全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：523–534.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0757；http：//www. ahs. ac. cn 523
收稿日期：2014–11–03；修回日期：2015–01–12
基金项目：国家自然科学基金项目（30860379，31400275）；国家科技支撑计划项目（2011BA101B03）；广西自然科学基金项目
（2013GXNFSBA019170）；广西卫生厅中医药科技专项（GZPT1235）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xjma@public.bta.net.cn；tangqi423@sina.com）

罗汉果葡萄糖基转移酶基因 SgUGT4 的克隆及
表达研究
莫长明 1,2，马小军 3,*，唐 其 4,*，白隆华 2，潘丽梅 2，冯世鑫 2
（1 广西大学农学院，南宁 530004；2 广西药用植物园，南宁 530023；3中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；
4湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128）
摘 要：以授粉后 70 d 的罗汉果为材料，采用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆到一个葡萄糖基转移酶基
因，命名为 SgUGT4。该基因 cDNA 全长 1 726 bp，包含完整的开放阅读框 1 344 bp，编码 447 个氨基酸。
构建 pET32a-SgUGT4 原核表达载体，转化大肠杆菌 Rossetta-gami（DE3），经 IPTG 诱导获得分子量约 65
kD 的目的基因融合蛋白。系统进化分析表明，SgUGT4 与具有罗汉果苷合成活性的拟南芥和甜叶菊葡萄
糖基转移酶 AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6、SrUGT73E1 聚在一个亚家族。实时荧光定量 PCR
检测表明，SgUGT4 在罗汉果甜苷Ⅴ主要积累部位果肉的表达量高于茎、叶、花和果皮，在根和种子中几
乎不表达；果实发育 40 ~ 50 d，甜苷Ⅴ开始积累，SgUGT4 表达量则逐渐升高，50 d 时急剧上升；甜苷Ⅴ
含量越高的品种，SgUGT4 表达量也越高。SgUGT4 可能在罗汉果甜苷Ⅴ生物合成过程中发挥作用。
关键词：罗汉果；葡萄糖基转移酶；基因克隆；原核表达；时空表达
中图分类号：S 576 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0523-12

Cloning and Expression Patterns of SgUGT4 Gene from Siraitia grosvenorii
MO Chang-ming1,2，MA Xiao-jun3,*，TANG Qi4,*，BAI Long-hua2，PAN Li-mei2，and FENG Shi-xin2
（1Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530004，China；2Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant，
Nanning 530023，China；3Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，
China；4College of Horticulture and Landscape Architecture，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）
Abstract：A glucosyltransferase gene，named as SgUGT4，was cloned from Siraitia grosvenorii fruits
at 70 days after pollinating（DAP）by RT-PCR and RACE methods. The full-length cDNA of SgUGT4 is
1 726 bp and has an open reading frame（ORF）of 1 344 bp which encodes a predict protein of 447 amino
acids. The recombinant plasmid pET32a-SgUGT4 was constructed in a prokaryotic expression system and
then was transformed into E.coli strain Rossetta-gami（DE3），a 65 kD fusion protein was expressed after
being induced by IPTG. Phylogenetic tree analysis showed that SgUGT4 was classified as the same
subfamily as the glucosyltransferase of AtUGT73C3，AtUGT73C5，AtUGT73C6 from Arabidopsis
thaliana and SrUGT73E1 from Stevia rebaudiana，which could catalyze mogrosides biosynthesis.

Mo Chang-ming，Ma Xiao-jun，Tang Qi，Bai Long-hua，Pan Li-mei，Feng Shi-xin.
Cloning and expression patterns of SgUGT4 gene from Siraitia grosvenorii.
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qRT-PCR analysis demonstrated that the expression level of SgUGT4 in pulps where mogroside Ⅴ most
abundantly accumulated was more higher than that in stems，leaves，flowers and peels. SgUGT4 did not
nearly expressed in roots and seeds. From 40 DAP to 50 DAP，the content of mogrosideⅤgradually
occurred and accumulated，the expression level of SgUGT4 rose gradually. The expression level of
SgUGT4 up-regulated sharply after 50 DAP. The more higher the mogroside Ⅴ content in varieties was，
the more higher its expression level of SgUGT4 in varieties was. Therefore，the SgUGT4 probably
involved in mogroside Ⅴ biosynthesis.
