全 文 ：园艺学报，2016，43 (5)：817–828.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0873；http：//www. ahs. ac. cn 817
收稿日期：2016–01–18；修回日期：2016–05–19
基金项目：国家自然科学基金项目（31401820）；中央高校基本科研业务费专项基金项目（KJQN201538）；江苏省自然科学基金项目
（BK20140702）；江苏省苏北科技发展计划项目（BN2012035）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wlj@njau.edu.cn）
5-ALA 诱导的黄酮醇积累参与调节苹果叶片气
孔开度
刘龙博，安玉艳，熊丽君，汪良驹*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：以苹果离体叶片为材料，发现外源 5-ALA 处理可以诱导下表皮保卫细胞内黄酮醇含量显著
上升。在 5-ALA 预处理抑制外源 ABA 诱导气孔关闭的同时，叶片保卫细胞 ROS 含量下降，而用外源槲
皮素及山奈酚等黄酮醇预处理，也抑制了 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭，并且降低保卫细胞 ROS 含量。
此外，槲皮素和山奈酚可以抑制外源 H2O2 诱导的苹果叶片气孔关闭。以上结果喻示，5-ALA 诱导苹果叶
片气孔开放与其上调保卫细胞中黄酮醇含量而后降低活性氧含量有关。
关键词：苹果；ABA；5-ALA；黄酮醇；气孔开度；保卫细胞
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）05-0817-12

Flavonols Induced by 5-aminolevulinic Acid are Involved in Regulation of
Stomatal Opening in Apple Leaves
LIU Long-bo，AN Yu-yan，XIONG Li-jun，and WANG Liang-ju*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：Using diphenylboric acid 2-amino ethyl ester（DPBA），a flavonol fluorescent dye，and a
laser scanning confocal microscope（LSCM），we found that an increase of flavonol fluorescence appeared
in the guard cells of the abaxial epidermis of detached leaves of apple（Malus  domenstica Korkh.
‘Fuji’），especially around the nucleus，after 5-ALA pretreatment for 2–4 h. 5-ALA pretreatment also
inhibited ABA-induced stomatal closure，which was inseparably related to the reduction of the reaction
oxygen species（ROS）accumulation. Coincidently，pretreatment of quercetin or kaempferol，two kinds
of natural flavonols，also inhibited stomatal closure induced by ABA，and meanwhile decreased ROS
content in the guard cells of apple leaves. Furthermore，the exogenous flavonols eliminated the effect of
H2O2 that induced stomatal closure in apple leaves. Together with these above，it can be deduced that
5-ALA-induced stomatal opening is associated with its up-regulation of flavonol levels in guard cells，
which then eliminates ROS levels. Therefore，flavonols are involved in stomatal regulation induced by
5-ALA in apple leaves.
Key words：apple；ABA；5-ALA；flavonol；stomatal aperture；guard cell

