全 文 ：园艺学报，2015，42 (8)：1477–1486.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0039；http：//www. ahs. ac. cn 1477
收稿日期：2015–03–17；修回日期：2015–06–11
基金项目：国家星火计划重大项目（2012GA700001）；浙江省科技厅重大科技专项重点农业项目（2012C12002）；浙江省农业新品种选
育重大科技专项（2012C12904-12）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qixiangzh@163.com）
香榧体细胞胚发生、发育的形态与细胞学观察
项伟波 1，赵金凯 2，吴家胜 2，黄坚钦 2，喻卫武 2，吴连海 3，张启香 2,*
（1 浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300；2 浙江农林大学林业与生物技术学院，
浙江临安 311300；3 浙江省丽水市林业科学研究院，浙江丽水 323000）
摘 要：将香榧（Torreya grandis‘Merrillii’）的未成熟合子胚置于 SH + 0.1 mg · L-1 NAA + 500 mg · L-1
AC + 3%蔗糖 + 0.5 g · L-1 Gln 培养基上暗培养 45 d，诱导产生半透明颗粒状胚性愈伤组织；将胚性愈伤
组织转入 SH + 20 g · L-1 PEG + 10 mg · L-1 ABA 培养基中暗培养 3 个月诱导体细胞胚。采用碘—碘化钾
染色和石蜡切片技术对体胚起源、形态发育与细胞组织学进行了观察。结果表明：胚性愈伤组织起源于
合子胚胚轴表皮或皮层细胞的对称分裂。胚性愈伤组织含有两类细胞，一种是细胞质浓厚、细胞核大、
体积小的圆形胚性细胞，另一种是高度液泡化拉长的细胞。胚性愈伤组织包含由这两种细胞构成的原胚
团Ⅰ、原胚团Ⅱ和原胚团 Ⅲ，以及一些游离细胞。原胚团 Ⅲ在无植物生长调节剂的 SH 基本培养基上形
成原胚，原胚接入成熟培养基，历经球形、棒状、心形、鱼雷形胚后发育成子叶胚。将子叶胚转入萌发
培养基后胚根伸长，胚芽发育长出针叶，形成完整的再生植株。同时在离体培养中合子胚胚柄处退化的
裂生多胚也能重新发育形成胚体。在初生体胚发育过程中表面常伴有次生体细胞胚的形成。
关键词：香榧；体细胞胚；起源；发育；形态学；细胞学
中图分类号：S 664.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）08-1477-10

Morphological and Cytological Observation of Somatic Embryogenesis and
Development in Torreya grandis‘Merrillii’
XIANG Wei-bo1，ZHAO Jin-kai2，WU Jia-sheng2，HUANG Jian-qin2，YU Wei-wu2，WU Lian-hai3，
and ZHANG Qi-xiang2,*
（1The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A & F University，Lin’an，
Zhejiang 311300，China；2School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A & F University，Lin’an，Zhejiang 311300，
China；3Lishui Forestry Science Research Institute，Lishui，Zhejiang 323000，China）
Abstract：An immature zygotic embryo of Torreya grandis‘Merrillii’was dark cultured for 45 days
on an SH medium supplemented with 0.1 mg · L-1 NAA，500 mg · L-1 AC，3% sucrose and 0.5 g · L-1 Gln
to induce embryonic callus，which was watery，semi-transparent and slimy. Then the callus was transferred
to SH media supplemented with 20 g · L-1 PEG and 10 mg · L-1ABA and dark cultured for three months for
somatic embryogenesis. The morphological and cytohistological observation of somatic embryogenesis
was performed by iodine-potassium iodide staining and Paraffin technology. Results showed that the
embryonic callus originated from the symmetrical division of epidermal or cortical cells of hypocotyl. The

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callus consisted of two types of cells，viz. small-sized circular cells with dense cytoplasm and highly
elongated vacuolate cells. The two types of cells formed proembryonic masses（PEMs）expressed as PEM
Ⅰ，PEMⅡ，and PEM Ⅲ and some free cells. The PEM Ⅲ cultured in the basic medium without hormones
added developed to form a proembryo，which was then transferred to mature media to form a cotyledon
embryo by being subjected to globular，rodlike，heart-shaped，and torpedo-shaped development. after
transferred to SH media，the cotyledon embryo developed to form an intact plantlet through elongated
radicle and growth of needles from germ. In vitro culture of polyembryony originating from division of
degraded suspensor of a zygotic embryo could also produce idiosome. Development of primary somatic
embryos was often accompanied by the formation of secondary somatic embryos.
