植
物组织有时会进入一种特殊而稳定的球形结构时期，其外形上，是一种致密的球形细胞团，彼此独
立而又常聚生在一起，其内部结构至少包括分生细胞、细胞质浓的薄壁细胞和维管单元等 3 种类型
细胞，以及皮层和表皮两层组织。这种球形结构体称为分生结节（meristematic nodule），其在适宜
的条件下可直接再生形成芽、根、叶状体等植物器官（McCown et al.，1988；Salaj et al.，2005）。
目前在啤酒花（Batista et al.，2000）、杨树（Ferreira et al.，2009）、桉树（Warrag et al.，1991）、菊
苣（Piéron et al.，1998）及牡丹（秦磊 等，2012）等植物中诱导获得分生结节。
分生结节与体细胞胚外形高度相似，而在内部组织结构和发育过程上又各具鲜明特点。分生结
节可以直接再生体细胞胚（Ziv et al.，1994），或在培养过程中发生脱分化，产生胚性愈伤组织（Sané
et al.，2006；Cameron，2010）。也有在培养过程中同时发生分生结节、体细胞胚和器官分化的情况
（McCown et al.，1988）。
在朝鲜白头翁的组织培养方面，相关研究工作者先后报道了以叶片、叶柄、根为外植体，通过
器官分化途径再生植株（Lee & Oh，1993；Yoon，1996；Jung et al.，2007；廉玉姬 等，2010；Lin
et al.，2011）；以顶端分生组织和花粉为材料诱导体细胞胚（Ko & Kim，2006，2008）；但有关朝鲜
白头翁分生结节途径再生植株的报道极少（廉玉姬 等，2013）。
本试验中以朝鲜白头翁幼嫩叶片诱导产生的不定根为外植体，诱导出分生结节，采取 Epon812
树脂包埋和石蜡切片技术对分生结节进行组织解剖学研究，探究朝鲜白头翁离体形态发生过程。
1 材料与方法　
1.1 材料及其不定根的诱导
试验在临沂大学生命科学学院细胞工程实验室进行。野生朝鲜白头翁采挖自吉林省和龙县东城
镇，整株移至花盆培养。2013 年 5 月，选取生长健康的朝鲜白头翁幼嫩叶片，切成 0.5 cm × 0.5 cm
的小块，用解剖刀割划 2 ~ 3 刀，接种到不定根诱导培养基。诱导培养基为 MS（Murashige & Skoog，
1962）培养基添加不同浓度（0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg · L-1）的萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，
NAA），30 g · L-1 糖，0.8%琼脂，pH 5.8。于（25 ± 1）℃，光照强度 4 000 μmol · m-2 · s-1，16 h · d-1
条件下培养。每处理接种 10 个外植体，定期观察，8 周后统计结果。试验重复 3 次。