Liu Long-bo，An Yu-yan，Xiong Li-jun，Wang Liang-ju.
Flavonols induced by 5-aminolevulinic acid are involved in regulation of stomatal opening in apple leaves.
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业已明确，气孔开度受到诸多因素影响，其中，黑暗（She et al.，2004）、UV-B（He et al.，
2005）、ABA（Pei et al.，2000）、乙烯（Desikan et al.，2006；Ge et al.，2015）、茉莉酸甲酯（Suhita
et al.，2004）、芸薹素内酯（Shi et al.，2015）、H2O2（Murata et al.，2001；Zhang et al.，2001；
Kwak et al.，2003）等均能诱导气孔关闭，而光照（She et al.，2004）、IAA（Pemadasa，1982；She
& Song，2006）、CTK（Morsucci et al.，1991；Chen et al.，1996）等处理往往增大气孔开度。目前
学术界有关气孔运动的研究多半集中于关闭调节（Acharya & Assmann，2008）。相对而言，有关气
孔开放调节的研究则少了许多。实际上，气孔开放至少与关闭过程一样重要，研究其调节机制同样
具有重要的科学意义和生产实用价值。
5–氨基乙酰丙酸（5-ALA）是所有生物体内卟啉化合物生物合成的关键前体，具备多种生物调
节活性（Akram & Ashraf，2013）。汪良驹等（2004a）最早发现，5-ALA 能够促进甜瓜叶片气孔开
放，增加细胞间隙 CO2 浓度，并且认为这是 5-ALA 提高植物光合能力的重要机制。其后，多位学
者（苏常红 等，2006；徐晓洁 等，2008；Youssef & Award，2008；姚素梅 等，2010；Ali et al.，
2013）相继证实了这一效应。张治平等（2008）发现，过量合成 5-ALA 的转基因烟草叶片气孔导度
显著高于野生型，因而从遗传学角度证明，5-ALA 可以诱导叶片气孔开放，提高植物叶片净光合速
率。最近，陈令会等（2014）专门研究了 5-ALA 与苹果叶片气孔开度的关系，发现外源 5-ALA 可
以促进黑暗条件下苹果叶片气孔开度增大，并且抑制 ABA 和 H2O2 诱导的气孔关闭，逆转 Ca2+诱导
的气孔关闭，因而 5-ALA 调节气孔开度涉及一个复杂的细胞生理学过程。业已证明，5-ALA 除了
诱导气孔开放外，它还能诱导植物苯丙烷代谢，促进果实黄酮（陈磊 等，2014）和花青素（汪良驹
等，2004b；郭磊 等，2013；Xie et al.，2013）等次生代谢物质积累。Watkins 等（2014）报道，黄
酮醇可以特异性地积累于气孔保卫细胞，其含量增加可以减少活性氧积累，而后抑制 ABA 诱导气
孔关闭。因而，陈令会等（2014）报道的 5-ALA 诱导的苹果叶片气孔开放是否与黄酮醇积累有关，
值得进一步研究。
本试验中以苹果离体叶片下表皮组织为材料，通过外源药剂处理、荧光染料染色以及激光共聚
焦显微镜（LSCM）观察等方法，研究了黄酮醇类物质在 5-ALA 诱导苹果气孔开放中的作用，试图
为阐明 5-ALA 调节植物生命活动机理及其在农业生产上应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及气孔开度观察
2 年生‘富士’苹果（Malus  domestica Borkh.‘Fuji’）幼苗盆栽于南京农业大学校园内，试验
于 2015 年 6—10 月进行。
选取完全展开的成熟叶片，洗净后置于盛有 Mes-KCl 缓冲液（含 KCl 50 mmol · L-1，Mes 10
mmol · L-1，CaCl2 0.1 mmol · L-1，pH 6.4）的培养皿（Φ12 cm）内，在 25 ℃光照培养箱（240
mol · m-2 · s-1）中悬浮培养 2 h，而后转至含有其他试剂的 Mes-KCl 缓冲液中。
显微观察前用镊子轻轻撕下叶片下表皮，用刀片和毛刷小心除去粘附的叶肉细胞，切成条状（0.5
cm × 0.5 cm），在 Nikon TE100 光学显微镜下连续观察气孔开度（400×）。利用图像采集系统（MShot
Digital Imaging System）拍摄气孔图片，并用测微尺和 Adobe Photoshop 6.0 软件测定数据，获得气
