全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1105–1114 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–02–13；修回日期：2014–05–06
基金项目：浙江省新品种选育重大科技专项（2012C12903）；浙江省农业科学院创新提升工程项目（2012R23Y01E01）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：maowh@126.com）
紫红线茄转基因体系优化及 SmARF8基因 RNA
干涉表达载体的遗传转化
包崇来，杜黎明，胡天华，朱琴妹，胡海娇，毛伟海*
（浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021）
摘 要：建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。利用该方法，以获得茄子 SmARF8
基因 RNA 干涉转基因植株为目的，构建了以 NPTⅡ基因为筛选标记的融合表达载体 pCAMBIAI
35S-2300-SmARF8-INT，并通过农杆菌介导，侵染茄子下胚轴外植体。含有 2 mg · L-1 吲哚乙酸，0.5 mg · L-1
玉米素，25 mg · L-1 卡那霉素和 500 mg · L-1 头孢氨苄的 MS 选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分
化苗，再生率达到 80%。转基因苗继续生长并在不含激素的 MS 培养基上产生健壮根系，最终获得转基
因株系。RT-PCR 和 qRT-PCR 分析验证了 T0 代转基因株系中内源基因 SmARF8 被干涉后不表达或表达量
降低，Southern blot 分析显示选择的 T0 代转基因株系中存在 1 个 T-DNA 插入拷贝。以上研究结果表明利
用建立的转基因体系 SmARF8 基因在茄子中被成功敲除。
关键词：茄子；转基因；RNA 干涉；农杆菌
中图分类号：S 641.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1105-10

Optimization of the Transgenic System and Genetic Transformation of
SmARF8 Gene RNAi Vector in Red-purple Long Eggplant
BAO Chong-lai，DU Li-ming，HU Tian-hua，ZHU Qin-mei，HU Hai-jiao，and MAO Wei-hai *
（The Institute of Vegetable，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）
Abstract：A high efficient genetic transformation system was developed using hypocotyl explants for
producing transgenic red-purple long eggplant（Solanum melongena L.）. To generate SmARF8 gene RNAi
transgenic eggplant plants，the binary vector pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT with the selectable
marker gene neomycin phosphotransferase（NPTⅡ）was constructed and transformed into eggplant
hypocotyl explants via Agrobacterium tumefaciens-mediated infection. Transgenic plantlets were induced
on MS selective media containing 2 mg · L-1 indole-3-acetic acid，0.5 mg · L-1 zeatin，25 mg · L-1 kanamycin
and 500 mg · L-1 cefotaxime with regeneration ratio higher to 80%. Subsequently，the transgenic plantlets
kept growing on same medium and then rooted efficiently on MS basic media to become transgenic plants.
The RT-PCR and qRT-PCR analysis showed no or less transcript of SmARF8 in T0 transgenic generation.
Further Southern blot analysis of selected T0 transgenic plants confirmed the presence of single T-DNA
insertion. These results demonstrate that the endogenesis SmARF8 has been successfully knocked out in

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eggplant using the established transgenic system in this study.
Key words：eggplant；genetic transformation；RNA interference；Agrobacterium tumefaciens