Key words：Siraitia grosvenorii；glucosyltransferase；gene cloning；prokaryotic expression；temporal
and spatial expression

罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey]为葫芦科罗汉果属多年生藤本植物，作为药材
和甜味剂使用已有数百年历史，其主要活性和甜味成分为甜苷Ⅴ（mogrosides Ⅴ）。甜苷Ⅴ具有镇咳
平喘、润肠通便、降血糖、抗氧化和增强免疫力等功效（Suzuki et al.，2005；陈维军 等，2006；戚
向阳 等，2006；国家药典委员会，2010），其甜度是蔗糖的 300 ~ 400 倍，且热量低，是糖尿病人
食糖的理想替代品，因而在天然药物和甜味剂开发方面受到广泛关注。然而，甜苷Ⅴ在罗汉果中含
量不高，仅占鲜果质量的 0.2% ~ 0.4%，使得其生产与应用成本较高。一方面，甜苷Ⅴ提取收得率已
较高，改进提取工艺降低其生产与应用成本的潜力有限；另一方面，受种质资源匮乏和雄株严重浪
费土地的影响（杂交后代中雌雄比例约 3︰7，苗期无法鉴定性别，单株占地面积 4 ~ 5 m2），杂交育
种提高果实甜苷Ⅴ含量的难度大。因此，克隆罗汉果甜苷Ⅴ生物合成关键酶基因，通过基因工程技
术发酵合成甜苷Ⅴ或培育高甜苷Ⅴ品种，成为解决其高成本问题的新途径。
苏小建等（2007，2008）研究发现，罗汉果根、茎、叶、果皮和种子中几乎不含甜苷Ⅴ，甜苷
Ⅴ主要存在于果肉中。果实皂苷积累动态研究表明，果实发育前 40 d，果实中主要含苷Ⅱ和苷Ⅲ，
不含甜苷Ⅴ；40 ~ 50 d 的果实中苷Ⅱ和苷Ⅲ逐渐减少，甜苷Ⅴ开始积累；50 ~ 70 d 果实甜苷Ⅴ快速
积累，苷Ⅱ和苷Ⅲ则减少消失；70 d 后果实主要含甜苷Ⅴ，不含苷Ⅱ和苷Ⅲ（刘金磊 等，2007）。
研究认为，甜苷Ⅴ是先由细胞色素 P450 氧化葫芦二烯醇产生罗汉果醇，再由葡萄糖基转移酶对罗
汉果醇进行糖基化修饰，逐渐从低糖苷到高糖苷转化而成（Tang et al.，2011），其直接前体物质可
能为苷Ⅱ或苷Ⅲ（莫长明 等，2014）。Liu 等（2013）以罗汉果醇为底物，对 250 个不同植物的葡
萄糖基转移酶基因进行重组蛋白体外筛选试验，鉴定出拟南芥葡萄糖基转移酶 AtUGT73C3、
AtUGT73C5、AtUGT73C6 和甜叶菊葡萄糖基转移酶 SrUGT85C2、SrUGT73E1，能以尿苷–5’–磷
酸葡萄糖作为糖基供体，在 C3-OH、C24-OH 或 C25-OH 位置上催化罗汉果醇产生罗汉果皂苷
MogrosideⅠa、MogrosideⅠb 或 MogrosideⅠ。邢爱佳等（2013）利用 RT-PCR 和 RACE 技术，克隆
出首个罗汉果葡萄糖基转移酶基因 SgUDPG1，通过原核表达成功获得该基因可溶性重组蛋白。但
是，罗汉果苷Ⅰ与苷Ⅱ、苷Ⅲ间的关系如何，苷Ⅱ或苷Ⅲ如何转化成甜苷Ⅴ，这一转化过程需要多
少个葡萄糖基转移酶参与等问题仍不清楚。
本研究中根据罗汉果转录组与表达谱分析筛选出的候选葡萄糖基转移酶基因 Unigene 序列进行
甜苷 V 生物合成相关葡萄糖基转移酶基因 RACE 克隆，生物信息学分析，重组蛋白原核表达，不同
组织、不同发育期果实和不同甜苷含量品种中表达水平比较研究，为进一步通过体外试验研究所克
隆基因的生化特性奠定基础，也为转基因发酵合成甜苷Ⅴ或培育高甜苷Ⅴ品种提供基因资源。
莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.
