全 文 ：园艺学报，2015，42 (8)：1591–1598.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0058；http：//www. ahs. ac. cn 1591
收稿日期：2015–05–27；修回日期：2015–07–30
基金项目：北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20140202）；北京市科技计划项目（D151100004515003）；国家自然科学基
金项目（31471881）
* 对本文同等贡献
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yaolei@baafs.net.cn）
番茄黄化曲叶病毒基因间区缺失突变体在北京
的发现与证实
赵宇楠 1,*，程晓龙 1,2,*，赵萍萍 2，陈亚萍 2，芦 佳 2，李常保 3，姚 磊 2,**
（1 沈阳工业大学电气工程学院，沈阳 110870；2 北京市农林科学院农业生物技术研究中心，农业基因资源与生物技
术北京市重点实验室，北京 100097；3北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）
摘 要：在北京发现两种致病性有差异的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）
毒株，得到两个不同的 TYLCV 分离物 BJ03 和 BJ04，并对它们进行了全长扩增测序。TYLCV-BJ03 全长
为 2 781 bp，TYLCV-BJ04 全长为 2 740 bp。进化树分析显示，这两个毒株分别属于以色列株系 TYLCV-IL
进化分支下中国的两个不同亚群。二者核酸序列的同源性为 99.15%，主要差异在基因间区（intergenic
region，IR）。BJ04 比 BJ03 的 IR 区在互补链方向 TATA-box 与保守的 9 核苷酸序列之间缺失 41 个碱基。
通过针对缺失片段设计的特异引物验证，进一步证实了 TYLCV 的 IR 区缺失突变体的存在。在对温室中
不同发病番茄样本的检测中，同时检测到被两种毒株单独侵染和复合侵染的植株。
关键词：番茄；番茄黄化曲叶病毒；基因间区；序列缺失
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）08-1591-08

Identificate Intergenic Region Deletion of Tomato yellow leaf curl virus
Isolated from Beijing
ZHAO Yu-nan1,*，CHENG Xiao-long1,2,*，ZHAO Ping-ping2，CHEN Ya-ping2，LU Jia2，LI Chang-bao3，
and YAO Lei2,**
（1School of Electrical Engineering，Shenyang University of Technology，Shenyang 110870，China；2Beijing Agro-
Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry，Beijing Key Laboratory of Agricultural
Genetic Resources and Biotechnology，Beijing 100097，China；3Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of
Agriculture and Forestry，Beijing 100097，China）
Abstract：Two distinct pathogenicity Tomato yellow leaf curl virus isolates from the greenhouse of
Beijing were observed，termed BJ03 and BJ04 respectively. The full long genomic sequences of these two
TYLCV isolates were sequenced；TYLCV-BJ03 is 2 781 bp，and TYLCV-BJ04 is 2 740 bp. The molecule
evolution reveals that these two isolates belong to two different Chinese group of a recent evolution branch
of Israel strain TYLCY-IL. They shared 99.15% nt identity. The main difference between these two isolates
is the intergenic region（IR）. The BJ04 isolate contained a 41-nt deletion in the intergenic region between

Zhao Yu-nan，Cheng Xiao-long，Zhao Ping-ping，Chen Ya-ping，Lu Jia，Li Chang-bao，Yao Lei.
Identificate intergenic region deletion of Tomato yellow leaf curl virus isolated from Beijing.
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the TATA-box and the nonanucleotide motif. This IR deletion mutant of TYLCY was confirmed by
specific primers designed for the deleted region. In the further inspections，the single infected and combine
infected samples were detected.
Key words：tomato；Tomato yellow leaf curl virus；intergenic region；sequence deletion