孔开度值。
每个表皮选 15 ~ 20 个视野，每个视野测量 2 ~ 4 个气孔孔径，即每个处理获得 30 ~ 80 个气孔
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值。为了统计方便，每组数据去除相同数量的最大值和最小值，取至少 20 个重复测定的平均值。
1.2 药剂处理及保卫细胞黄酮醇和 ROS 相对含量测定
1.2.1 不同浓度外源 5-ALA 处理对气孔保卫细胞 DPBA 荧光强度的影响试验
将悬浮培养 2 h 的叶片转至添有 0、0.5、5 和 10 mg · L-1 5-ALA 的 Mes-KCl 溶液中哺育 2 h 或 4
h，取出叶片，制备下表皮，参照 Watkins 等（2014）的方法用黄酮醇荧光染料（二苯基硼酸氨基乙
酯，Diphenylboric acid 2-amino ethyl ester，DPBA）染色，在激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal
microscope，LSCM）下观察荧光强度。
1.2.2 5-ALA 预处理对 ABA 诱导的气孔关闭及保卫细胞活性氧荧光强度的影响试验
将悬浮培养 2 h 的叶片转至添有 0.5 mg · L-1 5-ALA 溶液中哺育 2 h 后，转至添有 10 μmol · L-1
ABA 的 Mes-KCl 缓冲液中，每隔 0.5 h 观察 1 次气孔开度，连续观察 2 h。当叶片在 ABA 溶液中悬
浮 1 h 后，取出叶片，制备下表皮，用活性氧（Reaction oxygen species，ROS）荧光染料 H2DCF-DA
孵育染色，在 LSCM 下观察保卫细胞内 ROS 荧光强度，以荧光强度表示 ROS 相对含量。
1.2.3 外源槲皮素和山奈酚处理对苹果叶片气孔保卫细胞 DPBA 荧光强度的影响试验
将叶片光照下悬浮培养 2 h 后，转移至添有 0、1、10 和 100 μmol · L-1 的槲皮素（Quercetin）和
山奈酚（Kaempferol）的 Mes-KCl 缓冲液，1 h 后在 LSCM 下观察 DPBA 荧光强度，以荧光强度表
示黄酮醇相对含量。
1.2.4 外源槲皮素和山奈酚处理对ABA和H2O2诱导的气孔关闭及保卫细胞ROS荧光强度的影响试验
叶片光照下悬浮培养 2 h 后，分别转至含有 10 μmol · L-1 的槲皮素和山奈酚的 Mes-KCl 缓冲液，
处理 1 h 后添加 10 μmol · L-1 ABA 和 200 μmol · L-1 H2O2，在光下连续观察 2 h 内气孔开度变化，并
以各处理 1 h 后的叶片下表皮为材料，观察保卫细胞内 ROS 荧光变化。
1.2.5 保卫细胞黄酮醇荧光探针负载
参照 Watkins 等（2014）的方法，将光下哺育并使用药剂处理后的叶片下表皮浸没在含 0.01%
Triton X-100 和 2.52 mg · mL-1 DPBA 的 Mes-KCl 缓冲液中避光孵育 30 ~ 60 min，使用激光扫描共聚
焦显微镜（LSCM）观测 DPBA 荧光强度。
1.2.6 保卫细胞 ROS 荧光探针负载
参照陈令会等（2014）的方法，把叶片下表皮转移至负载缓冲液（含 10 mmol · L-1 Tris，50
mmol · L-1 KCl，pH 6.5）中，加入 2,7–二氯氢化荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA），终浓度为 50 μmol · L-1，
轻轻摇匀，避光孵育 30 ~ 60 min，以备 LSCM 观测。
2 结果与分析
2.1 苹果叶片下表皮组织中黄酮醇的分布
图 1 显示，经黄酮醇荧光染料 DPBA 染色过的苹果叶片下表皮组织在激光共聚焦下的黄色荧
光斑点与气孔保卫细胞中的叶绿体蓝色自发荧光斑点高度重合，而在表皮细胞中几乎观察不到明
显的黄色荧光聚集，说明黄酮醇特异性地聚积于气孔保卫细胞。尤其引人注目的是，每个气孔的两
个保卫细胞各有 1 个闪亮的荧光聚焦点，与细胞核位置相近，表明黄酮醇主要聚焦在保卫细胞的
核区。
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图 1 黄酮醇在苹果叶片保卫细胞中积累
Fig. 1 Flavonols accumulation in epidermal guard cells of apple leaves