廉玉姬，赵小梅，林光哲，刘 林，曲元刚.
朝鲜白头翁不定根分生结节形态学和解剖学观察.
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表 1 MS 培养基上添加不同浓度 NAA 处理对朝鲜白头翁
叶片外植体不定根诱导的影响
Table 1 Effect of NAA treatment on adventitious root induction
from leaf explants of P. koreana
NAA/
（mg · L-1）
不定根分化频率/%
Frequency of
adventitious root
formation
不定根数
Number of
adventitious
root
不定根长度/cm
Length of
adventitious
root
1 45.6 b 16.6 c 3.9 a
2 33.3 c 32.0 a 1.1 c
3 36.5 c 26.2 b 1.1 c
4 66.7 a 31.6 a 1.5 b
注：表中同一列中不同字母表示数据差异显著（P < 0.05）。
Note：Means followed by different letters indicate significant
difference at P < 0.05.
不定根诱导率（%）=（再生不定根外植体数/接种外植体数）× 100。
数据采用 SAS 软件进行方差分析和多重比较分析（Duncan’s 法）。
1.2 分生结节的诱导及组织解剖学观察
选用 MS 添加 1 mg · L-1 NAA 的培养基上诱导出的健康、结构紧密的不定根为材料诱导分生结
节。将不定根切成约 0.5 cm 长，接种到诱导培养基。培养基为：MS 培养基添加 0.5 mg · L-1 的玉米
素（Zeatin）和 0.05 mg · L-1 吲哚乙酸（IAA），30 g · L-1 糖，0.8%琼脂，pH 5.8。培养条件同上。
整个培养期间，每隔 7 d 在体视显微镜下观察分生结节形成的位置、体积大小和形态特征。
在解剖显微镜下用解剖刀切取培养 10 ~ 14 d 的单个球形结节，先用 2%戊二醛（50 mmol · L-1
磷酸缓冲液配制，pH 6.8）于 4 ℃下固定 4 h，再用 1% 四氧化锇（50 mmol · L-1 磷酸缓冲液配制，
pH 6.8）于 4 ℃下后固定 4 h，然后用浓度梯度 10%的上行系列乙醇脱水，Epon 812 树脂包埋，再
进行超薄切片，切片厚度为 70 nm，切片染色。
切取诱导培养 28 ~ 42 d 的分生结节，先用 FAA 溶液固定 48 h，依次进行冲水、媒染、染色、
脱水、透明、用石蜡包埋、切片、展片、脱蜡、封片等（廉玉姬 等，2013）。
将切片置于 Axioskop 40 生物显微镜下观察分生结节的横切面和纵切面的解剖结构，照相并记录。
2 结果与分析
2.1 不定根的诱导
MS培养基上添加不同浓度NAA对不定根
诱导影响不同。培养 7 d，幼嫩叶片的切割处开
始膨大，愈伤组织开始形成；培养 14 d，愈伤
组织上开始分化形成不定根。
观察发现，在添加 1 mg · L-1 NAA 的培养
基上，愈伤组织为淡绿色，其上分化形成的不
定根细而长，随着培养时间的增加，不定根上
逐渐形成许多侧根（图 1，A），其不定根诱导
率为 45.6%（表 1）。NAA 浓度为 2 和 3 mg · L-1
时，诱导形成的愈伤组织和不定根的形态无明
显差异，愈伤组织为白色，分化形成粗而短的
丛生根（图 1，B），不定根诱导率分别为 33.3%
和 36.5%。
在添加 4 mg · L-1 NAA 的培养基上形成的愈伤组织为白色，分化形成的不定根短而粗（图 1，C），
诱导率为 66.7%（表 1）。不定根数调查结果显示，NAA 浓度为 1 和 4 mg · L-1 时，诱导形成的不定
根的数量最多；NAA 浓度为 1 mg · L-1 时，侧根长度最长（表 1）。
MS 添加 1 mg · L-1 NAA 的培养基诱导形成的不定根，结构紧密，健康结实。其他处理诱导产
生的不定根，结构松散、基部附带愈伤组织。因此，选用 MS 添加 1 mg · L-1 NAA 的培养基上诱导
的不定根为材料诱导分生结节。


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图 1 朝鲜白头翁不定根的诱导
Fig. 1 Adventitious root formation from leaf explants of P. koreana Nakai
A：NAA 1 mg · L-1；B：NAA 3 mg · L-1；C：NAA 4 mg · L-1.

2.2 分生结节发育成小植株
不定根在分生结节诱导培养基上培养 7 ~ 10 d 时，切口处开始膨大，不定根的外表皮裂开；14 d
时，裂开处出现 1 ~ 2 个圆形的小突起，凸起表面光滑，与周围膨大的组织完全不同；培养 21 d 时，
外植体表面上形成数个淡绿色结构紧实致密的球形结节结构。这种结构在外观上与细胞排列疏松、
无定型状态的愈伤组织完全不同（图 2，A）。球形结节直接在外植体表面发生，其表面光滑，结节
之间界限清晰，各自独立，生长快。球形结节分化形成的丛生不定芽之间连接较松散，易分散脱落
形成单个独立的个体，但无根。28 d 时，已发生丛生芽的外植体上有直接形成的带芽和根的完整的
小植物体（图 2，B）。35 ~ 42 d 时，褐变的分生结节表面上发现部分体细胞胚直接发生，与直接体
细胞胚的形成途径很相似（图 2，C）。48 d 时，有些分生结节分化形成浅黄色的易碎的愈伤组织，
愈伤组织表面广泛分布体细胞胚状体和体细胞胚萌发形成的丛生小植物体（图 2，D）。这些结果表
明，朝鲜白头翁不定根来源的分生结节不仅分化形成不定芽，而且经过脱分化可形成胚性愈伤组织，
进而形成体细胞胚。



图 2 不定根来源分生结节分化与植株再生
A：不定根来源的分生结节；B：分生结节分化形成的不定芽与直接形成的带芽和根的小植物体（红色箭头）；
C：褐变的分生结节上发生的体细胞胚；D：健康的小植物体。
Fig. 2 Meristematic nodule formation and plant regeneration of P. koreana Nakai
A：Meristematic nodules were induced from adventitious root on MS supplemented with zeatin and IAA；B：Adventitious shoot and
somatic embryo derived plantlets（red arrow：Plantlets derived from meristematic nodules）；
C：Somatic embryo and matured plantlets developed from browned tissue；
D：Health and matured plantlets developed from somatic embryo.