自 20 世纪 40 年代番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）首次在以色列发
现以来（Picó et al.，1996），迅速扩散到世界各地。目前在非洲、欧洲、大洋洲、中东地区、东南亚
地区、东北亚地区、中美洲、北美洲等地均有发生（Boulton，2003；Varma & Malathi，2003）。在
中国自 2006 年上海大面积暴发 TYLCV 以来（Wu et al.，2006），该病已在中国华东、华南、华北、
华中、西北、西南、东北以及台湾地区等地迅速蔓延（吴篆芳 等，2013）。该病害的主要症状表现
为：叶片边缘呈现鲜黄色、卷曲，叶脉墨绿，叶肉变厚，叶片变小；植株矮化萎缩，开花延迟，果
实减少，产量损失严重。
TYLCV 属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是一类具有环
状单链 DNA 基因组的植物病毒，被特有的孪生等距颗粒状衣壳包裹（Cohen & Nitzrmy，1966；
Harrison et al.，1977；Kurstak，1981）。TYLCV 仅含有一个类似 DNA-A 的组分，病毒链编码的蛋
白为 AV1 和 AV2。AV1 为外壳蛋白，与病毒的包壳、介体传播及寄主互作密切相关（Harrison &
Robinson，2002）。AV2 与病毒移动有关（Rojas et al.，2001）。TYLCV 的互补链编码的蛋白为 AC1、
AC2、AC3 和 AC4。AC1 负责病毒的复制起始（Harrison & Robinson，2002）；AC2 参与基因的转
录激活（Sunter & Bisaro，1997）；AC3 为复制增强蛋白，调节 AC1 的复制量（Harrison & Robinson，
2002）；AC4 编码一种致病因子，引起植物发育异常，同时也可作为植物基因沉默的抑制因子，能
结合并且可能抑制成熟的 miRNAs，从而阻碍 miRNA 介导的对正常目标 mRNAs 的调节，导致植物
发育缺陷（Etessami et al.，1991；Chellappan et al.，2005）。双生病毒基因组的转录是通过位于病毒
链开放阅读框（ORF）和互补链 ORF 之间启动子区进行的。该启动子区能控制两个方向的转录，为
双向启动子。TYLCV 转录起始信号位于基因间隔区（intergenic region，IR 区），相当于其它双组分
粉虱传双生病毒基因组的共同区（Kheyr-Pour et al.，1991）。
目前对 TYLCV 的研究已经很多，但对 IR 区缺失的突变体鲜有报道。在 GenBank 中从中国发
现的 TYLCV 已经登录了 100 多个毒株的全长序列，虽然有个别毒株的 IR 区存在几个碱基缺失的差
异，但未见 IR 区大片段缺失的毒株。作者在北京地区发现了 IR 区缺失 41 个碱基的 TYLCV 毒株，
并通过 PCR 验证，进一步证实其为 TYLCV 的 IR 区缺失突变体。
1 材料与方法
1.1 材料
感病的番茄材料 M82 的病叶采自北京市农林科学院生物技术研究中心的玻璃温室。
高保真酶 Phusion DNA Polymerase 购自 Thermo 公司。Easy Taq 酶购自康为世纪生物科技有限
公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR 纯化试剂盒购自博迈德生物技术公司。T4 连接酶购自
Promega 公司。引物合成由擎科新业生物技术有限公司完成，测序由奥美德诺基因科技有限公司完
成。pBluescript 载体和 DH5α 菌株由本实验室保存。
赵宇楠，程晓龙，赵萍萍，陈亚萍，芦 佳，李常保，姚 磊.
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1.2 方法
1.2.1 样品制备
取 100 ~ 150 g 番茄幼嫩叶片，采用小量快速提取方法（曾钢 等，2012），提取番茄基因组 DNA
与病毒的混合物，溶解于 30 µL 无菌去离子水中备用。
1.2.2 引物设计
根据 GenBank 登录的 TYLCV 序列，设计两对反向引物 P1F/P1R 和 P2F/P2R 用于扩增 TYLCV
全长（芦佳 等，2014）；其中引物 P2F/P2R 跨越基因间隔区。
根据发现的 IR 区缺失区域设计特异引物 IRdF/IRdR、IRdF68-146、IRF68-97。引物 IRdF/IRdR
反向互补，位于缺失区域，并可分别与 P2R/P2F 构成引物对，其只能扩增正常病毒的片段，不能扩
增缺失体。引物 IRdF68-146 用于检测缺失体的存在，不能扩增正常病毒的片段；其横跨缺失区域两
端，与缺失体完全吻合，在 3′ 端仅有 8 个碱基与正常病毒跨越缺失片段的另一端序列匹配（表 1 中
引物序列小写部分）。引物 IRF68-97 用于检测正常长度的病毒，不能扩增缺失体；其与正常长度的
病毒序列完全吻合，与缺失体在 3′ 端有 4 个碱基不匹配（表 1 中引物序列小写部分）。