2.2 5-ALA 处理对苹果叶片下表皮保卫细胞中黄酮醇含量的影响
经 0.5 ~ 10 mg  L-1 5-ALA 预处理 2 h 和 4 h 的苹果叶片在 DPBA 染色后下表皮保卫细胞内的黄
酮醇荧光强度极显著高于对照（F > F0.01），说明 5-ALA 预处理能够促进黄酮醇积累（图 2）。

























图 2 5-ALA 预处理诱导黄酮醇在苹果叶片下表皮组织保卫细胞中积累
Fig. 2 Flavonol accumulation in abaxial epidermal guard cells of apple leaves which were
pretreated by 5-ALA for 2 h or 4 h


结果（表 1）表明，5-ALA 预处理 4 h 的黄酮醇荧光强度（除 5 mg  L-1 浓度处理外）与 2 h 在
统计学上没有显著差异（F < F0.05），说明至少在 4 h 内 5-ALA 的效应较稳定。另外，5-ALA 处理浓
度与时间之间不存在互作效应（F < F0.05）。
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从浓度效应上看，0.5 mg  L-1 5-ALA 预处理的荧光强度最强，2 h 和 4 h 预处理为对照的 2.76
和 3.62 倍；5 mg  L-1 5-ALA 预处理的荧光强度其次。即使是 10 mg  L-1 5-ALA 预处理，其荧光强
度也显著高于对照（P < 0.05）。这些结果说明，0.5 ~ 10 mg  L-1 5-ALA 均能显著促进苹果叶片气孔
保卫细胞黄酮醇积累，其中 0.5 mg  L-1 为适宜浓度。


表 1 5-ALA 预处理对苹果叶片保卫细胞中黄酮醇荧光强度的影响
Table 1 Effects of 5-ALA pretreatment on flavonol fluorescence intensity in epidermal guard cells of apple leaves
5-ALA/（mg · L-1） 预处理时间/ h
Pretreatment time 0 0.5 5 10
2 13.05 ± 2.91 de 35.96 ± 2.17 a 29.01 ± 2.91 b 16.65 ± 3.57 c
4 10.56 ± 2.52 e 38.23 ± 1.99 a 23.09 ± 2.17 c 15.84 ± 3.57 cd
注：表中数据为 20 个以上气孔保卫细胞测定平均值 ± 标准误，数据后面相同字母代表在 P = 0.05 水平上差异不显著。
Note：The measured data of the flavonol fluorescence intensity in the table were the means ± standard error of more than 20 stomata apertures,
behind which the same letters represent no significant difference at P = 0.05 level.


2.3 5-ALA 预处理对 ABA 诱导气孔关闭的抑制效应
表 2 显示，在试验观测的 2 h 内，对照叶片气孔开度保持在 4.5 m 左右，5-ALA 处理与对照相
似，多数没有显著变化，而添加10 μmol · L-1 ABA的处理0.5 h后便降低到对照的55%左右（P < 0.05），
并且在观测期间保持在 2.0 m 左右。而在 ABA 处理之前用 5-ALA 预处理，则其气孔开度也明显降
低（P < 0.05），但始终比单独 ABA 处理高出 55%左右（P < 0.05），表明外源 5-ALA 预处理可以显
著削弱 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭效应。

表 2 5-ALA 对 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭的抑制效应
Table 2 The inhibition of 5-ALA on stomatal closure of apple leaves induced by ABA
ABA 处理后不同时间气孔开度/μm
Stomata aperture at different times after ABA treatment
处理
Treatment
ABA/
（μmol · L-1）
5-ALA/
（mg · L-1）
0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h
对照 Control 0 0 4.70 ± 0.18 a 4.72 ± 0.09 a 4.50 ± 0.15 abcd 4.30 ± 0.14 bcd 4.28 ± 0.15 cd
ABA 10 0 4.63 ± 0.17 abc 2.63 ± 0.10 f 1.96 ± 0.13 g 1.92 ± 0.08 g 2.02 ± 0.09 g
5-ALA 0 0.5 4.59 ± 0.10 abcd 4.27 ± 0.14 cd 4.49 ± 0.16 abcd 4.30 ± 0.08 bcd 4.20 ± 0.15 d
ABA + 5-ALA 0 0.5 4.68 ± 0.12 ab 3.59 ± 0.09 e 3.31 ± 0.10 e 3.24 ± 0.10 e 3.24 ± 0.12 e
注：表中数据为 30 个气孔开度平均值 ± 标准误，数据后面相同字母代表在 P = 0.05 水平上差异不显著。
Note：The data in the table were the means ± standard error of about 30 stomata apertures，behind which the same letters represent no significant
difference at P = 0.05 level.

