全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：350–360.
Acta Horticulturae Sinica
350 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0704；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2014–10–28；修回日期：2015–01–04
基金项目：广州市科技计划项目（1212011541，2014J4100123）；广东省教育厅科技创新项目（2012KJCX0083）；国家自然科学基金项
目（30871526）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ronghua@gzhu.edu.cn）
菜薹种质遗传多样性的荧光 MFLP 标记分析
郭培国 1，许兰桂 1，夏岩石 1，黄红弟 2，张 华 2，郑岩松 2，李荣华 1,*
（1 广州大学生命科学学院，广州 510006；2广州市农业科学研究院，广州 510308）
摘 要：采用 M13 通用接头连接锚定引物，建立了适合于菜薹的荧光微卫星锚定片段长度多态性
（MFLP）技术；在此基础上，从 360 对选择性扩增引物组合中筛选出 9 对适宜的引物组合，对收集的 32
份菜薹种质进行等位基因多态性分析；结果显示这些引物组合的扩增产物在 32 份菜薹种质中的等位基因
多态性在 10 ~ 31 之间，平均为 17.7 个；多态性信息量在 0.61 ~ 0.98 之间，平均 0.81。利用获得等位基因
多态性进行的遗传相似性分析表明，32 份菜薹种质间的相似系数在 0.277 ~ 0.836 之间，平均 0.624；基于
多态性数据，运用除权配对法（UPGMA）进行聚类分析，将这些菜薹种质材料分为 2 个组群和 4 个亚群。
这些结果显示荧光 MFLP 标记技术能有效地发现供试菜薹种质材料的 DNA 多态性，表明该技术在菜薹遗
传特性分析的研究和应用领域具有可行性。
关键词：菜薹；荧光 MFLP；遗传多样性
中图分类号：S 634.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0350-11

Genetic Diversity Analysis for Germplasm of Flowering Chinese
Cabbage by Using Fluorescent Microsatellite-anchored Fragment Length
Polymorphism
GUO Pei-guo1，XU Lan-gui1，XIA Yan-shi1，HUANG Hong-di2，ZHANG Hua2，ZHENG Yan-song2，
and LI Rong-hua1,*
（1College of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2Guangzhou Academy of Agricultural
Sciences，Guangzhou 510308，China）
Abstract：In this study，a fluorescent microsatellite-anchored fragment length polymorphism
（MFLP） technique was established by adding universal M13 adapter to the anchored primers. Nine
highly polymorphic primer pairs were selected from 360 selective amplification primer combinations，and
were used to screen polymorphisms for 32 genotypes of flowering Chinese cabbage. The results showed
that the polymorphic alleles for the nine primer pairs ranged from 10 to 31 in 32 flowering Chinese
cabbage genotypes，with an average of 17.7 per primer combination. Polymorphism information content
（PIC）ranged from 0.61 to 0.98 for nine primer combinations，with an average of 0.81. The genetic
similarities were calculated and showed their distribution ranged from 0.277 to 0.836 among the 32
genotypes. By using polymorphic alleles data，the 32 flowering Chinese cabbage genotypes were clustered

郭培国，许兰桂，夏岩石，黄红弟，张 华，郑岩松，李荣华.
菜薹种质遗传多样性的荧光 MFLP 标记分析.
园艺学报，2015，42 (2)：350–360. 351

into 2 groups and 4 subgroups by UPGMA method. These results show that the developed fluorescent
MFLP technique could effectively detect DNA polymorphisms in the flowering Chinese cabbage
germplasm，indicating this technique is suitable for the fields of research and application of genetic
analysis in flowering Chinese cabbage.
Key words：flowering Chinese cabbage；fluorescent MFLP；genetic diversity

菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）是中国华南地区的主要蔬菜作
物之一（张华和刘自珠，2010），在华南地区有较丰富种质资源。目前对国内外收集菜薹种质资源的
研究和评价大多局限于对表型性状（如形态特征与农艺性状）的一些简单鉴定与描述（李植良 等，
2006）。与其他蔬菜作物相比，菜薹在利用分子标记技术开展遗传多样性分析的研究和应用的研究论
文较少，且主要利用随机扩增多态性 DNA（RAPD）和简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）反应
体系对少量材料进行分析（李光光 等，2011；许兰桂 等，2012a）。
微卫星锚定片段长度多态性（Microsatellite-anchored fragment length polymorphism， MFLP）是
Yang 等（2001）利用扩增片段长度多态性（AFLP）和 SSR 锚锭引物技术的双重原理建立的一种分
子标记技术，其实质是同时探查 DNA 分子中限制性内切酶酶切位点、限制性片段内碱基序列和微
卫星重复基元存在的等位基因多态性，具有 AFLP 标记技术的丰富多态性和 SSR 标记的共显性的特
点（Yang et al.，2002；何其芳 等，2012）；利用该技术已开展了多种作物的遗传多样性分析、遗传
图谱的构建和 QTL 定位等研究工作（Yang et al.，2002；Sadeghzadeh et al.，2010）。MFLP 标记技
术传统上是采用同位素技术，这种技术难以在普通实验室中推广应用；亦有报道采用银染染色技术
检测 MFLP 存在的多态性（李杨 等，2010），但银染技术存在分辨率相对较低且操作复杂和费时等
不足，而采用荧光标记技术则可以克服上述不足（郝晨阳 等，2005）。
本研究中利用 M13 荧光引物作为通用接头，建立起菜薹的荧光 MFLP 标记技术体系；在此基础
上，分析菜薹种质的遗传多样性，为荧光 MFLP 标记技术在菜薹的研究和利用上提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试菜薹材料及 DNA 提取
供试的 32 份菜薹材料（表 1）是由广州市农业科学研究院从菜薹种质资源库中筛选出的，在熟
期、叶色等性状方面具有代表性。其中在预试验中表现为相互间具有较高多态性的‘四九 19 菜心’、
‘油绿 501’、‘绿宝 70 天’和‘澳选甜菜心’等 4 份材料被用于筛选选择性扩增引物组合。
菜薹种子在 2012 年盆播于广州大学作物种植试验站，待长至 3 叶期，收取幼苗，采用李荣华
等（2009）的改良 CTAB 法提取基因组 DNA，通过 1%的琼脂糖凝胶电泳观察所提取的 DNA 的质
量，采用紫外分光光度法检测核酸浓度，并稀释至 100 ng · μL-1，–20 ℃冰箱中贮藏备用。
荧光引物 M13-F-IRDye 700（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）购自美国 LICOR 公司，MseⅠ
接头、预扩增和选择性扩增的引物合成、试验所需的 MseⅠ和 HaeⅢ及试剂均购自生工生物工程（上
海）股份有限公司。
本研究中使用的引物信息见表 2。