罗汉果葡萄糖基转移酶基因 SgUGT4 的克隆及表达研究.
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1 材料与方法
1.1 材料
采集‘农院 B6’、‘永青 1 号’和‘野红 1 号’罗汉果授粉后 10、20、30、40、50、60、70 和
90 d 果实果肉，以及‘农院 B6’品种授粉后 50 d 的根、茎、叶和花，液氮速冻后–80 ℃冰箱保存
备用。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 目的基因克隆及序列分析
采用 Trizol 法（Tang et al.，2011）提取‘农院 B6’授粉后 70 d 果实果肉的总 RNA，根据前期
获取的 SgUGT4（Siraitia grosvenorii uridine diphosphate glucosyltransferase gene 4）Unigene38974 序
列，设计 5′-RACE 特异引物（CGCCGACGGAGATTCCTTCCAGAACAGA）和 3′-RACE 特异引物
（ AATAGGCGTTAAGTCAGGGAAGGGAG ），按照 Clontech 公司 SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit试剂盒进行PCR扩增，参照Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到pMD19-T
载体，转化 DH5α 感受态细胞，挑选阳性克隆送华大基因公司进行测序。
采用 BioXM 进行开放阅读框（open reading frame，ORF）编码氨基酸序列翻译。NCBI 网站上
进行氨基酸序列同源性 Blastp 比对。采用 DNAMAN 进行氨基酸序列多序列比对，并用 MEGA5.1
构建系统进化树。ProtParam 在线预测基因编码蛋白一级结构。ProtScale 在线分析基因编码蛋白亲
疏水性。InterProScan、Scratch Protein Predictor、MHMM、SinglP4.1 和 WOLF PSORT 在线预测基
因编码蛋白保守结构域、二硫键、跨膜区、信号肽和亚细胞定位。用 Phyre2 在线进行基因编码蛋白
三级结构的同源建模。
1.2.2 原核表达载体构建及酶切鉴定
根据 SgUGT4 的 ORF 设计 5′-PCR 引物 AGTGGTACCATGGTGGTTTCCACTTCCAGCGG（划
线部分为 KpnⅠ酶切位点）和 3′-PCR 引物 ACTGAATTCTTATCTGATTAAATTAGTTGATTTT（划线
部分为 EcoRⅠ酶切位点）。以授粉后 70 d 的果实果肉 cDNA 为模板，PCR 扩增 SgUGT4 完整 ORF。
反应体系：cDNA 模板 2 µL、上下游引物各 1 µL、5 × Prime Star Buffer（Mg2+）10 µL、dNTP Mix 4
µL、Prime Star Taq 酶 0.5 µL、ddH2O 31.5 µL。PCR 扩增程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，
72 ℃ 2 min，40 个循环；72 ℃ 10 min。对 PCR 产物进行克隆、转化。筛选阳性克隆为模板，PCR
扩增获取 SgUGT4 完整 ORF，酶切后定向连接到原核表达载体 pET32a 的 KpnⅠ和 EcoRⅠ位点上，
构建重组质粒 PET32a-SgUGT4。酶切鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌 Rossetta-gami（DE3）。
1.2.3 融合蛋白诱导及 SDS-PAGE分析
接种带 PET32a-SgUGT4 质粒大肠杆菌于 5 mL 的 LB 培养基（30 µg · mL-1 卡那霉素，34 µg · mL-1
氯霉素，34 µg · mL-1 氨苄青霉素），37 ℃培养至 OD600 值 0.6 左右，添加 IPTG（0.2 mmol · L-1）诱
导蛋白表达。分别于 15 ℃过夜、22 ℃过夜、30 ℃过夜、37 ℃ 5 h 条件下诱导后，4 ℃、5 000 ×g
离心 5 min 收集菌体。菌体加 PBS 重悬后，冰浴中超声波破碎至澄清。上清和沉淀处理后分别进行
SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色（BSP041）。
1.2.4 融合蛋白Western blot分析
诱导融合蛋白 SDS-PAGE 电泳后，于转印缓冲液（0.025 mol · L-1 Tris base，0.192 mol · L-1 甘氨
酸，30%甲醇）中，采用夹心法电转印至 PVDF 膜上（300 mA 转印 80 min）；PVDF 膜放入封闭液
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（1× TBST，3%脱脂奶粉）室温封闭 1 h；封闭好的膜与一抗（生工 AB10002）4 ℃孵育过夜；一抗
孵育后，1× TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 min；洗净的膜与二抗（生工 AB10058）室温下孵育 1 h；二
抗孵育后，1× TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 min；TMB 显色（生工 PW025）观测结果。
1.2.5 融合蛋白纯化及检测
15 ℃诱导过夜，收集 4 L 菌体，超声破碎菌体收集上清液。上清液经 Ni-IDA-SefinoseTM Resin
（生工 BSP030-2）亲和层析纯化。500 mmol · L-1 咪唑洗脱液放置到 2 mol · L-1 尿素、50 mmol · L-1 Tris
溶液（pH 8.0）中透析过夜。透析后蛋白再进行 Q SefinoseTM FF（生工 SF007-Q）阴离子交换层析
纯化。洗脱液透析到 50 mmol · L-1 Tris、500 mmol · L-1 NaCl、2 mmol · L-1 DTT 溶液（pH 8.0）中。
透析后蛋白用PEG20000（生工PT1790-250 g）浓缩，过滤分装，–80 ℃保存。纯化蛋白通过SDS-PAGE
电泳检测，ChemiDocTM XRS+ system 灰度分析估算纯度。
1.2.6 目的基因时空表达规律分析
按刘金磊等（2007）HPLC 法测定‘农院 B6’、‘永青 1 号’和‘野红 1 号’品种授粉后 10、20、
30、40、50、70 和 90 d 果实果肉中甜苷Ⅴ含量。
提取样品总 RNA，利用实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative polymerase chain
reaction，qRT-PCR）方法检测 SgUGT4 在‘农院 B6’品种授粉后 10、20、30、40、50 和 60 d 果实
果肉和根、茎、叶、花、果皮、种子中的表达差异，以及在‘农院 B6’、‘永青 1 号’和‘野红 1
号’品种授粉后 50 d 果实果肉中的表达差异。反应体系：2 × SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 µL、
50 × ROX Reference DyeⅡ 0.5 µL、正反向引物各 0.5 µL、cDNA 模板 1 µL，加水补足至 25 µL，每
个反应重复 3 次。qRT-PCR 扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。qRT-PCR 均以
UBQ5 基因为内参基因。
2 结果与分析
2.1 目的基因克隆及序列分析
通过 RACE 克隆，获得 3′-RACE 片段 497 bp，5′-RACE 片段 1 125 bp（图 1），经测序拼接后，
获得 SgUGT4 的全长 1 726 bp。
SgUGT4 的 5′端包含 1 个 111 bp 非编码区，3′端包含 1 个 243 bp 非编码区和 28 bp 明显的 poly
（A）结构，ORF 位于 112 ~ 1 455 bp 位点，共计 1 344 bp，编码一个 447 aa 的肽链（图 2）。


图 1 SgUGT4 的 3′-RACE 和 5′-RACE 扩增
Fig. 1 Amplification of the SgUGT4 gene 3′-RACE and 5′-RACE
莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.
