全 文 ：园艺学报，2016，43 (7)：1377–1382.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0013；http：//www. ahs. ac. cn 1377
收稿日期：2016–03–23；修回日期：2016–05–30
基金项目：国家自然科学基金项目（31360475）；贵州省重大科技专项（黔科重大专项字 20136006-1）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：anhuaming@hotmail.com）
Ca2+和 Cu2+对刺梨果实 AsA 代谢相关基因表达
的影响
李良良，安华明*
（贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025）
摘 要：以‘贵农 5 号’刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为材料，采用离体浸泡处理的方法研究了外源
Ca2+和 Cu2+两种金属离子对刺梨果实抗坏血酸（AsA）含量及其相关代谢基因表达的影响。结果表明：Ca2+
对刺梨果实中 AsA 的积累有促进作用，而 Cu2+则引起 AsA 含量明显降低。实时荧光定量 PCR 分析表明，
添加 Ca2+对 L–半乳糖途径中的基因 GalLDH 和 GPP 以及再生途径中的基因 DHAR 和 MDHAR 的表达有
显著的上调作用，说明 Ca2+参与了刺梨果实 AsA 合成和代谢相关基因转录水平的调控；而外源 Cu2+除对
AsA 合成途径的 GalLDH 和 GGP 两个基因表现出较小幅度的下调作用外，对分解代谢过程的基因并未有
明显的上调效应，意味着 Cu2+并不是主要在基因转录水平促进 AsA 的氧化。
关键词：刺梨；Ca2+；Cu2+；抗坏血酸；基因表达
中图分类号：S 661.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）07-1377-06

Effects of Exogenous Divalent Cations Ca2+ and Cu2+ on Expression of
Genes Involved in Ascorbate Metabolism in Rosa roxburghii Fruits
LI Liang-liang and AN Hua-ming*
（Agricultural College，Guizhou University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guiyang 550025，
China）
Abstract：Fruits of Rosa roxburghii Tratt‘Guinong 5’were used to investigate the effects of divalent
cations of Ca2+ and Cu2+ on expression of the genes involved in L-ascorbic acid（AsA）biosynthesis and
accumulation using the methods of incubation in vitro. The results showed that exogenous Ca2+ had a
positive role in promoting AsA accumulation，while Cu2+ accelerated AsA degradation during incubation.
Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression of GalLDH and GPP in L-galactose
biosynthetic pathway and DHAR and MDHAR in recycling pathway upregulated sigificantly when fruit
flesh tissues was incubated with Ca2+，indicating that this divalent cation took part in the regulation of gene
transcription. Exogenous Cu2+ showed a slight exhibition of GalLDH and GGP expression but failed to
down-regulate the expression of AAO or APX，which suggests that AsA degradation incubating Cu2+
occuerrd not primarily on the transcription level.
Key words：Rosa roxburghii；Ca2+；Cu2+；ascorbic acid；gene expression