表 1 研究中所用引物序列
Table 1 The primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
The sequence of primer
P1F CCCAAGCTTATGTGGGATCCACTTCTAAATGAATTTCC
P1R CGGGGTACCGCCATTAGGTGTCCAGGTATAAGTAAGAC
P2F GGGGTACCTTAGAGAGAGAACAATTGGGATATGTTAGGAA
P2R CCCAAGCTTATATCGCCTGGTCGCTTCGACATAGTCAC
IRdF AAAGTACATTGCAATTCAAAATTCAAAATTCAAAA
IRdR TTTTGAATTTTGAATTTTGAATTGCAATGTACTTT
IRdF68-146 GACACCTAATGGCTATTTGGTAATTTTGTAtcattaaa
IRF68-97 GACACCTAATGGCTATTTGGTAATTTTGTAaaag
注：序列下划线部分为 KpnⅠ和 Hind Ⅲ酶切位点。
Note：The underline of the sequences indicate the cleave sites of restriction enzymes KpnⅠand Hind Ⅲ.

1.2.3 目的片段的扩增
将提取的 DNA 混合物用水稀释 20 倍，取 1 µL 作为 PCR 扩增的模板。用 Taq 酶扩增，PCR 反
应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 7 min。用高保
真酶 Phusion 扩增，反应条件为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/15 s ~ 30 s，35
个循环；72 ℃ 5 min。
PCR 扩增产物经琼脂糖电泳回收后用 KpnⅠ和 Hind Ⅲ双酶切，与 pBluescript 载体连接后热激
转化大肠杆菌。提取菌落 PCR 阳性克隆的质粒 DNA 进行测序。
1.2.4 序列拼接与分析
测序结果中有差异的碱基至少经过 3 个独立的克隆进行比对确认。最后将正确测序结果用软件
DNA Start 的 SeqMan 拼接，获得病毒样品的 DNA-A 全长序列。
根据文献（芦佳 等，2014）选取 32 个 TYLCV 代表株系，用 MEGA5.0 进行多序列比较和 NJ
法系统进化树分析。
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图 2 引物对 P2F/P2R 扩增结果
M：BM5000 DNA 分子量标记；1：健康株；2：TYLCV-BJ03；
3：TYLCV-BJ04；4 ~ 6：复合侵染样本。
Fig. 2 The PCR results of primer pair P2F/P2R
M：BM5000 DNA marker；1：Uninfected plant；2：TYLCV-BJ03；
3：TYLCV-BJ04；4–6：Combine infected samples.
2 结果与分析
2.1 感病番茄症状
2014 年 6 月，在北京市农林科学院生物技术研究中心玻璃温室内发现种植的约 100 株番茄发生
黄化曲叶病毒病。植株发病前期（约 2 ~ 3 周）表现出两种不同的症状，约各占一半。其中一种病
情相对较轻，新叶相对舒展，但相对于正常植株成熟叶片，叶色稍显泛黄，且叶脉明显；另一种病
情较重，成熟叶片面积变小，边缘泛黄，叶脉明显，新叶明显黄化，且成簇缩状（图 1）。推测这两
种症状是由两种不同病毒毒株侵染所致，将致病毒株分别命名为 BJ03 和 BJ04。因没有隔离，发病
后期病情较重，两者混杂，区别不明显。将该温室以外未受侵染的番茄幼苗移入该温室，幼苗很快
被传染。新被感染的幼苗发病前期又表现出上述两种不同类型的症状，后期随着苗龄的增长，症状
又趋于一致。