Key words：Torreya grandis‘Merrillii’；somatic embryogenesis；origin；development；morphology；
cytology

在过去的几十年时间里，人们对挪威云杉、白云杉、火炬松、辐射松等主要针叶树体胚发生培
养条件（Stasolla & Yeung，2003）、体胚发育过程中的生理代谢（Iraqi & Tremblay，2001；Businge et
al.，2013），形态结构特征（Hakman et al.，1987；Filonova et al.，2000；Budimir，2003）以及基因
表达（Robertson et al.，1992；Misra，1994；Klimaszewska et al.，2005）等方面的研究取得了较好
的成果，同时，发现白云杉（Hakman et al.，1987）、塞尔维亚云杉（Budimir，2003）、挪威云杉（Nagmani
et al.，1987；Lars & Sara，1991；Svobodová et al.，1999；Filonova et al.，2000）、北美云杉（Kristensen
et al.，1994）、杂种落叶松（Gutmann et al.，1996）等针叶树的体细胞胚胎发生与发育具有多样性，
不同的培养条件下体胚的发育具有明显差异。
针叶树种香榧是中国特有的珍稀干果和木本油料植物，是榧树（Torreya grandis Fort.ex Lind.）
中优良变异株经人工嫁接繁殖而成的的优良品种，集果用、油用、药用、材用、绿化观赏为一体，
具有重要的经济、社会和生态价值（黎章矩和戴文圣，2007）。传统嫁接繁殖模式不适应市场巨大需
求，近年来开展了包括体胚发生在内的香榧再生体系建立的研究（姜新兵 等，2004；刘海琳 等，
2007；姚进 等，2013；项伟波 等，2014）。但由于对香榧体胚发生规律缺乏了解，已有的再生体系
不稳定，繁殖效率较低。本试验中以香榧未成熟合子胚为外植体，诱导胚性愈伤组织、体胚，成熟
培养并获得再生植株。通过对胚性细胞诱导，体胚形成和发育过程的形态学和细胞学观察，揭示香
榧体细胞胚胎发生过程中细胞的分裂与分化模式特征，以及发育过程中的结构与形态变化，阐明其
体胚发生的规律，为建立香榧高效体胚发生发育调控技术体系以及体胚途径的遗传转化研究奠定理
论基础。
1 材料与方法
1.1 胚性愈伤组织诱导
2013 年 7 月在浙江农林大学校园植物园采集树龄 20 年左右的香榧（Torreya grandis‘Merrillii’）
母株种子，选择发育正常、大小一致的种子作为供试材料。
将幼果去除绿色假种皮，洗净，流水冲洗 1 h，在超净工作台上用 75%乙醇表面消毒 3 min，无
菌水清洗 3 ~ 4 次，再用 10%次氯酸钠溶液（沪试）真空抽滤 20 min，无菌水冲洗 6 ~ 8 次后备用。
取经表面灭菌后的种核，在无菌条件下沿榧眼剖开，体视镜下剥取完整未成熟幼胚，立即接入
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SH（Schenk & Hildebrandt，1972）+ 0.1 mg · L-1 NAA（Naphthaleneacetic acid，萘乙酸）+ 500 mg · L-1
AC（Activated carbon，活性炭）+ 3% 蔗糖 + 0.5 g · L-1 Gln（Glutamine，谷氨酰胺）培养基上，23 ~
25 ℃，暗培养 45 d，诱导胚性愈伤组织。
1.2 体胚的诱导和成熟胚的萌发
将挑取的胚性愈伤组织，5 mm × 5 mm左右，转接于体胚诱导固体培养基 SH + 0.05 mg · L-1 NAA
中，暗培养 60 d，每 30 d 继代 1 次。同时挑取适量胚性愈伤接入液体培养基 SH + 0.01 mg · L-1 NAA
中，用镊子打散细胞团，振荡暗培养 15 d，每 7 d 继代 1 次，摇床转速 125 r · min-1。诱导产生的原
胚接入体胚成熟固体培养基 SH + 10 g · L-1 PEG6000（Polyethylene glycol，聚乙二醇）+ 5 mg · L-1
ABA（Abscisic acid，脱落酸）中，暗培养 90 d。
将发育成熟的体细胞胚从愈伤组织中挑出，转入 1/2SH + 450 mg · L-1 AC 体胚萌发固体培养基
