全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（4）：763–768 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–10–09；修回日期：2012–03–14
基金项目：国家自然科学基金项目（30871757）；国家农业科技成果转化资金项目（2010GB2C600253）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wxy@sdut.edu.cn）
双孢蘑菇多酚氧化酶的分离、纯化及特性分析
朱继英，王 健，王相友*
（山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255049）
摘 要：通过分步盐析，DEAE-Cellulose-52 阴离子交换层析和 Sephadex G-100 凝胶柱层析，对双孢
蘑菇中的多酚氧化酶（PPO）进行了分离纯化，并对在分离纯化过程中蛋白得率及酶活性进行了测定。
最终得到纯化倍数为 103.2，比活为 566.57 U · mg-1，蛋白得率为 0.47%的酶液。经 SDS-PAGE 电泳检验，
所得到的 PPO 呈单一蛋白带，分子质量为 25.5 kD。利用扫描探针显微镜对该酶的分子形态进行了观察，
发现双孢蘑菇中的 PPO 分子呈椭球状，分子高度在 8 ~ 12 nm 之间。
关键词：双孢蘑菇；多酚氧化酶；纯化；分子形态
中图分类号：S 646.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）04-0763-06

Extraction，Purification and Property of Polyphenol Oxidase from Agaricus
bisporus
ZHU Ji-ying，WANG Jian，and WANG Xiang-you*
（School of Agricultural and Food Engineering，Shandong University of Technology，Zibo，Shandong 255049，China）
Abstract：Polyphenol oxidase（PPO）from Agaricus bisporus was extracted and purified by
salting-out，DEAE-Cellulose-52 anion exchange chromatography and Sephadex G-100 gel column
chromatography. The protein yield and PPO activity were analyzed during purification. The final
purification fold，specific activity and protein yield were 103.2，566.57 U · mg-1 and 0.47%，respectively.
The SDS-PAGE analysis showed that the PPO was a single protein band with a molecular weight of about
25.5 kD. The observation by scanning probe microscope showed that the PPO from Agaricus bisporus was
ellipsoidal，with a diameter of about 8–12 nm.
Key words：Agaricus bisporus；polyphenol oxidase；purification；molecular shape

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）采后极易褐变，严重影响其品质和可销售性。多酚氧化酶（PPO）
催化的酶促褐变是导致双孢蘑菇采后褐变的主要原因（石启龙 等，2005；章伯元和包立军，2007；
李南羿 等，2009）。目前对双孢蘑菇褐变的研究主要集中在两个方面：通过对双孢蘑菇中 PPO 的酶
学特性研究，优化筛选抑制 PPO 活性的理化条件和抑制剂（王泽生 等，1999；赵东海 等，2004；
谢雯君 等，2005）；利用分子生物学手段，对 PPO 进行改良，选育不易褐变的双孢蘑菇菌株（Stoop
& Mooibroek，1999；Wichers et al.，2003）。目前已有一些研究对双孢蘑菇 PPO 粗提液的酶学特性
进行了分析，为抑制其采后褐变以及进一步研究 PPO 的结构、组成及生物学功能奠定了基础（王泽
生 等，1999；赵东海 等，2004；谢雯君 等，2005）；但粗提酶液中含有的大量杂蛋白、氨基酸和