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图 2 SgUGT4 基因 ORF 编码氨基酸序列
Fig. 2 Amino acid sequence of the SgUGT4 gene open reading frame

ProtParam 分析表明，SgUGT4 蛋白肽链由 20 种氨基酸组成，分子式 C2232H3545N607O649S24，理
论分子量为 50.04 kD，等电点 pI 为 5.80，其中 Leu（12.1%）、Glu（8.7%）和 Gly（8.1%）含量较
高，Tyr（1.3%）、His（2.2%）和 Trp（2.2%）含量较低，Cys、Pro 分别为 11 个（2.5%）和 22 个（4.9%），
总疏水性指数–0.143。Scratch Protein Predictor 和 ProtScale 分析预测，SgUGT4 蛋白共形成 4 个二
硫键，分别在 85 位和 124 位，210 位和 217 位，155 位和 159 位、337 位和 363 位连接；存在 6 个
疏水区和 8 个亲水区，其中 18 ~ 40 位点，244 ~ 284 位点，316 ~ 368 位点疏水性较强。MHMM 和
SinglP4.1 分析显示，SgUGT4 蛋白不存在跨膜区和信号肽。WOLF PSORT 预测 SgUGT4 蛋白的亚
细胞定位情况为：叶绿体的定位系数为 11.0（chlo：11.0），细胞核的定位系数为 2.0（nucl：2.0）。
InterProScan 分析发现，SgUGT4 蛋白含有 UDP–葡萄糖醛酸 /葡萄糖基转移酶结构域
（IPR002213：UDP-glucuronosyl/UDP-glucosyltransferase）和一些在 IPR 中尚未明确分类的结构域。
UDP–葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶结构域包括，位于 1 ~ 447 bp 的 UDP–葡萄糖醛酸/葡萄糖基转
移酶结构域（PTHR11926，GLUCOSYL/GLUCURONOSYL TRANSFERASES）、位于 246 ~ 400 bp
的 UDP–葡萄糖基转移酶结构域（PF00201，UDPGT）和位于 318 ~ 361 bp 的 UDP–葡萄糖基转移
酶结构域（PS00375，UDPGT）。其中，318 ~ 361 bp 位保守结构域（PS00375）为植物次生代谢产
物葡萄糖基转移酶特有保守结构域PSPG-box motif（图 3，WAPQLLILSHPSVGGFLTHCGWNSVLEGI
SVGVPMVTLPLFADQ），被认为是 UDP-glcouse 结合区域。IPR 中尚未明确分类的结构域包括位于
1 ~ 447 bp 的 UDP–糖基转移酶 73C1 家族相关结构域（PTHR11926：SF146，UDP-GLYCOSYLTRA
NSFERASE 73C1-RELATED）、位于 9 ~ 441 bp 位的 UDP–糖基转移酶/糖原磷酸化酶超家族结构域
（SSF53756，UDP-Glycosyltransferase/glycogen phosphorylase superfamily）和位于 307 ~ 413 bp 的功
能未知结构域（G3DSA：3.40.50.2000，Unintegrated signatures）。
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图 3 SgUGT4 葡萄糖基转移酶氨基酸序列比对
SgUGT4：罗汉果；AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6：拟南芥；SrUGT73E1、SrUGT85C2：甜叶菊。
字符背景颜色代表序列同源性高低。
Fig. 3 Alignments of the deduced amino acid sequences of the SgUGT4 glucosyltransferase
SgUGT4：Siraitia grosvenorii；AtUGT73C3，AtUGT73C5，AtUGT73C6：Arabidopsis thaliana；SrUGT73E1，SrUGT85C2：Stevia rebaudiana.
Shading colors of letters indicate sequence homology.

Blastp 同源性比对显示，SgUGT4 与大豆等植物葡萄糖基转移酶氨基酸序列同源性最高达 51%。
选择拟南芥、甜叶菊、蒺藜苜蓿、大豆、长春花、三花龙胆、黄芩、王不留行、雪莲花、柚子、葡
萄柚、美洲葡萄、苹果、草莓、美洲黑杨、月季、南非醉茄、美商陆、大岩桐、绿毛山柳菊和美女
樱等 21 种植物，研究对萜类、黄酮、甾体、激素和多酚具有糖基化活性的 76 个葡萄糖基转移酶
（Jackson et al.，2001；Lim et al.，2002；Hou et al.，2004；Lim & Bowles，2004；Achnine et al.，
2005；Lim，2005；Lim et al.，2005；Richman et al.，2005；Witte et al.，2009；Naoumkina et al.，
2010；Shibuya et al.，2010；Husar et al.，2011；Lambert et al.，2011；Ozaki et al.，2012；Liu et al.，
2013）与 SgUGT4 葡萄糖基转移酶系统进化后，分析发现 SgUGT4 与拟南芥和甜叶菊葡萄糖基转移
酶 AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6、SrUGT73E1 聚在 1 个亚家族（图 4），此 4 个葡萄糖基
转移酶已被证明能催化葡萄糖基转移至罗汉果醇形成罗汉果皂苷（Liu et al.，2013）。

莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.