Guo Pei-guo，Xu Lan-gui，Xia Yan-shi，Huang Hong-di，Zhang Hua，Zheng Yan-song，Li Rong-hua.
Genetic diversity analysis for germplasm of flowering Chinese cabbage by using fluorescent microsatellite-anchored fragment length polymorphism.
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表 1 供试菜薹种质的来源、熟性和叶色
Table 1 Origin，maturity and leaf color of the flowering Chinese cabbage accessions used in the study
来源
Origin
编号
Code
种质名称
Accession name
熟性
Maturity
叶色
Leaf color
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
1 四九 19 菜心
Sijiu 19 Caixin
早熟
Early maturity
黄绿色
Yellow-green
广州义农园艺有限公司
Guangzhou Yinong Horticulture Ltd.
2 柳叶油绿 50 天
Liuye Youlü 50 Days
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
3 油绿 501
Youlü 501
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
汕头市白沙蔬菜原种研究所
Shantou Baisha Vegetable Seed Research Institute
4 东莞白沙 70 天
Dongguan Baisha 70 Days
中熟
Medium maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
5 油绿 80 天菜心
Yulü 80-day Caixin
迟熟
Late maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
6 油绿 802 菜心–3
Youlü 802 Caixin-3
迟熟
Late maturity
油绿
Glossy dark green
广东省农业科学院蔬菜研究所
Vegetable Research Institute，Guangdong Academy
of Agricultural Sciences
7 翠绿 80 天菜心
Cuilü 80-day Caixin 迟熟 Late maturity
油绿
Glossy dark green
湛江市新苗种子有限公司
Zhanjiang Xinmiao Seed Ltd.
8 翠绿尖叶菜心
Cuilü Jianye Caixin
早熟
Early maturity
碧绿
Virid
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
9 绿宝 70 天
Lübao 70 Days
中熟
Medium maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
10 油绿 701 菜心
Youlü 701 Caixin
中熟
Medium maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
11 油绿 702 菜心
Youlü 702 Caixin
中迟熟
Medium/Late maturity
碧绿
Virid
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
12 特青迟心 4 号
Teqing Chixin 4
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
13 Cjs-2-3 早熟
Early maturity
碧绿
Virid
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
14 油绿 60 天
Youlü 60 Days
早中熟
Early/Medium maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
15 迟心 2 号
Chixin 2
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
16 油绿 50 天
Youlü 50 Days
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
17 油绿 80 天–2
Youlü 80 Days-2
迟熟
Late maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
18 迟 29-9
Chi 29-9
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
广州市兴田种子有限公司
Guangzhou Xingtian Seed Ltd.
19 澳选甜菜心
Aoxuan Sweet Caixin
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
20 12 号菜心
12 Caixin
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
21 油青四九–2
Youqing Sijiu-2
早熟
Early maturity
黄绿色
Yellow green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
22 特青迟心 4 号–2
Teqing Chixin 4-2
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
23 12 号菜心–2
12 Caixin-2
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
柳州市农业科学研究所
Liuzhou Agricutural Research Institute
24 迟心杂交 2 号菜心
Chixin Zajiao 2 Caixin
迟熟
Late maturity
黄绿色
Yellow green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
25 绿宝 60 天菜心
Lübao 60-day Caixin
早中熟
Early/Medium maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
26 油绿 50 天–2
Youlü 50 Days-2
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
27 油青 50 天–2
Youqing 50 Days-2
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
柳州市农业科学研究所
Liuzhou Agricutural Research Institute
28 杂交菜心 003
Zajiao Caixin 003
早中熟
Early/Medium maturity
黄绿色
Yellow green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
29 油绿 50 天–3
Youlü 50 Days-3
早熟
Early maturity
油绿
Glossy dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
30 特青迟心 7 号
Teqing Chixin 7
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
广州市农业科学研究院
Guangzhou Academy of Agricultural Sciences
31 迟心 2 号–2
Chixin 2-2
迟熟
Late maturity
深绿
Dark green
柳州市农业科学研究所
Liuzhou Agricutural Research Institute
32 十月柳叶菜心
Shiyue Liuye Caixin
早熟
Early maturity
黄绿色
Yellow green
郭培国，许兰桂，夏岩石，黄红弟，张 华，郑岩松，李荣华.
菜薹种质遗传多样性的荧光 MFLP 标记分析.
园艺学报，2015，42 (2)：350–360. 353

表 2 MFLP 预扩增和选择性扩增的引物
Table 2 MFLP primers used in pre- and selective amplifications
引物名称 Primer name 碱基序列 5′→3′ Sequence 5′→3′
MseⅠ 接头 1 MseⅠadapter 1 GACGATGAGTCCTGAG
MseⅠ 接头 2 MseⅠadapter 2 TACTCAGGACTCAT
SSR 锚定引物 SSR-anchored primers (TTA)6G、(TC)8C、GTCC(GA)6、GGAC(CT)6、GAG(AC)7、CCCA(AG)7、CCTA(CA)7、
GAG(TC)7、GATT(CT)6、GGCA(TG)6、GGCT(AAG)5、GACG(AAC)5、CCAG(CTT)5、
GGCA(AGA)4、CCCATT(GTT)4、TGGAA(CAA)4、GGCT(TA)8、AGGTG(CA)6、
GTCC(TAA)5、GGTC(ATT)5
MseⅠ引物 MseⅠprimer GATGAGTCCTGAGTAA
加尾 SSR 锚定引物
Tailed SSR-anchored primers