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多糖，对 PPO 蛋白的分子结构、氨基酸组成和序列、基因的克隆和表达等方面的研究会造成较大影
响。另外，酶分子的空间结构与其功能及催化作用机制密切相关（王曼玲 等，2005）。研究 PPO 酶
分子的空间结构，了解其具体的催化活性位点，对指导 PPO 基因的精确定位、分离和克隆具有重要
意义。目前，国内外对双孢蘑菇多酚氧化酶氨基酸序列和组成方面有了一定的研究。针对双孢蘑菇
PPO 研究的现状，本研究中对其粗提液进行了分离和纯化，并利用扫描探针显微镜对其分子形态进
行了分析，为进一步研究双孢蘑菇 PPO 的催化作用机制，以及精确定位褐变基因，指导其分子改良
奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其 PPO 粗酶液的提取
试验于 2010 年 10 月至 2011 年 4 月在山东理工大学农产品贮藏加工实验室完成。双孢蘑菇采自
山东省淄博市淄川区淄河镇东石门村，菌株为 2796。
取新鲜双孢蘑菇 100 g，经液氮速冻后，置于经–45 ℃预冷的研钵中冰浴条件下研磨。解冻后
加入 0 ℃预冷的 200 mL 抽提缓冲液（0.05 mol · L-1 PBS，pH 6.8，内含 3% Triton X-100、5%PVP 和
0.3%聚乙二醇），并加适量石英砂，冰浴下充分研磨。0 ℃下 10 000 r · min-1 离心 20 min，收集上清
液作为抽提粗酶液 A。
1.2 粗酶液的纯化
硫酸铵盐析Ⅰ：在（0 ± 1）℃冷库中，于磁力搅拌下向 PPO 粗提液 A 中缓慢加入固体硫酸铵
至 30%饱和度。静置 10 min 后，于 0 ℃下 10 000 r · min-1 离心 20 min，收集上清液作为抽提酶液 B。
硫酸铵盐析Ⅱ：同样条件下，向酶液 B 中缓慢加入固体硫酸铵至 80%饱和度。静置 12 h，0 ℃
下 10 000 r · min-1 离心 30 min，收集析出的沉淀和油状漂浮物，用 0.05 mol · L-1 的 PBS 缓冲液（pH
6.8）溶解得到酶液 C。
DEAE-Cellulose-52 阴离子交换层析：将酶液 C 用透析袋 MD 34 进行透析脱盐，当透析外液的
电导系数不变后，将透析袋内溶液倒入盛有经 PBS（0.05 mol · L-1、pH 6.8）平衡的 DEAE-Cellulose-52
的烧杯中，缓缓搅匀后静置 1 h。然后装柱（1.6 cm × 20 cm），先装 3 cm 经 PBS 平衡的 DEAE-
Cellulose-52，再装上述吸附酶液的 DEAE-Cellulose-52。用 0 ~ 0.5 mol · L-1 线形梯度的 NaCl 溶液（溶
剂为 0.05 mol · L-1， pH 6.8 的 PBS）洗脱，洗脱速度为 40 mL · h-1，每管 4 mL。收集有活性峰的洗
脱液，浓缩至 15 mL，得酶液 D。
Sephadex G-100 凝胶柱层析：将酶液 D 上样于经含 1.5 mol · L-1 硫酸铵的 PBS（0.05 mol · L-1，
pH 6.8）平衡的 Sephadex G-100 凝胶柱（2.5 cm × 30 cm）。由（NH4）2SO4 低浓度到高浓度进行离
子强度线性梯度洗脱，洗脱速度为 40 mL · h-1，每管 4 mL。收集有活性峰的洗脱液，装入透析袋
MD 34 中，用聚乙二醇（M6000）冰浴浓缩，得到酶液 E。
整个 PPO 酶的提取纯化过程重复 3 次，试验结果利用 SPSS 软件进行统计分析。
1.3 蛋白含量测定
可溶性蛋白质含量测定采用 Bradford 的考马斯亮蓝 G-250 比色法，标准蛋白为牛血清白蛋白。
以粗提酶液中蛋白总量作为初始蛋白量，每一步纯化后收集所得蛋白量与初始蛋白量的比值为该步
骤的蛋白得率（%）。
4 期 朱继英等：双孢蘑菇多酚氧化酶的分离、纯化及特性分析 765