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图 4 SgUGT4 与其它植物葡萄糖基转移酶系统进化树
◆为参与萜类合成葡萄糖基转移酶；分枝上的数字为 1 000 次建树中该位置出现的置信度值。
Fig. 4 The phylogenetic tree of SgUGT4 and glucosyltransferases in other plants
◆：Glcosyltransferases catalyzing synthesis of terpenoids；Boot strapping was done by resampling from the data 1 000 times.
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图 5 SgUGT4 的 ORF 扩增
Fig. 5 Amplification of the SgUGT4 gene open
reading frame
图 6 重组质粒 pET32a-SgUGT4 酶切
Fig. 6 Double enzymes digestion of recombinant plasmids
pET32a-SgUGT4
Phyre2 分析表明，SgUGT4 葡萄糖基转移酶三级结构含有 2 个正对的 β/α/β类型 Rossmann 折叠
区域，并以 1 个深沟相连。其中，11 ~ 15、39 ~ 44、67 ~ 72、122 ~ 127、144 ~ 149、183 ~ 186、208 ~
211、252 ~ 257、282 ~ 286、313 ~ 316、332 ~ 335、351 ~ 354 和 375 ~ 379 位的 β 折叠占 14%，21 ~
35、46 ~ 56、94 ~ 117、155 ~ 158、169 ~ 176、189 ~ 203、214 ~ 215、237 ~ 245、265 ~ 277、304 ~
308、321 ~ 325、340 ~ 342、359 ~ 371、388 ~ 400、402 ~ 422 和 427 ~ 439 位的 α螺旋占 43%，124 ~
154 和 343 ~ 358 位的跨膜螺旋占 11%，无序区域占 15%。
2.2 原核表达载体构建及酶切鉴定
以授粉后 70 d 果实果肉 cDNA 为模板扩增获得长度 1 344 bp 的 SgUGT4 完整 ORF（图 5）。对
PCR 扩增产物进行克隆、转化。选取测序正确的 pMD19-T-SgUGT4 质粒扩增 SgUGT4 完整 ORF，
克隆至原核表达载体 PET32a 的 KpnⅠ和 EcoRⅠ位点上。重组质粒经 KpnⅠ和 EcoRⅠ双酶切，获得
约 1 356 bp 的目的基因片段和约 5 900 bp 的 PET32a 片段（图 6）。酶切片段测序表明插入片段与克
隆序列一致，确认 SgUGT4 原核表达载体 PET32a-SgUGT4 构建成功。
2.3 融合蛋白诱导表达及 SDS-PAGE 分析
SDS-PAGE 分析显示（图 7），4 种诱导条件下融合蛋白均得到了特异表达，在分子量约 65 kD
位置上存在 1 条融合蛋白条带，除去分子量约 15 kD 的融合标签蛋白，目的蛋白分子量约为 50 kD，
与葡萄糖基转移酶基因 SgUGT4（HQ259623.1）编码蛋白的分子量理论值相符。不同温度和时间条
件下诱导，均表达出 SgUGT4 可溶性融合蛋白，但也有部分蛋白形成包涵体。
图 7 诱导表达产物的 SDS-PAGE 分析
S：上清液；P：沉淀。
Fig. 7 Analysis of induced expression products by SDS-PAGE
S：Supematant；P：Precipitation.
莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.