tf(TTA)6G、tf(TC)8C、tfGTCC(GA)6、tfGGAC(CT)6、tfGAG(AC)7、tfCCCA(AG)7、
tfCCTA(CA)7 、 tfGAG(TC)7 、 tfGATT(CT)6 、 tfGGCA(TG)6 、 tfGGCT(AAG)5 、
tfGACG(AAC)5 、 tfCCAG(CTT)5 、 tfGGCA(AGA)4 、 tfCCCATT(GTT)4 、
tfTGGAA(CAA)4、tfGGCT(TA)8、tfAGGTG(CA)6、tfGTCC(TAA)5、tfGGTC(ATT)5
MseⅠ选择性扩增引物
MseⅠselective amplification primer
mAGG、mCTCT、mCAA、mTCT、mCAG、mAGC、mCTC、mCTT、mGTA、
mGCA、mAAG、mACA、mTGA、mGAT、mTTA、mGAT、mCCC、mCGA
注：“m”表示预扩增中 MseⅠ引物序列，“tf”代表 M13 荧光引物的序列。
Note：“m”indicates the sequence of MseⅠprimer in preamplification，“tf”represents the sequence of M13 fluorescent primer.
1.2 M13 加尾的荧光 MFLP 标记技术
依据 Yang 等（2001）建立的 MFLP 标记技术体系的基本原理，选用 M13 荧光引物替换同位素，
修改了预扩增中 MseⅠ引物和选择性扩增的锚定引物及其反应体系，建立菜薹的荧光 MFLP 标记技
术体系：利用限制性内切酶 MseⅠ切割基因组 DNA，用两个 MseⅠ接头（adaptor）连接切割处，再
用 HaeⅢ酶切割连接后的产物作为预扩增的 DNA 模板；预扩增用 1 个锚定重复序列基序的引物（即
锚定的 SSR 引物）和 1 个含有 MseⅠ接头及该酶切识别位点序列的引物（即 MseⅠ引物），扩增产
物稀释 20 倍后作为选择性扩增的 DNA 模板；在选择性扩增中，反应体系中加入带有 IRD700 或
IRD800 的 M13 荧光标记引物，正向引物为锚定的 SSR 引物的 5′端加上 M13 引物序列（即“加尾”
SSR 引物），反向引物为 MseⅠ引物的 3′端随机加上 1 ~ 5 个选择性碱基；扩增产物经 LI-COR 4300
DNA 遗传分析仪检测样品之间存在的多态性。其中预扩增和选择性扩增体系是建立菜薹荧光 MFLP
标记技术的关键点。
预扩增 PCR 体系总体积为 30 μL，含预扩增模板（酶切后的连接产物）6 μL，Taq DNA Polymerase
（5 U · μL-1）0.45 μL，SSR 锚定引物（10 μmol · L-1）1.5 μL，MseⅠ引物（10 μmol · L-1）1.5 μL，
10× PCR buffer 3.0 µL，Mg2+（20 mmol · L-1）3.6 µL，10 mmol · L-1 dNTPs 0.9 μL，双蒸水 13.05 μL。
PCR 反应程序：94 ℃预变性 2 min，25 个 PCR 循环（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），4 ℃下
保存。
选择性扩增体系 10 μL，含选择性扩增模板 1 μL（稀释 20 倍的预扩增产物），Taq DNA Polymerase
（5 U · μL-1）0.15 μL，加尾 SSR 锚定引物（1 μmol · L-1） 0.6 μL，10× PCR buffer 1.0 µL，MgCl2
（20 mmol · L-1）1.2 µL，10 mmol · L-1 dNTPs 0.3 μL，0.1 μmol · L-1 荧光引物 M13-F（IRDye700）0.5
μL，MseⅠ选择性扩增引物 0.6 μL，双蒸水 4.65 μL。PCR 程序：94 ℃ 30 s、60 ℃（每个循环下降
0.7 ℃）30 s、72 ℃ 1 min，循环 9 次；再按 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72℃ 1 min，循环 25 次。
选择性扩增产物在 LICOR 4300s DNA 遗传分析仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰
胺凝胶浓度为 6.5%，尿素浓度为 7.5 mol · L-1，以 0.5× TBE 缓冲液作为电泳上下槽的缓冲液。电泳
参数为：电压 1 500 V，电流 40 mA，功率 40 W，温度 45 ℃，并用多功能扫描仪的红外荧光通道
扫描电泳图谱。
Guo Pei-guo，Xu Lan-gui，Xia Yan-shi，Huang Hong-di，Zhang Hua，Zheng Yan-song，Li Rong-hua.
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1.3 数据分析
使用 GelBuddy 软件（http：//www. proweb. org/gelbuddywebsite）对条带进行判读，确定出清晰
易读的多态性条带位点及其大小；根据条带的有无，构建出 0、1 二元数据矩阵，计算标记位点的多
态性信息量（PIC）（Simth et al.，1997）和标记系数（MI）（Senior et al.，1998）。用 NTSYSpc-2.02i
软件（Rohlf，1993）进行群体聚类分析，用 SHAN 程序中的非加权算术平均聚类（Unweighted
Pair-Group Mean Average，UPGMA）方法进行聚类分析，通过 Tree plot 模块生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 菜薹 MFLP 分子标记技术预扩增体系的建立
MFLP 标记的预扩增反应起着承上启下的作用，既反映酶切和连接效果的好坏，又直接影响着
选择性扩增效果，它是 MFLP 分析过程中的重要步骤，其结果受到多方面因素的影响。在建立菜薹
的 MFLP 预扩增的反应体系时，最初采用 Yang 等（2001）建议的引物组合（即 MseⅠ引物的 3′端
加 1 个选择性碱基和 1 个 SSR 锚定引物），预扩增产物具有连续成片状条带，条带主要分布在 150 ~
500 bp（图 1，A），但其扩增产物作为选择性扩增模板时发现选择性扩增产物的多态率（即具多态
性条带）较低。为此，经过多次试验，发现在预扩增的 MseⅠ引物（Yang et al.，2001）中去掉 3′
端增加的 1 个选择性碱基效果更好，扩增产物电泳检测结果可见每份菜薹材料均有明显的弥散带，
且连续成片，分布在 100 ~ 700 bp，且较均匀（图 1，B），产物符合 MFLP 分析的要求，适合进行
下一步的选择性扩增。