1.4 PPO 活性测定和纯度检测
PPO 活性参照 Zauberman 等（1991）的方法测定。0.05 mol · L-1、pH 6.8 的 PBS 缓冲液 1.95 mL
与 0.1 mol · L-1 邻苯二酚溶液 1.0 mL 混合，25 ℃保温 10 min。加入 0.05 mL 酶液后迅速混匀，并在
450 nm 波长处测定吸光度（OD）在 3 min 内的变化。一个蛋白活力单位（U）定义为：该蛋白溶液
在上述测定条件下每分钟引起 OD 值改变 0.1 所需的蛋白量（mg）。酶液中每毫克蛋白的酶活力定义
为比活力（U · mg-1）。纯化倍数是指纯化后所得酶液的比活力与粗提酶液 A 比活力的比值。
PPO 纯度和相对分子质量采用 SDS-PAGE 不连续垂直板电泳法测定。浓缩胶浓度为 5%，分离
胶浓度为 10%，每孔上样量为 20 μL。样品在浓缩胶和分离胶中迁移时的电压分别为 70 V 和 120 V。
1.5 PPO 分子形态观察
根据对最终酶液 E 中可溶性蛋白含量的测定结果，将酶液 E 用去离子水溶解成 1 mg · mL-1 的溶
液，并依次稀释至 100 μg · mL-1，10 μg · mL-1 和 1 μg · mL-1。取上述 4 个浓度的溶液各 1 μL，分别
滴加于新鲜揭开的云母片上，置于避光洁净容器中，常温自然条件下干燥。待样品干燥后，利用
NanoscopeⅢa 型扫描探针显微镜（VEECO Istrument Co.，USA），于常温大气环境中对 PPO 分子形
态进行扫描观察。所用扫描头的横向（X-Y）扫描范围和分辨率分别为 10 μm 和 0.2 nm，竖直（Z）
的扫描范围和分辨率分别为 2.5 μm 和 0.03 nm。
2 结果与分析
2.1 PPO 纯化过程的蛋白得率及酶活性变化
由表 1 可以看出，经过不同提纯步骤得到的总蛋白含量、蛋白得率、总酶活力及比活力均存在
显著性差异（P < 0.05）。经 30%硫酸铵沉淀后，粗蛋白含量减少了近 50%，而总酶活力由 17 610 U
降低至 14 004 U，仅降低了约 20%，说明 30%硫酸铵盐析过程可较好地去除杂蛋白，保持目的蛋白
PPO 的活性。硫酸铵Ⅱ级盐析过程蛋白质得率及酶活性均有较大损失，可能是因为在此过程中目的
蛋白沉淀不完全，以及部分 PPO 变性失活造成的。为了防止更高浓度的盐离子对 PPO 活性造成影
响，采用了 80%饱和度硫酸铵进行Ⅱ级盐析。利用 DEAE-Cellulose-52 阴离子交换层析结合离子强
度线形梯度洗脱，能够使杂蛋白和目标蛋白较好地分开，蛋白质的比活力由 18.09 U · mg-1 提高到了
219.35 U · mg-1，纯化倍数达到 39.95 倍。
表 1 PPO 纯化过程的蛋白得率及活性
Table 1 Protein yield and PPO activity during purification
纯化过程
Purification process
总蛋白质/mg
Protein content
蛋白得率/%
Protein yield
酶活力/U
PPO activity
比活力/（U · mg-1）
Specific activity
纯化倍数
Purification multiple
粗提酶液 A Coarse enzyme A 3208.33 a 100.00 a 17 610.20 a 5.49 a 1.00 a
盐析Ⅰ酶液 B Salting-out enzyme B 1663.59 b 51.85 b 14 004.10 b 8.42 b 1.53 a
盐析Ⅱ酶液 C Salting-out enzyme C 433.95 c 13.53 c 7 850.00 c 18.09 c 3.30 b
离子交换层析酶液 D
Ion exchange chromatography enzyme D
19.53 d 5.92 d 4 284.00 d 219.35 d 39.95 c
凝胶层析酶液 E Gel chromatography enzyme E 5.21 e 0.47 e 2 951.82 e 566.57 e 103.20 d

将酶液 D 进行 Sephadex G-100 凝胶柱柱层析，分别测定每管洗脱液中蛋白的含量和活性。酶蛋
白峰和活性峰主要出现在 3 ~ 11 管，而颜色峰（即洗脱下的颜色最深的 1 管）出现在第 10 管，说
明 Sephadex 凝胶层析对 PPO 和提取过程中产生的褐色物质有较好的分离效果。但本试验过程中目
的蛋白 PPO 和褐变产物的分离不够彻底，这可能是由于所选用的 Sephadex G-100 的排阻极限偏大，
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造成对杂蛋白、PPO 和褐变产物的分辨率较低。最终收集并合并 3 ~ 8 管，获得 PPO 的比活力为 566.6
U · mg-1，纯化倍数为 103.20。
2.2 PPO 纯度和相对分子质量
为了确定纯化的效果，对终提取酶液 E 进行了 SDS-PAGE 电泳，结果如图 1 所示，1、2、3 分
别为 3 次重复所得酶液 E 的电泳图。样品酶液的电泳图中仅出现 1 条蛋白带，说明经过上述步骤的
纯化，酶液 E 中的 PPO 纯度已达到较高的纯度，经计算，其相对分子质量约为 25.5 kD。

图 1 双孢蘑菇 PPO 纯化后 SDS-PAGE 图谱
1、2、3：酶液 E； M：标准蛋白。
Fig. 1 SDS-PAGE of the purified PPO of Agaricus bisporus
1，2，3：Enzyme E；M：Markers.
2.3 双孢蘑菇 PPO 分子形态
双孢蘑菇中 PPO 的扫描探针显微镜观测结果显示，浓度为 1 mg · mL-1 和 100 μg · mL-1 的样品由
于使用的 PPO 溶液浓度太高，扫描图像中密集大量团块状蛋白分子的聚集体，无独立可辨的单分子
存在。而浓度为 1 μg · mL-1 样品的图片中蛋白质分子较为稀少，均为团块状或椭球状。浓度为 10
μg · mL-1 样品的观察结果（图 2）中，可见大量团块状或椭球状蛋白结构，大小不均匀，直径在几
纳米至几十纳米不等。