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2.3 组织解剖学的观察
2.3.1 分生结节 Epon 812树脂切片的组织解剖结构
培养 10 d 的分生结节 Epon 812 树脂横切面显示，分生结节外层为染色较深，排列规则的表皮
细胞，中心由细胞质浓密的分生细胞组成（图 3，A）。分生结节的纵向切片显示，分生结节的顶部


图 3 朝鲜白头翁分生结节发育过程组织解剖结构
A：分生结节横切结构；B：分生结节纵切结构；C：分生结节顶部纵切结构；D ~ F：分生结节纵切局部放大结构（红色箭头表示分生细胞）；
G：分生结节横切结构上的维管系统（红色箭头示原形成层细胞和管胞）；H、I：分生结节的维管系统、管胞和形成层细胞（红色箭头
示前形成层、维管束和形成层）；J：垂周分裂小细胞形成的前形成层细胞（红色箭头示前形成层细胞）；K：分生结节上分化的两种
不同的组织结构（红色箭头）；L：正在芽分化的分生结节，有明显的内部结构（红色箭头示维管组织和管胞）；M：分生结节
形成并脱落的不定芽；N、O：分生结节上分化的体细胞胚状体（红色箭头示球形、心形、鱼雷形胚）。
Fig. 3 Histological analysis of meristematic nodules from adventitious root explants of P. koreana
A：The cross section of meristematic nodules embedded by Epon 812；B：The longitudinal section of of meristematic nodules embedded by Epon
812；C：The longitudinal section of top meristematic nodules；D–F：Amplified longitudinal section of meristematic nodules（red arrow：Meristematic
cells）；G：Section of individual nodule after embedding by embed by Epon 812，showed pre-procambial cells and tracheids elements（red arrows）；
H，I：Section of individual nodule showed vascular bundle，tracheids elements and cambial cell（red arrows）；J：Pre-procambial
cells from anticlinal cell divisions；K：Two types（red arrows）section structure of meristematic nodules；L：Shoot formation with
vascular tissue and tracheid（red arrow）；M：Adventitious shoot separated itself from meristematic nodules；
N，O：Globular，heart and torpedo shaped of somatic embryo（red arrow）.
Lian Yu-ji，Zhao Xiao-mei，Lin Guang-zhe，Liu Lin，Qu Yuan-gang.
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由 3 ~ 4 层体积较小，细胞壁薄，排列紧密，细胞质浓密的分生细胞组成（图 3，B）；其下方为体积
较大，形状不规则，染色较浅，高度液泡化的薄壁细胞（图 3，C）；在分生结节其他位置还观察到
分裂旺盛的细胞（图 3，D），这些细胞分别位于皮层（图 3，E）和表皮上（图 3，F）。分生结节的
内部出现早期的维管系统，包括沿垂周方向进行分裂的原形成层细胞和管胞（图 3，G）。培养 14 d
的分生结节纵切显示，分生结节是由薄壁细胞环绕形成的球形结构，其内部具有丰富的维管系统和
管胞（图 3，H），以及细胞质浓密、排列规则的形成层细胞（图 3，I）。
2.3.2 分生结节石蜡切片的组织解剖结构
石蜡切片显示，培养 28 d 的分生结节中有形成层，其中心处分布着垂周分裂的小细胞（图 3，
J）。培养 35 ~ 42 d 的分生结节上同时有两种结构（图 3，K）。一种结构，其内部细胞大，高度液泡
化，有维管束、管胞等内部结构（图 3，L），其外周为细胞小且大小一致，染色较深的分生细胞，