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表 1 不同发育期不同品种果实中罗汉果甜苷Ⅴ含量比较
Table 1 Mogroside contentⅤ comparison of Siraitia grosvenori
fruits among developmental periods or varieties %
发育期/d
Developmental period
农院 B6
Nongyuan B6
永青 1 号
Yongqing 1
野红 1 号
Yehong 1
10 0 0 0
20 0 0 0
30 0 0 0
40 0 0 0
50 0.36 0.21 0.14
70 4.46 3.90 2.74
90 4.86 4.25 3.45

图 10 不同组织部位 SgUGT4 的表达变化
Fig. 10 Expression of the SgUGT4 gene in various organs
2.4 融合蛋白 Western blot 分析及纯化
Western blot 分析可见 1 条分子量约为 65 kD 特异蛋白条带（图 8），证明 SgUGT4 融合蛋白可
在原核系统中成功表达。重组 SgUGT4 融合蛋白亲和纯化后，经 SDS-PAGE 检测显色 1 条约 65 kD
蛋白条带，灰度分析纯度约为 82.4%（图 9）。



图 8 SgUGT4 蛋白 Western blot 分析 图 9 SgUGT4 蛋白纯度 SDS-PAGE 分析
Fig. 8 Western-blot analysis of the SgUGT4 protein Fig. 9 Purity analysis of the SgUGT4 protein by SDS-PAGE

2.5 目的基因时空表达特性分析
表 1 显示，‘农院 B6’、‘永青 1 号’和‘野
红 1 号’，授粉后 10 ~ 40 d 果实未检出甜苷Ⅴ，
40 ~ 50 d 果实甜苷Ⅴ开始累积，50 ~ 70 d 果实
甜苷Ⅴ快速积累，70 ~ 90 d 果实甜苷Ⅴ增加缓
慢。3 个品种成熟果实（90 d）甜苷Ⅴ含量存
在差异，‘农院 B6’>‘永青 1 号’>‘野红 1
号’。
图 10 显示，SgUGT4 在茎、叶片、花、果
肉和果皮中均有表达，表达量由高到低依次为
果肉 >果皮 > 叶片 > 茎 > 花，根和种子中
几乎不表达。其果肉中表达量分别是果皮的
1.42 倍、叶片的 1.62 倍、茎的 2.43 倍和花的
7.42 倍。
图 11 显示，SgUGT4 在授粉后 10 ~ 60 d
果实中均有表达，10 ~ 50 d 逐渐升高，50 d 时
达最高值，60 d 时则开始下降。50 d 果实中表
达量分别是 40 d 的 1.65 倍、30 d 的 1.78 倍、
60 d 的 2.55 倍、20 d 的 2.69 倍和 10 d 的 3.08
倍。
图 12 显示，3 个甜苷Ⅴ含量不同的品种，
授粉后 50 d 果实中 SgUGT4 表达量不同，高甜
苷Ⅴ含量品种‘农院 B6’和中等含量品种‘永
青 1 号’表达量分别是低含量品种‘野红 1 号’的 1.98 倍和 1.61 倍。
Mo Chang-ming，Ma Xiao-jun，Tang Qi，Bai Long-hua，Pan Li-mei，Feng Shi-xin.
Cloning and expression patterns of SgUGT4 gene from Siraitia grosvenorii.
532 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：523–534.


图 11 不同发育期果实 SgUGT4 的表达变化 图 12 不同品种果实 SgUGT4 的表达变化
Fig. 11 Expression of the SgUGT4 gene in different Fig. 12 Expression of the SgUGT4 gene
developmental stage fruits in different varieties
3 讨论
糖基转移酶广泛存在于生物体中，催化黄酮、萜类、固醇、生物碱、酚类、激素、糖类、蛋白
质和脂质等物质进行糖基化反应（Paquette et al.，2003；Lim & Bowles，2004；Bowles et al.，2005；
Gachon et al.，2005；Lim，2005）。在植物中，糖基转移酶催化的糖基化反应可改变受体分子的水溶