上进行光照培养。温度 23 ~ 25 ℃，光照周期 16 h · d-1，光照强度 1 500 ~ 2 000 lx，培养室空气相对
湿度 70%左右。待体胚萌发，根伸长，芽端长出针叶后，驯化炼苗，移植基质中栽培。
1.3 体胚发育过程的组织形态学观察
将上述胚性细胞诱导和体胚发育过程中的材料置于 Olympus SZX12 体视显微镜下进行形态学
观察，部分早期阶段材料用碘—碘化钾染色并作徒手压片辅助观察。选取典型样品进行拍照后用
FAA 固定液固定，制作常规石蜡切片，切片厚 8 ~ 10 μm，番红—固绿染色后中性树胶封片，用
Olympus BX60 显微镜观察胚性细胞的形成和体胚的起源及发育过程。
2 结果与分析
2.1 体胚起源的组织形态学观察
研究发现，香榧的体细胞胚胎发生包含直接发生和间接发生两条途径，而胚性细胞起源分为外
起源和内起源。
离体幼胚（图 1，1）在愈伤组织诱导培养基上培养 7 d 后，胚体头部开始膨大，随后形成两片
肥厚的子叶，曲折的胚柄表面有许多凸起的球形体胚，表面光滑。培养 12 d 后，胚轴处逐渐凸起细
胞团，呈不规则形态。培养 22 d 后，细胞团不断增殖，包围整个胚体，呈乳白色水渍状；同时，在
肥厚的子叶表面也开始出现愈伤组织，颜色为黄白色，表面粗糙。幼胚培养 30 d 后，胚柄处可见许
多发育良好的球形胚（图 1，2）。通过显微观察发现，球形胚由合子胚胚柄处的裂生多胚原基发育
而来，原基由质密的顶部小细胞和基部细长的类胚柄细胞组成，基部细胞与合子胚胚柄细胞相连接
（图 1，3）。同时大部分胚体被愈伤组织包围，这一类型的愈伤组织团整体为乳白色，呈半透明颗
粒状，质地疏松，为胚性愈伤组织；而从子叶表面产生的愈伤组织整体为乳黄或浅黄色，质地较紧
密，通常呈团块状，为非胚性愈伤组织。
从组织切片来看，胚体在含有 NAA 的培养基上暗培养 7 d 后，位于胚轴表皮和表皮下方的细胞
层的某些细胞细胞核变大，细胞质变得稠密，随后经过对称分裂，形成胚性细胞团（图 1，4）。培
养 12 d 后，胚性细胞团形成凸起的结节或者长条形的胚性区域（图 1，5）。刚开始它们与外植体紧
密相连，随后发育成明显的球状结构并逐渐与周围的细胞孤立开来，这些细胞体积小、核大、质浓，
结构紧密，易被染色，有丝分裂旺盛，排列规整，与周围细胞体积大小差异较大，与细胞核小，边
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图 1 香榧体胚起源方式的组织形态学观察
1：香榧未成熟合子胚（示曲折胚柄）；2：离体培养的未成熟合子胚（示胚柄处的棒状胚）；3：合子胚胚柄处的裂生多胚原基；
4：外起源的胚性细胞（幼胚表皮层）；5：外起源形成的胚性细胞团；6：内起源的胚性细胞（皮层）；7：内起源产生的
胚性团（可见明显的细胞质浓厚的细胞团并逐渐形成孤立化结节）；8：原胚（顶部出现规则类表皮层细胞）；
9：丝状体原胚丛。ZE：合子胚；Su：胚柄；Cy：子叶；EM：胚性细胞团；SE：体胚；EC：胚性细胞；
Ep：表皮；Es：胚性结构；PD：类表皮层；ET：胚管；Pe：原胚。
Fig. 1 Morphological and histological observation of the origin of somatic embryos of Torreya grandis
1：Immature zygotic of Torreya grandis（the suspensor region）；2：Immature zygotic cultured in vitro（the somatic embryo in the suspensor region）；
3：Cleavage polyembryony in the suspensor of zygotic；4：The embryogenic cells origin in the epidermal；5：The embryogenic cell regions
in the epidermal；6：The embryogenic cells origin in the cortex；7：Embryogenic structure through endogenous origin（Isolated nodular
consist of densely cytoplasmic cells）；8：Proembryo（shown the protoderm-like layer）；9：Filament of the proembryo.