有些已分化形成带芽原基的分生组织，芽原基基部由排列整齐的表皮细胞组成，与母体无输导组织
相连，为独立的个体（图 3，M）。另一种结构，细胞大小基本一致，无内部结构，外周表皮细胞明
显，细胞排列规则，表面广泛分布染色深、细胞较小且大小一致的球形、心形和鱼雷形胚性细胞团
（图 3，N），表皮下方的细胞液泡化明显，其内部未观察到维管组织（图 3，O），这与体细胞胚的
组织解剖结构特征相一致。
3 讨论
有关分生结节器官分化和体细胞胚分化的研究，多以茎段、叶片和叶柄为材料（McCown et al.，
1988；Piéron et al.，1998；Fortes & Pais，2000；Haensch，2005；Kongbangkerd et al.，2005；Ferreira
et al.，2009；Moyo et al.，2009），尚无以不定根为材料诱导分生结节，进行器官分化和体细胞胚发
生的相关研究。廉玉姬等（2013）以朝鲜白头翁的叶柄为材料，利用玉米素组合吲哚乙酸，通过愈
伤组织和直接发生途径获得了具有器官分化能力的分生结节，但未发现体细胞胚。本试验中以不定
根为材料，诱导出分生结节，成功获得了朝鲜白头翁器官分化和体细胞胚分化的再生植株。叶柄来
源的分生结节由外植体直接发生或经过愈伤组织间接发生，而不定根来源的分生结节由外植体直接
发生，两种外植体来源的分生结节的发生途径基本相似。
胡杨叶片分生结节发生过程经过外植体维管形成层细胞的平周分裂、皮层薄壁细胞分裂形成愈
伤组织、叶片表皮破裂、由 4 ~ 6 层分生细胞层包围的组织中心形成等 4 个过程（Ferreira et al.，2009）。
朝鲜白头翁不定根来源的分生结节的发生包括外植体的膨大、外表皮的破裂、皮层薄壁细胞分裂形
成分生细胞，由 4 ~ 5 层分生细胞层包围的组织中心形成，进而形成分生结节。这个结果与啤酒花
节间分生结节发生途径（Fortes & Pais，2000）相似。
结构上，源于朝鲜白头翁不定根外植体的早期球形结构的外层表皮和皮层细胞明显；结节顶部
是由 4 ~ 5 层细胞核大、染色深、细胞质浓密、分裂旺盛的分生细胞组成；球形结节皮层和表皮上
也观察到同样细胞核大、染色深和细胞质浓密的细胞；在球形结节内部观察到原形成层细胞和管胞
等维管系统。这与 McCown 等（1988）的结果一致，表明这些球形结节为典型的分生结节，且早期
就有维管系统的发生，解释了大部分分生结节发生器官分化，极少发生体细胞胚分化的原因。
来源上，分生结节多源于皮层细胞，而体细胞胚常来源于外植体的表皮细胞或胚性愈伤组织表
面的细胞（Haensch，2005；Salaj et al.，2005；钟原 等，2011）；植株再生方面，分生结节通常经
过器官发生途径再生植株，分化方向多为单极性，而体细胞胚分化方向为双极性（McCown et al.，
廉玉姬，赵小梅，林光哲，刘 林，曲元刚.
朝鲜白头翁不定根分生结节形态学和解剖学观察.
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1988）。本试验中早期分生结节的表皮上发现染色深、胞质浓密的分生细胞，在这种结构进一步分化
形成体细胞胚。分生结节石蜡切片观察不仅发现分生细胞、维管束系统、薄壁细胞和分化的芽原基，
而且观察到由排列整齐的表皮细胞环绕的，大小一致、染色深、无内部结构、液泡化程度低的小细
胞构成的椭圆形、球形和鱼雷形的致密实体。这表明分生结节上同时发生了器官分化和体细胞胚分
化，且这种体细胞胚分化由分生结节脱分化形成胚性愈伤组织，经胚性愈伤组织间接形成体细胞胚，
这与印度娃儿藤（Tylophora indica）和西班牙柏木的研究结果（Chaudhuri et al.，2004；Cameron，
2010）相似。
通过组织学切片观察到不定芽芽原基基部由排列整齐的表皮细胞组成，内部无维管束等与母体
相连，不定芽之间结合较松散，与母体结合不紧密，易脱离，为独立的个体。与此不同，菊苣、啤
酒花、杨树等植物（Piéron et al.，1998；Batista et al.，2000；Ferreira et al.，2009）的分生结节分化
形成的丛生不定芽与分生结节结合紧密，通过维管束等相连。
试验以不定根为材料成功诱导出分生结节，建立了朝鲜白头翁的再生体系；发现分生结节上同
时发生器官分化和直接体细胞胚分化，且发现体细胞胚还可以间接途径在分生结节上发生；研究发
现，芽原基基部由排列整齐的表皮细胞组成，内部无维管束等与母体相连，不定芽之间结合较松散，
与母体结合不紧密，易脱离，为独立的个体。

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