2.4 5-ALA 预处理对 ABA 诱导的苹果叶片气孔保卫细胞 ROS 含量的影响
图 3 显示，经 H2DCF-DA 染色的苹果叶片 ROS 荧光主要聚焦在保卫细胞叶绿体内，而在其它
细胞器中的分布较少，说明叶绿体可能是活性氧产生的主要部位。
对照和 5-ALA 单独处理的叶片下表皮保卫细胞 ROS 荧光强度较低（分别为 16.02 和 16.09），
而在培养基中添加 10 mol · L-1 ABA 处理 1 h 后，保卫细胞 ROS 荧光强度（51.54）显著增加（P <
0.05），约为对照的 3.2 倍，说明外源 ABA 处理可诱导保卫细胞 ROS 含量快速上升。但在添加 ABA
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之前先使用 0.5 mg · L-1 5-ALA 预处理 2 h，则可显著抑制 ABA 诱导的 ROS 荧光强度上升，其荧光
强度（29.15）虽然升高为对照的 1.8 倍，但仅为单纯 ABA 处理的 56%（P < 0.05），说明 5-ALA 预
处理能够抑制 ABA 诱导的苹果叶片气孔保卫细胞的 ROS 积累。
2.5 外源槲皮素和山奈酚预处理对苹果叶片下表皮保卫细胞黄酮醇含量影响
为了探究黄酮醇是否参与气孔运动调节以及是否涉及保卫细胞内 ROS 的清除，利用外源槲皮素
和山奈酚（黄酮醇的主要组分）处理试验材料。
如图 4 所示，1 μmol · L-1 槲皮素和山奈酚处理 1 h 的叶片下表皮的保卫细胞黄酮醇荧光强度
（分别为 10.82 和 9.14）与对照（8.17 和 12.70）无显著性差异。而 10 和 100 μmol · L-1 处理均可
显著诱导内源黄酮醇含量上升（P < 0.05），且两种浓度之间差异不显著（33.62 和 35.34；19.12 和
20.95）。因而，10 μmol · L-1 的槲皮素和山奈酚应为诱导苹果叶片保卫细胞内黄酮醇含量上升的适宜
浓度。
2.6 槲皮素和山奈酚处理对 ABA 诱导的苹果叶片保卫细胞 ROS 含量的影响
图 5 显示，苹果离体叶片经槲皮素或山奈酚预处理 1 h，其下表皮组织经 H2DCF-DA 溶液孵育
后，在 LSCM 下显示出的保卫细胞 ROS 荧光强度（17.89 和 12.33）较低，与对照（14.80）没有显
著差异，而经 10 mol · L-1 ABA 处理 1 h 的保卫细胞 ROS 荧光强度（40.75）显著高于对照，其平
均值为对照 2.75 倍（P < 0.05）。
在 ABA 处理前先经槲皮素或山奈酚处理 1 h，则保卫细胞 ROS 荧光强度（15.91 和 28.05）显
著低于单纯的 ABA 处理（P < 0.05）。槲皮素清除 ABA 诱导的 ROS 积累效应显著高于山奈酚（P <
0.05）。
2.7 槲皮素和山奈酚预处理对 ABA 处理的苹果叶片气孔开度的影响
表 3 结果表明，对照叶片气孔开度约为 4.7 μm，且在检测的 2 h 内保持基本稳定。10 μmol · L-1
ABA 处理 0.5 h 后气孔开度降低为对照的 57%，并且基本维持这一水平。采用 10 μmol · L-1 槲皮素
或山奈酚预处理，1 h 后再添加 ABA 处理，则在 2 h 内气孔开度显著高于单纯的 ABA 处理，其中槲
皮素处理抑制 ABA 诱导气孔关闭的能力明显优于山奈酚处理。