ZE：Zygotic embryo；Su：Suspensor；Cy：Cotyledom；EM：Embryonal mass；SE：Somatic embryo；
EC：Embryonal cells；Ep：Epidermis；Es：Embryogenic structure；PD：Protoderm-like layer；
ET：Embryonal tube cells；Pe：Proembryo.

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缘化，具有大液泡，含少量细胞质，稀薄，不易被染色，排列无规则的非胚性细胞形成鲜明对比。
同样的细胞分裂过程也出现在胚体皮层（图 1，6、7）。从这些大小不一的胚性细胞团中可见单个或
两个以及多个相对孤立的细胞或细胞团。随后胚性细胞团开始分化出现极性，包括细胞质浓厚的头
部圆顶状区域和细胞液泡化伸长的基部。随着发育的进行，顶部的细胞通过垂周分裂形成类表皮层，
中间具有分裂旺盛的胚性细胞团，在极性基部的液泡化细胞不断伸长形成细长丝状的胚柄细胞，进
而整个胚性细胞团发育形成原胚（图 1，8）。
诱导产生的愈伤组织在含有少量或无生长素的增殖培养基中，只有胚性愈伤能持续较快增殖。
显微观察结果表明这些胚性愈伤组织由许多相对独立的胚性细胞团和发育程度不一的原胚团组成。
新的胚性细胞团的生成依靠原有胚性细胞的分裂和分离，并进一步形成原胚团，而原胚团又能通过
细胞不断分裂、结构发育形成原胚，所以在胚性愈伤组织增殖培养基中，愈伤表面形成大量的丝状
体原胚，并且相互独立，能轻易分离（图 1，9）。
2.2 体胚发育过程的形态学观察
利用体视显微镜观察发现：香榧体胚发育过程可分为 3 个阶段。
第一阶段，原胚团阶段（胚柄伸长之前）：由外植体诱导产生的胚性细胞团分离形成含 4 ~ 10
个细胞的紧凑细胞簇（图 2，1），这些细胞细胞质稠密，体积较小，细胞呈圆形。随后某些胚性细
胞液泡化扩大伸长，形成由质密紧凑的细胞丛和单个液泡化的长细胞组成的原胚团（图 2，2）。紧
接着高度液泡化的细胞进一步伸长，紧凑质密的细胞丛也通过细胞分裂不断扩大。3 d 后从紧凑质
浓细胞丛中发育出新的伸长的细胞，这时的原胚团含有多个液泡化的长细胞（图 2，3）。随着两种
类型细胞的增多，原胚团不断变大，这段时期的原胚团一直维持极性结构。10 d 后随着质浓细胞的
增殖速率加快，极性结构和明显的质密细胞中心丧失，形成由质密小细胞、圆形中等细胞和液泡化
大细胞组成的原胚团（图 2，4）。此发育阶段一直持续约 20 d，在原胚团外围形成体胚（图 2，5、
6）。体胚含有一个相对较小由质密小细胞组成的胚性头部，从形态上看呈半透明的乳白色，富含蛋
白质，碘—碘化钾染色后为黄色。从胚性区域到胚柄区域有一个逐步的形态变化，中间部分细胞为
椭圆形，富含淀粉，碘—碘化钾染色后呈蓝黑色。胚柄区域细胞高度液泡化，形态上看呈无色透明。
随着极性结构的形成，体胚发育进入第二阶段，早期胚阶段（胚柄伸长之后，根分生组织形成
之前）：早期胚整体形态呈丝状体，从体视镜看由球形的光滑的胚性头部和细长的胚柄构成。随着体
胚不断发育，球体不断膨大，表面光滑，细胞质密有规则，随着内含物积累，外表呈不透明乳白色，
而长条形胚柄细胞团由一开始的光滑、透明，排列整齐紧凑逐渐变得不规则、松散，此时的体胚为
球形胚阶段（图 2，7、8）。随后，胚性头部扩展伸长，而胚柄细胞区域不断减少，胚柄系统开始凋
零瓦解，形成棒状的体胚（图 2，9、10）。棒状胚进一步发育，头部形成子叶原基凸起，此时胚体
体积还在扩大，表面光滑，细胞致密有规则，胚柄系统逐渐褐化死亡，从而形成心形胚（图 2，11、
12）。随后子叶原基发育成幼小子叶，子叶数因个体差异不同（2 ~ 7 片），这个阶段为鱼雷胚（图 2，
13、14）。
随着体胚不断成熟，体胚发育进入第三阶段，晚期胚阶段（根和芽的分生组织形成直到胚发育
成熟）：具有伸长的子叶和胚轴。此时体胚从暗培养转入光照培养，随着子叶不断发育和伸长变绿，
顶端胚芽开始生长，胚根伸长，此时体胚处于子叶胚时期（图 2，15）。随着子叶伸长展开，茎端胚
芽的生长和针叶形成，以及胚根不断伸长，体胚萌发形成再生植株（图 2，16）。


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图 2 香榧体胚发育及植株再生