图 1 菜薹种质材料按 Yang 等（2001）的方法（A）和修改的（B）MFLP 预扩增产物的琼脂糖电泳图谱
M 为 DNA 大小标样，1 ~ 32 代表 32 份菜薹种质材料。
Fig. 1 The image of agarose gel electrophoresis of pre-selective amplification with Yang et al.（2001）technique（A）
and the modified technique（B）
M indicates DNA size marker. Lanes 1–32 represent 32 flowering Chinese cabbage accessions.
2.2 菜薹 MFLP 分子标记技术选择性扩增体系的建立与选择性扩增引物组合的筛选
与同位素和银染的 MFLP 分析的选择性扩增不同，荧光 MFLP 标记技术选择性扩增中 SSR 锚定
引物增加了 M13 引物接头，反应体系中还增加了 M13 荧光引物。为此，利用‘四九 19 菜心’、‘油
绿 501’、‘绿宝 70 天’和‘澳选甜菜心’4 份在预试验中相互间具有较高多态性的菜薹种质作为检测
郭培国，许兰桂，夏岩石，黄红弟，张 华，郑岩松，李荣华.
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选择性扩增效果的材料，调整荧光引物、加尾 SSR 锚定引物和 MseⅠ选择性扩增引物的用量，最后
确定 10 μL 的选择性扩增 PCR 反应体系中，加入 0.1 μmol · L-1 荧光引物 M13-F（IRDye700） 0.5 μL、
1 μmol · L-1 加尾 SSR 锚定引物 0.6 μL、1 μmol · L-1 MseⅠ选择性扩增引物 0.6 μL，选择性扩增效果
较好。图 2 为锚定引物 tf(TTA)6G 分别与 16 个 MseⅠ选择性扩增引物在 4 个菜薹菜材料间扩增产物
的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，各引物组合均具有较好的扩增效果。



























图 2 4 个菜薹种质材料锚定引物为 tf(TTA)6G 的 16 个选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
M 为 DNA 大小标样；1：四九 19 菜心；2：油绿 501；3：绿宝 70 天；4：澳选甜菜心。
Fig. 2 Image of polyacrylamide gel electrophoresis for 16 selective amplification products with
anchored primer tf(TTA)6G in four flowering Chinese cabbage accessions
M is DNA size marker；1：Sijiu 19 Caixin；2：Youlü 501；3：Lübao 70 Days；4：Aoxuan Sweet Caixin.

分析所有选择性扩增引物组合的扩增产物，发现大多引物组合扩增出小于 700 bp 荧光强度强弱
不一的条带，电泳图谱清晰，带型稳定，重复性好；其中有些引物组合的扩增产物可产生较多的清
晰易辨的多态性条带[如图 2 中锚定引物 tf(TTA)6G 与 mCTCT 引物组合扩增产物具有清晰易辨多态
性条带数 10 个]，有些引物组合的扩增条带大多集中在低分子量部分[如图 2 中的锚定引物
Guo Pei-guo，Xu Lan-gui，Xia Yan-shi，Huang Hong-di，Zhang Hua，Zheng Yan-song，Li Rong-hua.
Genetic diversity analysis for germplasm of flowering Chinese cabbage by using fluorescent microsatellite-anchored fragment length polymorphism.
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tf(TTA)6G 与 mAAG、mCTT 和 mCAA 等引物组合的扩增产物]，亦存在一些引物组合扩增产物的
条带较少且种质间多态性偏少或不能完全确定是否有多态性，扩增出的条带虽多但无多态性或多态
性较少的情况[如图 2 中锚定引物 tf(TTA)6G 与 mGAT、mGTA 和 mTTA 等引物组合]。经过比较分
析后发现，9 对引物组合在 4 个菜薹种质材料间的扩增产物清晰易辨且具有较多的多态性条带；这
些引物组合为 tfGGTC(ATT)5/mAGG、tfGGTC(ATT)5/mCAA、tfGGTC(ATT)5/mCTC、tfGGTC(ATT)5/
mCAG、tfCCTA(CA)7/mAAG、tfCCTA(CA)7/mCTC、tfCCTA(CA)7/mCTT、tfCCTA(CA)7/mGTA 和
tf(TTA)6G /mCTCT，它们可用于菜薹种质材料的 MFLP 分析。
2.3 菜薹种质材料 MFLP 标记的多态性
利用筛选出多态条带较多且清晰的 9 对选择性扩增引物组合，对供试的 32 份菜薹种质材料进
行基因分型分析。9 对引物组合共扩增出 839 个条带，其中具有多态性的条带为 159 个（表 3），多
态性条带占总扩增条带的 19.07%，其中每个选择性扩增引物组合可以得到 10 ~ 31（平均 17.7）条
清晰易辨的多态性条带，表明 32 份菜薹种质材料间存在较多的 DNA 多态性。这些多态性条带的大
小主要在 100 ~ 550 bp 之间。