性、化学稳定性、生物活性和亚细胞定位，是植物细胞保持代谢平衡的重要机制，在生长发育、代
谢调节、毒素解毒和次生代谢产物合成等方面发挥重要作用（Li et al.，2001；Ross et al.，2001）。
本研究中利用 RT-PCR 和 RACE 技术，从罗汉果中克隆了 SgUGT4 基因全长。该基因编码蛋白
氨基酸序列与大豆等植物葡萄糖基转移酶的同源性较高，一级结构包含葡萄糖基转移酶重要结构特
征，C 末端具有 1 个由 44 个氨基酸组成的葡萄糖基供体结合保守结构域 PSPG（Vogt & Jones，2000）。
三级结构同源建模分析显示，其蛋白三级结构含有 2 个被 1 个深沟相连的正对 β/α/β 类型 Rossmann
折叠区域。这些表明 SgUGT4 属于糖基转移酶 GT1 基因家族 GTB 亚家族成员。
不同罗汉果皂苷具有共同的苷元罗汉果醇，差异主要为在 C3-OH 和 C24-OH 位上连接葡萄糖基
数量与方式不同。SgUGT4 具有植物次生代谢葡萄糖基转移酶 PSPG 特征保守结构域，系统进化树
中与拟南芥葡萄糖基转移酶 AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6 和甜叶菊葡萄糖基转移酶
SrUGT73E1 聚在一个亚家族。Liu 等（2013）重组蛋白体外试验研究表明，AtUGT73C3、AtUGT73C6
和 AtUGT85C2 可在 C24-OH 位上催化罗汉果醇形成 MogrosideⅠb，AtUGT73C5 可在 C3-OH 或
C24-OH 位上催化罗汉果醇形成 MogrosideⅠa、MogrosideⅠb，SrUGT73E1 可在 C24-OH 或 C25-OH
位上催化罗汉果醇形成 MogrosideⅠb、MogrosideⅠ。由此推测，SgUGT4 可能在罗汉果中具有催化
甜苷Ⅴ合成作用。
苏小建等（2007，2008）采用 HPLC 法检测罗汉果根、茎、叶、果肉、果皮和种子中甜苷Ⅴ含
量分别为 0.006%、0.002%、0.011%、2.36%、0.26%和 0.06%。本试验中 SgUGT4 在甜苷Ⅴ主要积累
部位果肉的表达量高于几乎不含甜苷Ⅴ的茎、叶和果皮，在根和种子中几乎不表达。‘农院 B6’、‘永
青 1 号’和‘野红 1 号’3 个品种果实中甜苷Ⅴ积累规律与刘金磊等（2007）的研究结果一致。果实
发育的前 40 d 不含甜苷Ⅴ，SgUGT4 表达量较低；40 ~ 50 d 果实甜苷Ⅴ开始累积，SgUGT4 表达量
逐渐上调；50 ~ 70 d 果实甜苷Ⅴ快速积累，SgUGT4 表达量急剧上调。果实甜苷Ⅴ含量越高的品种，
其 SgUGT4 表达量也越高。这些表明 SgUGT4 可能在苷Ⅱ或苷Ⅲ转化成甜苷Ⅴ的过程中发挥作用。
莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.
罗汉果葡萄糖基转移酶基因 SgUGT4 的克隆及表达研究.
园艺学报，2015，42 (3)：523–534. 533

植物糖基转移酶是 1 个高度分化的超家族，蛋白质的一级结构同源性低，特征保守结构域 PSPG 同
源性也仅为 43% ~ 78%，因此通常具有较强的底物专一性和位置选择性。邢爱佳等（2013）从罗汉
果中克隆的葡萄糖基转移酶基因 SgUDPG1，与本试验中的 SgUGT4 基因编码蛋白氨基酸序列同源
性不高，但二者均在甜苷Ⅴ快速积累期（果实发育 50 ~ 70 d）表达量急剧上调。这些表明 SgUGT4
可能具有较强的底物专一性或位置选择性，苷Ⅱ或苷Ⅲ转化成甜苷Ⅴ的过程可能需要 SgUGT4 和
SgUDPG1 共同参与，催化 C3-OH 或者 C24-OH 位上连接葡萄糖基，但还需后续试验验证。
通过原核表达重组融合蛋白进行体外筛选试验，已鉴定了许多黄酮类葡萄糖基转移酶基因的功
能（Lim et al.，2004；Witte et al.，2009），但已知功能的萜类葡萄糖基转移酶基因仍较少。本研究
中成功克隆出完整的葡萄糖基转移酶基因 SgUGT4，将其与 pET32a 原核表达载体重组，转入大肠杆
菌中，正确表达出带 Trx 标签重组融合蛋白，并从上清液中纯化获得纯度达 82.4%的可溶性融合蛋
白，为继续通过体外试验研究 SgUGT4 的底物特性和位置选择性，理解罗汉果甜苷Ⅴ生物合成途径
奠定了基础，也为罗汉果甜苷Ⅴ发酵合成和高含量转基因品种培育提供了基因资源。

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