1：胚性细胞团；2：原胚团Ⅰ；3：原胚团Ⅱ；4：原胚团Ⅲ；5、6：原胚；7、8：球形胚；9、10：棒状胚；11、12：心形胚；
13、14：鱼雷胚；15：子叶胚；16：体胚形成的再生植株。ZE：合子胚；Su：胚柄；Cy：子叶；EC：胚性细胞；
SE：体胚；EM：胚性细胞团；Em：胚；Rt：根；Sm：芽原基；Le：叶片。
Fig. 2 Developmental stages of somatic embryos originated via callus and its germination
1：Embryogenic cell mass；2：PEMⅠ；3：PEMⅡ；4：PEM Ⅲ；5，6：Proembryo；7，8：Globular embryo；9，10：Club-shaped；
11，12：Heart embryo；13，14：Torpedo embryo；15：Cotyledon embryo；16：The plantlets via somatic embryos.
ZE：Zygotic embryo；Su：Suspensor；Cy：Cotyledom；EC：Embryonal cells；SE：Somatic embryo；
EM：Embryonal mass；Em：Embryo；Rt：Root；Sm：Shoot meristem；Le：Leaf.

2.3 体胚发育过程的组织学观察
组织细胞学观察发现：在早期原胚阶段，整个细胞团呈球形，具极性，顶部较大，细胞质浓厚，
核大，结构紧密，此时的球形分生组织区域附带少量胚柄细胞（图 3，1）。随后分生区域的基部细
胞开始液泡化。胚体顶部细胞质浓厚的分生区域的细胞开始频繁进行细胞分裂。随之形成空泡化的
基部细胞群，而顶部表面细胞经过垂周分裂形成原胚头部类表皮细胞层，标志着组织逐步分化的起
始。该发育阶段可称为早期体胚时期（图 3，2）。
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图 3 香榧体胚发生发育期组织细胞学观察
1：胚性结构（示细胞质浓厚的胚性细胞）；2：早期体胚（示细胞质密的胚性顶部和高度液泡化的类胚柄细胞）；3、4：原胚；
5：球形胚；6：棒状胚顶部细节（示活跃的有丝分裂细胞群）；7 ~ 9：棒状胚；10、11：心形胚；12：鱼雷胚；13：鱼雷胚
顶部细节（示顶部子叶原基分生组织建成）；14：子叶胚；15：子叶胚胚根伸长细节（示组织中间的螺纹形管胞）。
EM：胚性细胞团；Su：胚柄；Cy：子叶；AM：顶端分生组织；RM：根分生组织；RC：根冠；AD：顶端；
Me：分生组织；Sam：茎尖分生组织；Vt：维管组织；Rt：根；T：管胞。
Fig. 3 Histological observation on developmental stages of somatic embryos
1：Embryogenic structure（shown the embryogenis cell with densely cytoplasm；2：Early somatic embryo（composed of apical，cytoplasm rich cells
and vacuolated suspensor-like cell）；3，4：Proembryo；5：Globular embryo；6：Detail of the apex of club-shaped embryo（shown active mitosis
division）；7–9：Club-shaped；10，11：Heart embryo；12：Torpedo embryo；13：Detail of the apex of torpedo embryo（shown the
meristem region of cotyledon）；14：Cotyledon embryo；15：Detail of the radicle（shown the tracheid）. EM：Embryonal mass；
Su：Suspensor；Cy：Cotyledom；AM：Apical meristem；RM：Root meristem；RC：Root cap；AD：Apical dome；
Me：Meristem；Sam：Shoot apical meristem；Vt：Vascular tissue；Rt：Root；T：Tracheid.