Li Liang-liang，An Hua-ming.
Effects of exogenous divalent cations Ca2+ and Cu2+ on expression of genes involved in ascorbate metabolism in Rosa roxburghii fruits.
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目前对于高等植物抗坏血酸（AsA）的生物合成途径及参与的基因已基本清楚，包括主要途径
L–半乳糖途径（Wheeler et al.，1998），支路途径 D–半乳糖醛酸途径（Agius et al.，2003）、L–古
洛糖支路（Wolucka & van Montagu，2003）和肌醇途径（Lorence et al.，2004），主要涉及的基因如
表 1。AsA 在植物细胞内的氧化分解主要由抗坏血酸氧化酶（Asorbate oxidase，AAO）和抗坏血酸
过氧化物酶（Asorbate peroxidase，APX）催化（Stasolla & Yeung，2001），并可以通过单脱氢抗坏
血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDAR）和脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate
reductase，DHAR）的作用还原，从而实现 AsA 的循环再生。在此基础上进行 AsA 代谢的调控已成
为当前研究的热点。
发现金属离子对植物AsA合成的调控作用始于对L–半乳糖途径中L–半乳糖–1,4–内酯脱氢
酶（GalLDH）的研究，Imai 等（1998）及 Yabuta 等（2000）发现低浓度的 Cu2+或 Zn2+等离子能有
效抑制烟草和甘薯 GalLDH 活性，但同为二价金属离子的 Ca2+、Mg2+等即使是高浓度对花椰菜
GalLDH 活性也无任何影响（Østergaard et al.，1997）。本课题组前期研究发现 Ca2+对刺梨果实中 AsA
的合成和积累有积极的促进作用，而 Cu2+则显著抑制 GalLDH 酶活性和 AsA 积累（张雪 等，2012）。
迄今类似研究只有生理生化水平上的信息，而关于这两种金属离子是否也参与了基因表达的调控目
前还未有报道。由于 Ca2+作为第 2 信使元素可参与细胞诸多复杂的生理过程，而 Cu2+本身就能直接
高效催化 AsA 的氧化（谢笔钧，2004），因此两种元素对于植物 AsA 合成和积累调控的参与机制可
能不尽相同。在前期工作的基础上，本研究中以 AsA 含量高的刺梨果实为材料，分析对 AsA 积累
效应相反的两种金属离子（Cu2+和 Ca2+）对 AsA 代谢相关基因表达的影响，以期在分子水平为揭示
这一特殊果实 AsA 积累的调控机制提供更多信息。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
试验于 2015 年在贵州省果树工程技术研究中心进行。供试材料为刺梨（Rosa roxburghii Tratt）
7 年生优良无性系‘贵农 5 号’，种植于贵州大学刺梨种质资源圃。
于 AsA 积累最快的 7 月取刺梨树中上部大小基本一致的果实，置于分别含有 2 mmol · L-1
CuSO4、CaSO4 的 15 mmol · L-1 葡萄糖溶液中，以葡萄糖溶液为对照（Davey et al.，2004）。每个处
理 5 ~ 6 个果实（每个果实纵切均分为 4 份），重复 3 次。处理从上午 8 时开始，于光照培养箱中分
别培养 0、12、24 和 48 h 后取样（取每个果实的 1/4）。期间 8：00—19：00 提供 3 000 lx 光照，温
度为 25 ℃。
各样品用蒸馏水冲洗并经液氮处理后保存于–70 ℃备用。
1.2 AsA 测定
参考王乐乐和安华明（2013）的方法提取和测定 AsA 含量，AsA 标样购于 Sigma 公司。每个样
品重复 3 次以上，用 DPS 统计分析系统对数据进行分析。
1.3 AsA 合成相关基因的实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）
RNA 的提取采用 CTAB-LiCl 方法（Chang et al.，1993），纯化的 RNA 用 RNA PCR Kit Ver.2.1
（TaKaRa）逆转录成 cDNA。
李良良，安华明.
Ca2+和 Cu2+对刺梨果实 AsA 代谢相关基因表达的影响.
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图 1 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 含量的影响
Fig. 1 Effects of Cu2+and Ca2+ on AsA content in
Rosa roxburghii flesh
反转录得到的 cDNA 进行实时荧光定量 PCR 分析，PCR 所用的仪器为 ABI ViiA 7 DX system
（Applied Biosystems，USA)，反应试剂为 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）（TaKaRa），
以 UBQ 为内参基因（张雪 等，2012），不同样品得到的数据经内参基因均一化处理后，通过 2-∆∆CT
法计算出待测基因相对表达量。试验中所用的引物见表 1。

表 1 用于荧光定量 PCR 的引物序列
Table 1 Sequences of specific primers used in quantitative real-time PCR analysis
编号
Number
基因
Gene name
基因注释
Gene annotation
引物对序列（5′–3′）
Primer sequence（5′–3′）
基因序列号
GenBank accession
1 GME GDP–甘露糖–3′,5′–差向异构酶
GDP-mannose-3′,5′-epimerase
F：TCATTTTCTTATCCCAACTTCTC
R：CAACAAGCTAGATATACAACGGG
HM234687
2 GGP GDP–L–半乳糖磷酸化酶
GDP-L-galactose phosphatase
F：TCGCTATGATGTCACTGCTTG
R：AGCATTCACTTCTTGGAACCT
HM998753
3 GPP L–半乳糖–1–磷酸磷酸酶
L-galactose phosphatase
F：ATGGCCAAAAACGATTCATACTC
R：AGCTTTCAGTTCCTTTAGAATTTC
HM234683
4 GDH L–半乳糖脱氢酶
L-galactose dehydrogenase
F：GCCGAGGCATCAACTTCTTT
R：CGTCAGCATAGCGTCCACA
HM234684
5 GalLDH L–半乳糖–1,4–内酯脱氢酶
L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase
F：ATGCCCACGAGAAGAAATCC
R：TCCTTATCCACCTCCAAAACCT
AY643403
6 MIOX 肌醇加氧酶
Myo-inositol oxygenase
F：GAAGACTGGCTTCACTTGAC
R：ACTGTTGCTGTACTTCGGAT
HM234686
7 GalUR D–半乳糖醛酸还原酶
D-galacturonic acid reductase
F：GATGCCGGACCTGGAAACT
R：ACTTGATGATGCCGAGATGG
HM234685
8 AAO 抗坏血酸氧化酶
Ascorbate oxidase
F：AATGGCGGATACACCAAGT
R：ATGGAGCCCAAGTAAGGAG
KC782561
9 APX 抗坏血酸过氧化物酶
Ascorbate peroxidase
F：CATCGACAAGGCCAAGAG
R：CGAGACGGAGCATGAGAG
KC782562
10 MDHAR 单脱氢抗坏血酸还原酶
Monodehydroascorbate reductase
F：CTATGGCGATAATGTTGGTGA
R：ACTTGGGCTTTGGTGAGGT
KC782568
11 DHAR 脱氢抗坏血酸还原酶
Dehydroascorbate reductase
F：TGGGTCTCTGATTCTGATGT
R：CCTTGCTCTTGAGGAATGTC
KC782570
12 UBQ 多聚泛素酶
Ubiquitin
F：ATGCAGATYTTTGTGAAGAC
R：ACCACCACGRAGACGGAG
JQ178264
2 结果与分析
2.1 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 含量的影响
刺梨离体条件下 48 h 内，对照的果肉由
于氧化作用，AsA 含量缓慢下降，Ca2+处理的
缓慢上升，Cu2+处理的一直快速下降，在 48 h
下降了约 75%（图 1），表明 Ca2+对 AsA 合成
有促进作用，而 Cu2+的存在加速了 AsA 的分
解。
以上结果与之前的研究结果（张雪 等，
2012）一致，再次证明了 Cu2+和 Ca2+两种金属
离子对 AsA 合成和积累具有截然不同的调控
作用。
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2.2 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 合成相关基因表达的影响
实时荧光定量 PCR 分析表明，Cu2+和 Ca2+对 AsA 合成途径基因表达的影响不尽相同（图 2）。
L–半乳糖途径中：GME 和 GDH 在 3 种喂饲液处理下的表达变化趋势相似，只是在 Ca2+处理的
48 h 时表达稍有上调。在 Ca2+处理下表达上调幅度最大的是 GPP，24 h 上调了 3 倍以上并在 48 h
仍维持高水平表达；其次是 GalLDH，48 h 上调了约 1 倍（对照也有一定程度的上调），而 Ca2+对
GGP 的表达并未有明显影响。添加 Cu2+对 L–半乳糖途径中的 GPP 和 GalLDH 表达有一定的下调
作用。3 种喂饲液处理下 D–半乳糖醛酸途径中的 GalUR 及肌醇途径中的 MIOX 的表达有起伏变化，
两种金属离子的影响没有明显的规律性。