表 3 槲皮素和山奈酚预处理对 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭的抑制效应
Table 3 The inhibition of exogenous quercetin and kaempferol on the stomata closure of apple leaves induced by ABA
气孔开度/μm Stomata aperture 处理
Treatment
槲皮素/
（μmol · L-1）
Quercetin
山奈酚/
（μmol · L-1）
Kaempferol
ABA/
（μmol · L-1）0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h
对照 Control 0 0 0 4.75 ± 0.11 abc 4.76 ± 0.12 abc 4.70 ± 0.11 abcd 4.80 ± 0.20 abc 4.53 ± 0.09 bcd
ABA 0 0 10 4.66 ± 0.10 abcd 2.69 ± 0.12 g 2.47 ± 0.05 g 2.14 ± 0.07 h 2.45 ± 0.11 g
Q 10 0 0 4.88 ± 0.12 a 4.85 ± 0.11 ab 4.76 ± 0.10 abc 4.77 ± 0.13 abc 4.59 ± 0.15 abcd
Q + ABA 10 0 10 4.70 ± 0.11 abcd 4.46 ± 0.10 cd 3.95 ± 0.10 e 3.92 ± 0.14 e 3.69 ± 0.15 e
K 0 10 0 4.84 ± 0.06 ab 4.72 ± 0.07 abcd 4.59 ± 0.04 abcd 4.77 ± 0.09 abc 4.40 ± 0.05 d
K + ABA 0 10 10 4.65 ± 0.04 abcd 3.68 ± 0.09 e 3.09 ± 0.02 f 2.57 ± 0.03 g 2.98 ± 0.04 f
注：Q：槲皮素；K：山奈酚。表中数据为 24 个气孔开度平均值 ± 标准误，数据后面相同字母代表在 P = 0.05 水平上差异不显著。
Note：Q：Quercetin；K：Kaempferol. The data in the table were the means ± standard error of about 24 stomata apertures，behind which the same
letters represent no significant difference at P = 0.05 level.

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图 3 5-ALA 预处理对 ABA 诱导的苹果叶片气孔保卫细胞 ROS 荧光强度的影响
Fig. 3 Effects of 5-ALA pretreatment on ABA-induced ROS accumulation in the guard cells of apple leaves


图 4 外源槲皮素和山奈酚处理对苹果离体叶片保卫细胞黄酮醇荧光强度的影响
Fig. 4 Effects of exogenous quercetin and kaempferol in different concentrations on flavonol fluorescence intensities of
guard cell of detached apple leaves


图 5 槲皮素和山奈酚预处理对 ABA 诱导的苹果叶片下表皮保卫细胞 ROS 荧光强度的影响
Fig. 5 Effects of exogenous quercetin and kaempferol on ROS fluorescence intensity induced by ABA in epidermal
guard cells of apple leaves
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2.8 槲皮素和山奈酚预处理抑制 H2O2 诱导的气孔关闭
为进一步验证外源黄酮醇清除 ROS 及其对气孔开度的影响，使用外源 H2O2 作为活性氧诱导气
孔关闭，同时观察槲皮素和山奈酚的作用。
表 4 显示，对照叶片气孔开度在 2 h 基本维持在 4.7 μm左右。在培养液中添加 200 μmol · L-1 H2O2
后 0.5 h，气孔开度下降为对照的 77%，2 h 时下降为对照的 57%，说明外源 H2O2能够诱导苹果叶片
气孔关闭。然而，使用 10 μmol · L-1 外源槲皮素和山奈酚预处理 1 h 然后再添加 H2O2，则气孔开度
在 0.5 h 时也显著降低（P < 0.05），分别为对照的 78%和 73%，但处理 1 h 时气孔开度约为单独的
H2O2 处理的 1.32 倍和 1.21 倍（P < 0.05），表明外源槲皮素和山奈酚可以抑制外源 H2O2 诱导的气
孔关闭，因而，黄酮醇类物质确实可以消除苹果保卫细胞 ROS 积累。从 H2O2 处理后 1.5 h 和 2 h
的气孔开度看，槲皮素预处理的显著高于山奈酚，再次表明，前者促进苹果叶片气孔开度的效应
大于后者。