图 1 TYLCV 两个不同毒株侵染番茄后的病症表现
Fig. 1 Symptoms induced by different TYLCV isolates in tomato plants
2.2 PCR 检测结果
随机抽取了 38 株病株，提取病叶基因组
DNA。以分离物的 DNA 混合物为模板，用
P2F/P2R 扩增检测，结果抽取的样本全部为阳
性。通过观察电泳结果，发现 BJ03 和 BJ04 症
状对应的样品间 P2F/P2R 扩增产物大小存在细
微差异（图 2）。BJ03 分离物扩增到 564 bp 目
的条带，而 BJ04 分离物扩增到一条小于 564 bp
的条带。选取两份带型稍大的 PCR 产物和 10
份带型稍小的 PCR 产物进行测序。测序的 12
份材料中，两份稍大产物序列一致，为一毒株，
与正常 TYLCV 序列的 IR 区长度吻合；10 份
稍小产物序列一致，为另一毒株，该毒株的 IR
区缺失 41 个碱基。用引物对 P1F/P1R 扩增，两种症状的分离物均扩增到相同长度为 2 458 bp 的片
段。在后续对温室中另外 40 株不同发病番茄样本的继续检测中，同时找到了被两种毒株单独侵染和
复合侵染的番茄植株（图 2）。在中后期多为复合侵染。
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图 3 引物对 P2F/ P2R、IRdF/P2R、IRdR/P2F 的
PCR 扩增结果
M：BM5000 DNA 分子量标记；1、4、7：TYLCV-BJ03；2、5、8：
TYLCV-BJ04；3、6、9：健康株。
Fig. 3 The PCR results of primer pairs P2F/P2R，
IRdF/P2R and IRdR/P2F
M：BM5000 DNA marker；1，4，7：TYLCV-BJ03；2，5，8：
TYLCV-BJ04；3，6，9：Uninfected plant.
2.3 病毒 IR 区缺失突变体的确认
为了防止上述结果是由 PCR 反应中非特
异性扩增引起，进一步确认病毒 IR 区缺失体的
存在，分别用引物对 IRdF/P2R、IRdR/P2F、
IRdF68-146/P2R和 IRF68-97/P2R对BJ03、BJ04
和复合侵染植株进行了检测。从图 3 可以看出，
用引物对 P2F/P2R 可以检测出 BJ03 的 564 bp
和 BJ04 的 523 bp 条带，说明第 2、5 和 8 泳道
的样本含有病毒 BJ04；而用引物对 IRdF/P2R
和 IRdR/P2F 可以检出 BJ03 的 399 bp 和 206 bp
条带，却检测不到 BJ04。
从图 4 可以看出，用引物对 IRF68-97/P2R
可以从BJ03和复合侵染的分离物中扩增出429
bp 的特异条带（图 4，A），而检测不到 BJ04；
而用引物对 IRdF68-146/P2R 可以从 BJ04 和复合侵染的分离物中扩增出 388 bp 的特异条带（图 4，B），
检测不到正常长度的 BJ03。结果说明新发现的 TYLCV-BJ04 的基因间隔区确实发生了缺失突变。



图 4 引物对 IRF68-97/P2R 和 IRdF68-146/P2R 的 PCR 扩增结果
M：100 bp DNA 分子量标记；1：健康株；2：TYLCV-BJ04；3：TYLCV-BJ03；4：复合侵染样本。
Fig. 4 The PCR results of primer pairs IRF68-97/P2R and IRdF68-146/P2R
M：100 bp DNA marker；1：Uninfected plant；2：TYLCV-BJ04；3：TYLCV-BJ03；4：Combine infected sample.