培养 30 d 后，基部胚柄细胞不断伸长，胚性区域细胞不断扩大，从而使胚柄系统不断伸长。该
阶段称为原胚时期（图 3，3、4），具有明显极性结构，包含细胞质密胚性细胞头部和细胞高度液泡
化的胚柄区域，此时细胞的细胞核都较大。培养 45 d 时，胚体头部分生区细胞通过平周分裂，使胚
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体顶部区域不断伸长，类表皮层细胞经过一次平周分裂形成亚表皮层，随后继续进行垂周分裂，两
者细胞不断分裂，胚性头部区域形成圆顶状，该阶段是球形胚时期（图 3，5）。培养 60 d 后胚性头
部细胞有丝分裂加剧（图 3，6），体胚为圆柱形，称该发育阶段为棒状胚时期，特点是内部缺乏组
织分化，不过表皮层原基已经建立，而极点基部的分生细胞继续空泡化，细胞核减小。极点基部带
有核心的胚柄细胞依旧存在（图 3，7 ~ 9）。培养 90 d 时胚体继续伸长，进一步建立胚性内部结构，
胚体的极点基部出现带有小柱状的根冠。顶部分生区细胞平周分裂快于垂周分裂，由于极性形成，
导致胚顶端下凹两边凸起形成子叶原基，基部胚柄细胞不断凋零萎缩，胚柄系统组织内形成空洞，
坏死。随着内部组织分化的推进，胚体外部呈心形，这个阶段为心形胚时期（图 3，10、11）。接着
体胚继续发育，原形成层开始在根冠分生组织区形成。随后继续培养 2 周，形成圆形顶端和根尖分
生组织，子叶原基开始生长和分化，子叶伸长，该发育阶段为鱼雷胚时期（图 3，12、13）。继续培
养 4 周后，子叶伸长，根冠开始瓦解。成熟体胚有一个明显的顶端分生组织，原形成层带，发育良
好的子叶和根分生组织。成熟体胚继续进行萌发培养 3 周，可见顶端分生组织分化生长形成胚芽，
根分生区细胞分裂旺盛，形成胚根（图 3，14）。在生长的根内可见管胞（图 3，15）。
3 讨论
在香榧的有性生殖过程中会出现退化、败育等发育停止现象，生产上形成僵果，造成经济损失，
通过香榧胚胎发育研究将有望解决这一问题。由于合子胚取材的缺陷，体胚发生是研究植物胚胎发
育理想的模式系统。
目前，关于香榧胚胎发育研究主要集中在合子胚研究。汤仲埙等（1985，1986）研究阐述了香
榧胚胎发育的周年历程，同时指出成熟胚发育的特点以及淀粉和蛋白质的动态。其中包括香榧成熟
胚下胚轴极短，胚体游离端富含蛋白质，胚轴过渡区含有淀粉，胚柄既不含淀粉也不含蛋白质，本
研究通过碘—碘化钾染色对香榧体胚的发育观察结果与之类似。说明合子胚和体胚发育有共同点。
姚进（2012）研究指出，香榧幼胚胚柄区域存在裂生多胚。本研究中通过显微观察发现，香榧幼胚
胚柄处退化的裂生多胚在离体培养中可吸收营养重新恢复发育，形成原胚。
香榧不同的外植体种类和年龄对植物生长调节剂的反应不同。姜新兵等（2004）使用 6-BA 和
2,4-D 共同诱导产生愈伤组织，同时在低浓度 6-BA 和 NAA 协同作用下可诱导体胚形成。姚进等
（2013）研究发现 NAA 对香榧幼胚培养愈伤诱导效果优于 2,4-D，非胚性愈伤生长 1 周后即死亡。
本试验中，香榧幼胚在含有 NAA 的培养基上可以从胚轴处产生大量半透明的颗粒状胚性愈伤组织，
乳白色的胚性愈伤组织可以长期继代增殖。从发生形态看，香榧体胚发生包括直接发生和间接发生。
组织细胞学研究观察表明，直接发生过程中表层单个胚性细胞团由胚体表皮细胞直接产生，在位置
效应作用下，孤立的细胞团能有效地减少与周围细胞的信息交流，从而启动新的细胞分化，形态建
成，进一步发育成体胚。间接发生过程中香榧的胚性愈伤组织起源于胚体的表层或皮层的细胞分裂，