表 3 选择性扩增引物组合在 32 份菜薹种质材料中的多态率、多态性信息量和标记指数
Table 3 Polymorphic rate，polymorphic information content and marker index of selective primer
pairs in 32 accessions of flowering Chinese cabbage
引物组合
Primer combination
扩增带数
No. of amplification
band
多态性条带数
No. of polymorphic band
多态率/%
Polymorphic rate
多态性信息量
Polymorphic
information content
标记指数
Marker index
tfGGTC(ATT)5/mAGG 53 15 28.30 0.76 11.40
tfGGTC(ATT)5/mCAA 105 23 21.90 0.95 21.85
tfGGTC(ATT)5/mCTC 105 10 9.52 0.63 6.30
tfGGTC(ATT)5/mCAG 70 13 18.57 0.68 8.84
tfCCTA(CA)7/mAAG 84 31 36.90 0.98 30.38
tfCCTA(CA)7/mCTC 96 21 21.88 0.91 19.11
tfCCTA(CA)7/mCTT 167 17 10.78 0.83 14.11
tfCCTA(CA)7/mGTA 102 19 18.63 0.88 16.72
tf(TTA)6G /mCTCT 57 10 17.54 0.64 6.40
平均 Average 93.2 17.7 19.07 0.81 11.40
注：“tf”代表 M13 荧光引物序列，“m”代表预扩增中 MseⅠ引物序列。
Note：“tf”represents the sequence of M13 fluorescent primer，“m”indicates the sequence of MseⅠprimer in preamplification.

从表 3 可见，本试验选择的 9 对选择性扩增引物组合扩增产物的 PIC 值为 0.63 ~ 0.98，其中以
tfCCTA(CA)7/mAAG 组合最高（PIC = 0.98），tfGGTC(ATT)5/mCTC 引物组合最低（PIC = 0.63），平
均为 0.81。所有引物组合扩增产物的 PIC 值均超过 0.5，表明这些引物组合的扩增产物可产生高度
多态性位点（Bostsein et al.，1980；白盼 等，2012）。另外，9 个选择性引物组合的平均 MI 值为 11.4，
其中 tfCCTA(CA)7/mAAG 引物组合的 MI 值最高，达到 30.38；tfGGTC(ATT)5/mCTC 引物组合的
MI 值最低，为 6.3；基本表现出具有较高 PIC 值的同时亦具有较高的 MI 值。
上述 MFLP 多态性分析结果表明，选用的引物组合在 32 份菜薹种质材料中扩增产物的多态性
均较高。
2.4 菜薹种质材料的聚类分析
根据 9 对选择性标记检测出的 159 个等位基因多态性，利用 NTSYSpc-2.02i 软件分析 32 份菜薹
种质材料的遗传相似系数（Genetic similarity，GS）。结果表明，这些种质材料的遗传相似系数在 0.277
郭培国，许兰桂，夏岩石，黄红弟，张 华，郑岩松，李荣华.
菜薹种质遗传多样性的荧光 MFLP 标记分析.
园艺学报，2015，42 (2)：350–360. 357