图 2 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 合成相关基因表达的影响
Fig. 2 Effects of Cu2+and Ca2+ on relative expression level of genes involved in
AsA biosynthesis of Rosa roxburghii flesh
李良良，安华明.
Ca2+和 Cu2+对刺梨果实 AsA 代谢相关基因表达的影响.
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2.3 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 循环相关基因表达的影响
胞内 AsA 库除了由其生物合成决定外，还受氧化和再生过程的影响。对参与 AsA 氧化分解的
基因 AAO 和 APX 以及参与再生过程的 MDHAR 和 DHAR 的表达水平进行分析发现，添加 Ca2+明显
促进了 MDHAR 和 DHAR 的上调；添加 Cu2+的处理，相较于对照和 Ca2+处理，Cu2+似乎并未明显促
进刺梨果实中 AAO 或 APX 基因的表达。与对照相比，Cu2+对 MDHAR 并没有表现出规律性变化，
对 DHAR 有小幅度的上调作用（图 3）。

图 3 Cu2+和 Ca2+对刺梨果实 AsA 循环相关基因表达的影响
Fig. 3 Effects of Cu2+and Ca2+ on relative expression level of genes involved in AsA recycling of Rosa roxburghii flesh
3 讨论
虽然高等植物 AsA 合成途径已基本建立，但迄今对于其关键基因、影响因子和调控机制并不完
全清楚。早期对于金属离子调控 AsA 合成的研究起始于合成途径尚未完全建立之前，并主要来自于
生理生化试验的信息，而对其在基因表达水平上的研究未涉及。作者团队在前期的研究中广泛筛选
了多种金属离子，从中发现 Ca2+和 Cu2+两种离子对刺梨果实 AsA 积累具有截然相反的效应，并有
可能参与了合成和分解的调控过程（张雪 等，2012），但还不清楚它们是否在分子水平上参与调控
基因表达。
本研究中显示，外源 Cu2+除对 AsA 合成途径的两个基因（GalLDH 和 GGP）表现出很小幅度
的下调作用外，对参与 AsA 氧化分解代谢的基因（AAO 或 APX）并未有明显的促进效应，由于 Cu2+
本身就是 AsA 的高效氧化剂（谢笔钧，2004），意味着 Cu2+对 AsA 积累的抑制作用主要来自于其本
身的强氧化性，而非在基因表达水平促进 AsA 的分解代谢。
钙不仅是植物重要的营养元素，Ca2+作为胞内第二信使参与包括信号转导、抗逆反应、基因表
达调控等诸多复杂的生理过程（孙大业 等，2000）。在前期工作已得出 Ca2+可以在生化水平影响刺
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梨果实 AsA 合成酶活性的基础上，本研究中发现它还可通过调节基因转录来影响 AsA 的合成和积
累。Ca2+对 AsA 积累的正调控作用不仅体现在其对合成基因（主要是 L–半乳糖途径中的 GPP 和
GalLDH）的上调，而且还上调了再生途径中 DHAR 和 MDHAR 两个还原酶基因的转录水平，这意
味着 Ca2+可以通过促进 AsA 的生物合成和循环再生来实现对 AsA 积累的正调控。植物体内 AsA 本
身广泛参与了包括生长发育、光合作用、氧化响应、信号转导等多种代谢过程（安华明 等，2004），
那么这是否也是Ca2+发挥其广泛生理功能的途径之一？今后开展两者互作机制的深入研究有望获得
更多理论信息，同时也为生产上通过增施钙肥提高维生素 C 含量和果实品质提供更多实践依据。

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