2.4 序列分析与系统进化树分析
引物 P1F/P1R 和 P2F/P2R 的 PCR 产物连接到 pBluescript 载体后测序。序列经拼接，TYLCV-BJ03
与大多数 TYLCV 毒株一样，全长为 2 781 bp（KT338293），IR 区为 313 bp。IR 区发生缺失的
TYLCV-BJ04 全长为 2 740 bp（KT338294），IR 区为 272 bp，有 41 bp 的缺失；参照全长 2 781 bp
序列，缺失序列位于 2 713 ~ 2 753 bp。TYLCV-BJ03 与 TYLCV-BJ04 的 IR 区除缺失的 41 个碱基外，
只有 1 个碱基有差异，IR 区同源性为 99.43%（表 2）。在非 IR 区两者有 21 个位点的碱基发生变化，
DNA-A 全长的同源性为 99.19%。两个毒株的基因在核酸水平和氨基酸水平存在差异。在氨基酸水
平同源性最高和最低的 AV2 和 AC2 分别为 100%和 95.56%。总体上看，两个毒株除了在 IR 区因缺
失有较大区别外，二者在编码区其它各基因差异不大。
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表 2 TYLCV-BJ03 与 TYLCV-BJ04 序列同源性比较
Table 2 The identities of sequence between TYLCV-BJ03 and YLCV-BJ04
基因组区段
Genomic region
核酸序列同源性/%
Identities of nucleotide
差异个数
Number
氨基酸序列同源性/%
Identities of protein
差异个数
Number
DNA-A 99.19 22 – –
IR 99.43 1 – –
AV2 99.72 1 100.00 0
AV1 99.61 3 99.61 1
AC1 99.07 10 98.32 6
AC2 98.04 8 95.56 6
AC3 98.02 8 96.27 5
AC4 98.98 3 96.91 3


以 TYLCV 不同分离物的全长序列建立进化树（图 5）。结果显示 TYLCV-BJ03 与 TYLCV-BJ04
分属中国的 CNⅡ和 CNⅠ亚群。两个亚群亲缘关系都很接近，属于以色列株系 TYLCV-IL（X15656）
进化下的一个近代分支。用非 IR 区序列建进化树分析，结果同上述用病毒全长序列分析的结果。


图 5 基于全长序列构建 TYLCV 分子进化树
Fig. 5 The phylogenic tree of TYLCV full long sequence
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3 讨论
对于双生病毒和 TYLCV 的研究报道很多。主要都是集中在对病毒各基因的功能研究。对 IR 区
研究相对较少。已有的研究表明，TYLCV 的 IR 区是病毒 dsDNA 复制唯一需要的元件，不需要其
它病毒基因参与（Gover et al.，2014）。TYLCV 的 CP（AV1）的突变或截断将影响其症状的显现（Wartig
et al.，1997；Peretz et al.，2007），而敲除 rep（AC1）将破坏滚环复制，使其不能产生 ssDNA（Peretz
et al.，2007）。关于 TYLCV 的 IR 区缺失曾有简要报道，但未对其致病性变化予以介绍（Idris et al.，
2007）。本研究中发现 IR 区缺失的突变体为中国首次报道，且可能与正常长度的毒株在致病性上存
在差异。虽然 TYLCV-BJ03 和 TYLCV-BJ04 分属中国不同亚群，但因毒株的亲缘关系都很接近，尤
其是对症状显现起关键作用的 AV1 二者同源性高达 99.61%，推测这两个毒株致病性的差异可能还
是因 IR 区缺失所引起。两个毒株的 AC1 的氨基酸序列的同源性也较高，达 98.32%，且在温室中都
可以通过粉虱扩散到新的植株；两个毒株可以同时侵染同一宿主，尤其在发病后期基本上都是复合
侵染，毒株间不存在相互排斥；该段 IR 区的缺失没有影响到 TYLCV 生活史中 ssDNA 的产生。双
生病毒 ACMV、CLCuMV、TYLCCNV 以及 TGMV 互补链方向比病毒链方向表现出更强的启动子
活性（Zhan et al.，1991；Haley et al.，1992；Eagle & Hanley-Bowdoin，1997；Xie et al.，2003；Xie
& zhou，2003）。该缺失片段位于互补链方向靠近基因起始的 TATA Box 与保守的 9 核苷酸序列
（nonanucleotide motif）之间。而互补链所编码的基因与病毒的复制、转录激活、植物基因沉默的
抑制因子密切相关。本研究中所发现的缺失位置与 Idris 等（2007）报道的缺失突变体的缺失位置基
本相近。推测该段序列可能包含某些负调控元件。自然界中病毒在自我进化过程中，为了适应环境
的变化，自行删除了该段序列，使得病毒活性增强，致使植物病症更加明显。但其致病性的差异是
否真是因 IR 区缺失所引起，还需进一步的通过试验证实。本研究的发现提醒要注意病毒的自身演变，
防止其造成更大的危害。

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