至 0.836 之间。其中‘油绿 50 天’与‘油青 50 天–2’、‘油青 50 天–2’与‘杂交菜心 003’两组
材料的遗传相似系数最大，均为 0.836，说明这两组材料遗传背景非常相似。而‘12 号菜心’与‘柳
叶油绿 50 天’之间的遗传相似系数最低，为 0.277；此外，‘12 号菜心’与‘翠绿 80 天菜心’、‘迟
心 2 号’、‘油青 50 天–2’、‘杂交菜心 003’均低于 0.4。遗传相似系数低于 0.4 的还有‘柳叶油绿
50 天’与‘油绿 501’、‘柳叶油绿 50 天’与‘迟心杂交 2 号菜心’、‘四九 19 菜心’与‘油绿 50
天’、‘迟心杂交 2 号菜心’与‘绿宝 70 天’，表明这些材料的亲缘关系较远，遗传差异比较大。
利用遗传相似系数进行的聚类分析结果如图 3 所示，在遗传相似系数为 0.56 处可将 32 份菜薹
材料划分为两个组群，分别命名为组群Ⅰ和组群Ⅱ。其中，组群Ⅰ共包含‘四九 19 菜心’和‘油绿
501’等 13 个菜薹种质材料，在相似系数为 0.65 处可分为两个亚群；亚群 1 含有‘四九 19 菜心’
等 4 个菜薹材料，亚群 2 包括‘绿 501’等 9 个菜薹材料。组群Ⅱ包括‘油绿 50 天’和‘迟心 2 号’
等 19 个菜薹种质材料，在相似系数为 0.63 处可分为两个亚群；亚群 1 含有‘柳叶油绿 50 天’和‘油
绿 50 天’等 14 个菜薹材料，亚群 2 含有‘翠绿尖叶菜心’和‘迟心 2 号’等 5 个菜薹材料。