表 4 槲皮素和山奈酚对 H2O2 诱导的苹果叶片气孔关闭的抑制效应
Table 4 The inhibition of exogenous Quercetin and Kaempferol on the stomata closure of apple leaves induced by H2O2
气孔开度/μm Stomata aperture 处理
Treatment
槲皮素/
（μmol · L-1）
Quercetin
山奈酚/
（μmol · L-1）
Kaempferol
H2O2 /
（μmol · L-1）0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h
对照 Control 0 0 0 4.76 ± 0.11 ab 4.73 ± 0.08 ab 4.71 ± 0.08 ab 4.72 ± 0.07 ab 4.47 ± 0.09 b
H2O2 0 0 200 4.80 ± 0.13 a 3.66 ± 0.12 cd 2.82 ± 0.07 f 2.62 ± 0.07 f 2.58 ± 0.06 f
Q 10 0 200 4.88 ± 0.11 a 3.69 ± 0.11 cd 3.70 ± 0.12 cd 3.74 ± 0.12 cd 3.66 ± 0.09 cd
K 0 10 200 4.75 ± 0.09 ab 3.44 ± 0.14 cde 3.42 ± 0.08 de 3.33 ± 0.08 e 3.16 ± 0.05 e
注：Q：槲皮素；K：山奈酚。表中数据为 30 个气孔开度平均值 ± 标准误，数据后面相同字母代表在 P = 0.05 水平上差异不显著。
Note：Q：Quercetin；K：Kaempferol. The data in the table were the means ± standard error of 40 stomata apertures，behind which the same letters
represent no significant difference at P = 0.05 level.
3 讨论
或许是因为气孔关闭有利于降低蒸腾强度，减少水分耗散，对于节水农业生产有着重要意义，
有关气孔开度调节机理研究主要集中于关闭调节（Dodd，2003；Acharya & Assmann，2008）。但实
际上，气孔开放也有着重要的科学与生产意义。众所周知，气孔开度增大，有利于 CO2 进入叶肉细
胞，有助于光合作用和光合积累，而且蒸腾拉力增强，可以促进根系吸收水分、养分，提高土壤矿
质元素吸收利用效率，最终促进环境保护与植株生长。在 5-ALA 研究中，Watanabe 等（2000）最
早提出其提高棉花耐盐性的机理可能在于减少 Na+的吸收运输，但是后来研究证明，5-ALA 提高椰
枣耐盐性与其促进叶片光合能力有关（Youssef & Awad，2008），说明气孔开度增大有助于植物耐盐。
Wei 等（2012）提出，5-ALA 处理的白菜植株可以多吸收 17.6%的氮素，因而，植株生长健壮，并
且防止低氮导致的叶片黄化衰老。姚素梅等（2006）以 32P 为材料，研究了喷施 5-ALA 对水稻植株
磷素吸收的影响，发现处理后磷素水平显著提高，同时提高了稻穗结实率与水稻产量。张丽颖等
（2015）发现，根际浇灌 5-ALA 溶液可以提高苹果叶片 Ca、Mg、Fe、Cu 和 Zn 等中量和微量元素
含量。显然，5-ALA 处理导致植物气孔开度增大，不仅有利于光合作用进行，而且有利于营养元素
吸收。