图 2 PPO 分子形态扫描探针显微镜观测图
横向扫描范围为 500 nm，针尖扫描速率为 1.387 Hz，竖直扫描范围 20 nm。
Fig. 2 Molecular shape of PPO observed by scanning probe microscope
Scan size 500 nm，Scan rate 1.387 Hz，Data scale 20 nm.
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其中形态不规则的团块结构可能由多个蛋白分子形成的聚集体，独立散开的单个椭球状结构为
PPO 蛋白的单分子（戴玲 等，2007）。根据对单个蛋白分子的观测和计算，基本确定双孢蘑菇中 PPO
分子为近球状或椭球状，分子高度在 8 ~ 12 nm 之间。该结果可为双孢蘑菇 PPO 纯化手段的选择以
及更深入了解其空间结构特征，探讨结构与功能的关系提供直观分析资料。
3 讨论
双孢蘑菇中 PPO 活性较强，常规分离纯化过程易催化底物褐变，造成酶活性降低，其酶促反应
的产物容易与 PPO 蛋白交联在一起，给蛋白的分离纯化造成很大困难。本试验中最初对双孢蘑菇中
PPO 采用冰浴粗提，常温纯化的方法，结果不但蛋白得率很低，而且经 DEAE-Sepharose-52 层析后
的 PPO 已基本无活性。借鉴了段玉权等（2004）的方法，采用液氮首先将双孢蘑菇样品速冻，并于
–45 ℃预冷的研钵中冰浴研磨，有效地控制了样品在酶粗提过程的褐变。随后的分离纯化过程也均
在 0 ℃左右的低温下进行，较好抑制了 PPO 催化的反应，保持了较高的酶活性。
不同植物、同一植物体的不同部位及同一部位的 PPO 多基因家族的不同成员的分子量均可能不
同（王曼玲 等，2005）。段玉权等（2004）得出中华寿桃 PPO 的分子量约 66.0 kD；蒋跃明（1999）
纯化荔枝果皮 PPO 的分子量为 76 kD。王亮（2005）分离纯化得到魔芋中 PPO 的两种同工酶分子分
别为 43 和 45 kD。Strothkamp 等（1976）用沉降法得出蘑菇的儿茶酚氧化酶的分子量为 26 ~ 32 kD。
Wichers 等（2003）提取的双孢蘑菇 AbPPO1 和 AbPPO2 活性蛋白分别为 43 kD 和 47 kD。本试验中
通过纯化得到双孢蘑菇中 PPO 的分子量约为 25.5 kD。植物组织中的 PPO 常以非活化的形式存在，
受蛋白酶激活，切除 C–端的部分序列后，转变成活化状态。同种生物体内 PPO 分子大小的不同也
可能是由于酶蛋白本身的分解所致（Soderhall，1985；段玉权 等，2004）。
原子力显微镜技术作为一种高分辨的结构图像与功能表征手段在生物大分子结构的研究中具
有明显优势，并已成功应用于多种生物大分子的研究（Abu-Lail & Camesano，2003；朱杰和孙润广，
2006；戴玲 等，2007）。王亮（2005）利用原子力显微镜对魔芋中 PPO 的空间结构进行了观察，结
果显示魔芋中 PPO 为纤维状蛋白，分子高度在 0.5 ~ 2 nm 之间，0.5 nm 的最低高度为肽单链的高度；
并由此推断，魔芋中的多酚氧化酶采用排阻色谱进行分离纯化时，不能以球状蛋白的分子量范围来
选择凝胶，而且仅采用 Sephadex G 系列凝胶不能达到完全纯化的目的。本研究的结果表明，双孢蘑
菇中 PPO 分子为椭球状，分子高度在 8 ~ 12 nm 之间。无论是分子形态还是空间大小与魔芋中 PPO
均有较大差异。这可能是由于 PPO 是由多基因家族编码的，不同种类植物以及同种植物不同器官
PPO 都可能具有不同的表达形式（陈桂信 等，2003）。蛋白三维结构的解析对阐明蛋白的功能及一
些重要生物学问题发挥了重要作用（朱杰和孙润广，2006）。本研究中利用扫描探针显微镜对双孢蘑
菇 PPO 分子的外观形态和大小进行了观察和测量，但所用仪器对其内部结构还无法分辨。圆二色作
为一种灵敏的光谱探针，通过对分子中发色基团的研究来获得生物大分子的二级结构信息，是简便
和快捷的获得生物大分子结构的手段之一。X–射线晶体衍射分析具有极高的分辨率，可以得到包
含空间的和化学的整体三维结构信息，是目前确定蛋白质构象最准确的方法。利用圆二色谱分析、
X–射线衍射等方法，进一步研究 PPO 的二级结构、三级结构，探讨其空间结构与活性的关系，对
阐明 PPO 催化反应的分子学催化机制具有重要意义。

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