图 3 32 份菜薹种质材料遗传多态性的 UPGMA 聚类图
Fig. 3 UPGMA dendrogram depicting patterns of genetic diversity for 32 accessions of flowering Chinese cabbage
3 讨论
3.1 菜薹荧光 MFLP 标记技术
RAPD 和 ISSR 标记是目前在菜薹研究中应用得较多的分子标记（谭雪 等，2009；陈兆贵和王
Guo Pei-guo，Xu Lan-gui，Xia Yan-shi，Huang Hong-di，Zhang Hua，Zheng Yan-song，Li Rong-hua.
Genetic diversity analysis for germplasm of flowering Chinese cabbage by using fluorescent microsatellite-anchored fragment length polymorphism.
358 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (2)：350–360.
愈，2010；孙雪梅 等，2010）。但 RAPD 技术存在稳定性和重现性较低的不足，ISSR 技术扩增产
物的重现性和稳定性类似于或略高于 RAPD（McGregor et al.，2000）。已在很多作物上大量应用的
AFLP 技术的重现性和稳定性较高，多态性丰富，适合于连锁图谱的构建和关联分析（Yang et al.，
2001；Guo et al.，2008），但它与 RAPD、ISSR 等标记一样，为显性标记，并且难以将其中感兴趣
的多态性转换成序列特异性且操作简便的 PCR 标记（Yang et al.，2001）。MFLP 标记具有多态性丰
富、重复性和稳定性好、且有 20%左右的标记为共显性等优点，在运用 MFLP 技术开展遗传分析的
同时，还可发现具有多态性的 SSR 标记（Yang et al.，2001；Lin et al.，2009），并且较易将多态性
转换成特定序列扩增（sequence characterized amplified regions，SCAR）标记（Yang et al.，2002；
Lin et al.，2009；许兰桂 等，2012b）。
自 Yang 等（2001）利用羽扇豆（Lupinus angustifolius L.）建立以放射性同位素检测 MFLP 标
记技术以来，MFLP 技术在作物的遗传多样性、遗传图谱的构建、QTL 定位等分子育种领域取得不
少成绩（Yang et al.，2002；Lin et al.，2009；Sadeghzadeh et al.，2010；Shahidul et al.，2013）。该
技术预扩增引物采用的引物组合为 MseⅠ-N（N 为任一碱基）和 SSR 锚定引物，但作者在对菜薹的
研究中直接应用该引物组合的预扩增产物大小范围较窄，主要在 150 ~ 500 bp，利用此预扩增产物
进行的选择性扩增，条带和多态性较少，效果不很理想；其次还需进行多次的酶切、连接和预扩增
反应，提供模板给不同的选择性扩增引物组合。据此，本研究中除去 MseⅠ-N 引物中的 N，预扩增
引物组合为 MseⅠ引物和 SSR 锚定引物，建立的菜薹预扩增反应的产物大小范围较广，主要分布在
100 ~ 700 bp，以此为模板的选择性扩增的效果较为理想。其主要原因可能是菜薹的基因组（~ 480
Mb）小于羽扇豆的基因组（~ 930 Mb）。
在菜薹荧光 MFLP 技术体系中，可直接购买具有荧光的锚定引物，但存在使用效率较低和成本
过高的问题；而采用通用的荧光标记 M13 接头，荧光可连接到任一普通的锚定引物，保证检测效果
一致，达到减少试验费用的目的；在此情况下，根据本研究团队在其他作物上建立的荧光 MFLP 技
术基础上（何其芳 等，2012），在菜薹材料的选择性扩增中使用 M13 通用荧光接头，能较好地检测
菜薹的选择性扩增产物，发现菜薹种质材料间存在的 DNA 多态性。当然，荧光 MFLP 标记技术也
存在一些不足，例如，与 RAPD 和 ISSR 等标记相比，荧光 MFLP 标记技术的操作相对较复杂，荧
光引物及 DNA 大小标样的价格相对于普通引物价格高，用于检测分析荧光标记需要有专门的设备
且价格较高（如 LICOR 4300S DNA 遗传分析仪）等。
3.2 菜薹种质材料的遗传多样性
谭雪等（2009）利用 RAPD 对 31 份菜薹种质材料进行了遗传多样性分析，筛选出的 15 对 RAPD
引物组合共发现 43 条多态性条带，分析得出 31 份菜薹种质材料的遗传相似性系数在 0.5909 ~ 0.9545
之间；孙雪梅等（2010）利用筛选出的 12 个 ISSR 引物，分析 27 份菜薹材料的遗传多样性，发现
了 56 个多态性位点，27 份菜薹材料的遗传相似系数在 0.7087 ~ 0.9709 之间，表明供试的菜薹材料
的遗传变异较小。与 RAPD 和 ISSR 分子标记相比，本研究中利用荧光 MFLP 标记技术和 9 对选择
性扩增引物组合检测到 32 份菜薹种质材料中存在 159 个等位变异，平均 17.7 个；各个引物组合的
多态性信息量均超过 0.5，平均为 0.81，属于高度多态性位点；表明 MFLP 标记明显优于 RAPD 和
ISSR 标记。遗传多样性分析表明，32 份菜薹种质的遗传相似系数在 0.277 ~ 0.836 之间，平均 0.624；
这一结果表明供试的菜薹种质材料的遗传多样性较高。聚类分析将 32 份菜薹种质分为两个组群和 4
个亚群，油绿、深绿和黄绿类型的菜薹材料均分散在各个组群和亚群之间，同样迟熟、中熟和早熟
菜薹材料的分布也分散在各个组群和亚群之间，表明供试的各类型菜薹材料其遗传背景已相互混杂；
郭培国，许兰桂，夏岩石，黄红弟，张 华，郑岩松，李荣华.
菜薹种质遗传多样性的荧光 MFLP 标记分析.
园艺学报，2015，42 (2)：350–360. 359

这可能是由于菜薹种质资源材料较少，育种工作者在菜薹品种选育中常采用不同类型菜薹相互杂交
所致。
值得一提的是，本研究的结果与谭雪等（2009）和孙雪梅等（2010）选用的菜薹种质材料有 3
份相同，分别为‘四九 19 号菜心’、‘油绿 50 天’和‘迟心 2 号’。从聚类分析结果来看，谭雪等（2009）
将供试的 31 份菜薹种质分为 4 个组群，其中‘四九 19 号菜心’和‘迟心 2 号’属于同一组群的同
一亚群，‘油绿 50 天’为另一组群；孙雪梅等（2010）将供试的 27 份菜薹种质分为 6 个组群，‘四
九 19 号菜心’、‘油绿 50 天’和‘迟心 2 号’均属于不同的组群；而本研究结果显示供试的 32 份菜
薹种质材料可划分为两个组群和 4 个亚群，‘油绿 50 天’和‘迟心 2 号’属于同一组群但在不同的
亚群，‘四九 19 号菜心’在另一组群，与采用较多多态性标记进行聚类分析的孙雪梅等（2010）的
结果相近，表明多态性标记的数量与遗传多样性分析的结果相关；此外，不同类型的分子标记可能
也影响遗传多样性分析的结果。
本试验荧光 MFLP 技术在菜薹的成功应用，不仅能为菜薹种质材料的遗传多样性分析与应用提
供数据，还可为开发出菜薹的 SCAR 标记、促进菜薹 DNA 分子标记技术的发展提供参考。

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