刘龙博，安玉艳，熊丽君，汪良驹.
5-ALA 诱导的黄酮醇积累参与调节苹果叶片气孔开度.
园艺学报，2016，43 (5)：817–828. 825

陈令会等（2014）首次系统地报道了 5-ALA 与苹果叶片气孔开度的关系，发现外源 5-ALA 可
以抑制黑暗、ABA 和 H2O2 或逆转 Ca2+诱导的气孔关闭。这完全合乎目前有关植物叶片气孔运动调
节的一般性理论（Mustilli et al.，2002；Desikan et al.，2006）。他们提出，5-ALA 处理抑制 ABA
诱导的气孔关闭与其下调保卫细胞内 ROS 含量密切相关。本研究结果证实了这一说法。但是，5-ALA
是如何影响 ROS 水平进而调节气孔开度的机理尚不清楚。介于前人已经报道，5-ALA 可以诱导果
树体内次生代谢产物如黄酮（陈磊 等，2014）和花青素（汪良驹 等，2004b；郭磊 等，2013；Xie
et al.，2013）等物质积累，本研究首次提出，5-ALA 可能通过诱导苹果叶片保卫细胞内黄酮醇类物
质积累，进而清除 ROS 并促进气孔开放的观点。目前已经掌握的证据有：1. 苹果叶片下表皮组织
的黄酮醇类物质集中分布于气孔保卫细胞，尤其是细胞核附近，而其它表皮细胞几乎观测不到其存
在。这种分布特点决定了它在气孔保卫细胞中可能有着重要生理功能。2. 保卫细胞内的黄酮醇含量
受到 5-ALA 的促进，并且可以维持较长时间。3. 5-ALA 抑制 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭时，降
低了保卫细胞内的 ROS 含量，而外源黄酮醇类物质包括槲皮素和山奈酚处理都能提高苹果叶片气孔
保卫细胞的黄酮醇荧光强度，也能抑制 ABA 诱导的苹果叶片气孔关闭，同时保卫细胞 ROS 水平显
著下降。4. 外源槲皮素和山奈酚处理可以抑制外源 H2O2 诱导的苹果叶片气孔关闭。5. 外源 5-ALA、
槲皮素、山奈酚等对苹果叶片气孔开放的促进效应与保卫细胞 ROS 含量呈极显著的负相关关系，r =
–0.939***。因而有理由认为，前文（陈令会 等，2014）报道的外源 5-ALA 诱导苹果叶片气孔开度
增大应该与其诱导保卫细胞内黄酮醇积累有关。
有关 5-ALA 诱导植物叶片保卫细胞黄酮醇含量上升是否涉及到相关基因表达，作者在拟南芥上
已经获得了初步结果。经 5-ALA处理的拟南芥离体叶片下表皮组织与黄酮醇积累有关的基因如PAL、
C4H、4CL、CHS、CHI、F3H 及 FLS 等都有不同量的表达上调，尤其是 CHS，经 5-ALA 处理 1 h
后表达量上调 7 倍以上，表明 5-ALA 可以诱导苯丙烷代谢基因表达，促进黄酮醇积累，清除 ROS，
促进气孔开放。但是在苹果上，5-ALA 诱导苯丙烷代谢相关基因表达的效应却不明显（数据未列出）。
这也许是物种间差异，更可能是由于苹果叶片下表皮组织不像拟南芥那样容易分离获得，各种干扰
因素影响了试验效应检测。因而，5-ALA 诱导苹果叶片下表皮组织黄酮醇积累相关基因上调表达的
效应也可能存在，只是需要进一步验证。
诸多研究表明，5-ALA 提高植物抗逆性与其积极参与抗氧化防御有关（Nishihara et al.，2003；
康琅 等，2006；Li et al.，2011；Akram et al.，2012）。陈令会等（2014）也认为，5-ALA 调控苹果
叶片气孔开度时，抗氧化酶活性提高是 H2O2 水平下降的原因。但本结果显示，5-ALA 调控气孔开
放过程中，5-ALA 能够诱导保卫细胞内黄酮醇含量上升参与气孔运动调节；利用外源槲皮素和山奈
酚证实，黄酮醇确实对气孔运动的影响与 ROS 有关。李伟（2011）报道，TaFLS 过表达的小麦植株，
黄酮醇含量显著提高，对盐渍、干旱、H2O2 和 ABA 的耐受性增强，ROS 清除相关酶活性及其编码
基因转录水平明显增强，ROS 含量明显下降。有趣的是，转基因植株叶片气孔开度大于野生型。这
一结果为黄酮醇参与气孔运动调控提供了遗传学证据。但是，植物体内 5-ALA 对气孔运动的调节可
能还存在着其他途径。
综上所述，5-ALA 处理能够促进苹果叶片下表皮保卫细胞苯丙烷代谢，诱导黄酮醇积累，后者
作为抗氧化物质清除 ROS，进而降低 ABA、H2O2 等物质诱导的气孔关闭程度（图 6）。这有利于大
气 CO2 进入叶肉细胞，提高植物叶片光合效率，增加光合积累，增强植物抗逆性。


Liu Long-bo，An Yu-yan，Xiong Li-jun，Wang Liang-ju.
Flavonols induced by 5-aminolevulinic acid are involved in regulation of stomatal opening in apple leaves.
826 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (5)：817–828.


图 6 黄酮醇与 5-ALA 调节气孔运动的关系
实线表示直接调控，虚线表示间接调控；→表示正调控；—|表示负调控。
Fig. 6 The relationship between the regulation of stomatal movement by 5-ALA and flavonols
Solid lines represent direct regulation and dashed lines represent indirect regulation；→ represent positive effects and
—| represent negative effects.

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