该部分组织的细胞质稠密，细胞核大，细胞之间紧凑，同时细胞团形成孤立的结节状，并逐渐发育
形成胚性细胞和原胚团。这与挪威云杉（Nagmani et al.，1987；Lars & Sara，1991）和白云杉（Nagmani
et al.，1987）上的研究结果相似。
针叶树原胚由胚性头部和胚柄区域构成，胚性头部细胞较小，细胞质浓厚，细胞核比较大，胚
柄细胞较长且高度液泡化（Misra，1994）。由胚性细胞团形成原胚需要经过极性形态建成，包括塞
尔维亚云杉（Budimir，2003）、白云杉（Hakman et al.，1987）和挪威云杉（Nagmani et al.，1987）
项伟波，赵金凯，吴家胜，黄坚钦，喻卫武，吴连海，张启香.
香榧体细胞胚发生、发育的形态与细胞学观察.
园艺学报，2015，42 (8)：1477–1486. 1485

在内的许多云杉属研究表明体胚发生源于单细胞不均等分裂。Kristensen 等（1994）则认为北美云
杉体胚起源于胚性细胞对称分裂形成的类胚结构。由于植物生长调节剂和 pH 都能影响极性的产生
和分裂，所以不同的树种和培养基以及观察方式的局限性都会导致很难确定原始的不对称分裂的存
在（Kristensen et al.，1994）。从香榧原胚团形成的显微观察看，虽然存在游离细胞的不对称分裂，
但是未观察到胚性细胞团细胞不对称分裂，从原胚团发育形态推测香榧原胚团胚柄细胞的形成是胚
性细胞团基部细胞的伸长造成的，这与针叶树合子胚发育过程（Misra，1994）非常类似。
Filonova 等（2000）对挪威云杉体胚发育过程的观察研究表明，针叶树原胚团发育包括 3 个阶
段，即原胚团Ⅰ、原胚团Ⅱ和原胚团 Ⅲ。本研究中发现，香榧体胚发生过程中同样经历了这 3 个阶
段。原胚依次经历球形胚、棒状胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚 5 个阶段后成熟萌发形成再生植株。
从塞尔维亚云杉（Budimir，2003）、白云杉（Hakman et al.，1987）、挪威云杉（Nagmani et al.，1987；
Svobodová et al.，1999；Filonova et al.，2000）和杂交落叶松（Gutmann et al.，1996）的研究描述中
发现，尽管不同针叶树种体胚起源有差异，但后期体胚发育非常相似。根据胚体发育时期的不同，
香榧体胚发生过程可划分为 9 个阶段，类似于火炬松体胚发生的 9 个阶段（Pullmaner al.，2003），
发育阶段的分类能帮助理解体胚发生体系优化过程中体胚的状态。大多数针叶树胚体的发育成熟主
要依靠细胞的不断分裂而不是细胞的扩张，ABA、PEG 等能抑制细胞不正常的扩大（Gutmann et al.，
1996），从而使胚体能够正常发育及成熟。本研究中香榧体胚成熟需要 ABA 和 PEG 的共同作用，这
与前人（Svobodová et al.，1999；Stasolla & Yeung，2003；齐力旺 等，2004）的研究一致。
本研究的结果揭示了香榧体细胞胚起源方式与发生发育的组织细胞形态变化，明确了香榧体胚
发生发育各阶段，为进一步优化香榧体细胞胚发生体系提供了参考依据，同时为下一步开展香榧遗
传转化体系建立了良好的技术平台。但是目前香榧体胚发生技术还不够完善，存在诱导率较低，次
生胚发生严重、体胚成熟周期较长，体胚发生不同步等问题。香榧高频率胚性细胞系的筛选、体胚
发生的组织生理及化学等方面的研究有待进一步开展。

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