茄子（Solanum melongena L.）极易受黄萎病和青枯病等多种病害以及各种昆虫的危害，虽然部
分野生种拥有天然抗性，但因连锁有害基因的存在，导致育性不兼容（Pratap et al.，2011）。随着分
子生物学和基因工程的研究进展，可将各种重要调控基因转导到茄子中，快速改良品种（Mariashibu
et al.，2012）。如 Rotino 等（1997）采用基因工程手段，利用生长素合成基因，获得单性结实茄子
品种，并在番茄、草莓、悬钩子、葡萄上进行了推广应用（Rotino et al.，1997，2005；Ficcadenti et
al.，1999；Mezzetti et al.，2004）。
目前茄子转基因已得到广泛研究。如以根为外植体，0.1 mg · L-1 TDZ 和 3 mg · L-1 6-BA 能通过
愈伤组织诱导产生不定芽，但是该方法耗时较长（Franklin & Lakshmi，2003）；以子叶为外植体，
2.5 mg · L-1 6-BA 和 0.5 mg · L-1 IAA 能直接快速诱导产生再生苗，再生率达到 60%（Prabhavathi et al.，
2002）；Singh 等（2010）以茎段为外植体，pPRV111A 质体表达载体经基因枪轰击，成功获得转基
因茄子；Subramanyam 等（2013）以茄子种子为外植体，利用乙酰丁香酮和 Silwett L-77 的辅助侵
染，真空导入 pCAMBIA 1301-bar 载体获得转基因苗。Singh 等（2010）和 Subramanyam 等（2013）
创建的转基因方法，能大幅度缩短转导时间，且为茄子基因工程提供了新思路，但是需要配备特定
的操作仪器，成本较高。虽然已有多种方法成功获得茄子转基因苗，但不同基因型材料的再生能力
差异很大，影响再生的途径（金丹丹 等，2004），如对浙江省大面积种植的紫红线茄采用已公开发
表的转基因方法，均不能成功获得转基因植株。
许多试验表明选择标记基因和 GUS 报告基因的启动子会影响临近启动子的表达能力和特异性
（Yoo et al.，2005；Zheng et al.，2007）。目前已有许多研究人员意识到这种反馈抑制，并开展了关
于如何增强多启动子调控的机制研究，期望能避免或者阻止这种不良影响（Singer et al.，2011）。且
GUS 报告基因和选择标记基因的存在不利于转基因植株在育种上的直接应用，消费者由于担心标记
基因的副作用而不能完全接受。Darwish 等（2014）利用 pMAT21 载体，以子叶为外植体，获得无
抗性标记基因的转基因苗，可在育种中直接得到应用。
本试验中以紫红线茄为材料，针对其转基因过程中植物生长调节剂种类和浓度、选择压卡那霉
素浓度进行了改良，创建了不含 GUS 报告基因的融合表达载体，期望能建立一个最有效、最适宜紫
红线茄的转基因体系，为加速茄子育种建立理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
选择浙江省大面积种植的紫红线茄品种亲本‘E666’、‘E25’、‘E22’和‘E673’等 4 个材料进
行转基因体系创建工作。
精选种子经75%乙醇处理30 s后，用10% NaClO表面消毒15 min，或0.1% HgCl2分别消毒1 min，
2 min，无菌水洗涤 5 次。平铺到含 3%蔗糖和 200 mg · L-1 头孢氨苄（Cefotaxime，Cef）的 MS 固体
培养基上，以不加 Cef 为对照。每瓶放置 20 粒种子，3 次重复。在（30 ± 1）℃，黑暗中培养 7 d
后开始发芽，在光照 300 µmol · m-2 · s-1、28 ℃/20 ℃（16 h /8 h）的生长箱内继续培养 7 d，培育出
含有 2 片子叶的无菌小苗。
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1.2 载体构建
根据茄子生长素响应因子 SmARF8 基因（FJ597628）cDNA 序列设计引物 SmARF8-INT-F 和
SmARF8-INT-R（表 1）（杜黎明 等，2009），以茄子叶片 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。条件为：
94 ℃变性 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，运行 32 次循环。PCR 产物用 1.2%琼脂糖
凝胶电泳进行检测（图 1）。2 个 PCR 扩增片段分别以 3′→5′和 5′→3′方向构建到 PBS-in 载体玉米
NIR1 基因第 2 个内含子 350 bp 片段两端后，用 SacⅠ和 PstⅠ进行双酶切，获得含有内含子结构及
2 个 PCR 片段的部分，命名为片段 A。将 CaMV 35S 启动子亚克隆到 pCAMBIA1300 载体（http：//
www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors.html）的 EcoRⅠ和 SacⅠ酶切位点之间，豌豆 Rubisco
E9 基因的 poly（A）序列插入到载体 PstⅠ和 Hind Ⅲ酶切位点之间，成功获得 pCAMBIAI 35S-1300
载体。酶切后的片段 A，用 T4 DNA 连接酶构建到 SacⅠ和 PstⅠ酶切后的 pCAMBIAI 35S-1300 载
体上；将含有 35S 启动子、片段 A 和 poly（A）终止子的载体 pCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT 经
EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切后，构建到经 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切的 pCAMBIAI 35S-2300 载体上，成为
含有 NPTⅡ抗性基因的复合表达载体 pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT。以 SmARF8-INT-F 和
SmARF8-INT-R 引物对构建好的载体进行测序验证（上海生工生物工程公司），EcoRⅠ和 Hind Ⅲ进
行酶切鉴定。

表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
名称
Name
序列（5′–3′）
Sequence（5′–3′）
目的基因
Gene
SmARF8-INT-F CAGTTTCAACATCAACAGCGAACC SmARF8
SmARF8-INT-R ACAAATGGAGTAACCCGAGAAG
SmARF8-Q-F TTCCCAGCAAACCTTTTCTGATATG
SmARF8-Q-R CGCTTTGATGATGAGGACGAAGAC
SmActin-F GCTAGTGGTCGTACAACTG SmActin
SmActin-R CAGCAGTGGTGGTGAACATATAAC
NPTII-F GAGGCTATTCGGCTATGACTG NPTII
NPTII-R ATCGGGAGGGGCGATACCGTA

1.3 预培养
分化培养基选择附加不同浓度吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）和玉米素（Zeatin，ZT）
的 MS 培养基（表 2）。在超净台下将无菌苗的下胚轴切成 0.5 cm 长的片段，切下带柄子叶，分别接
种到各种浓度培养基上。25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗，50 µmol · m-2 · s-1 光照强度的生长室内预培养
生长 2 d。
1.4 农杆菌侵染和共培养
将融合表达载体 pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT 经电击转化转入农杆菌 EH105 菌株中，挑
取单菌落，在含有 50 mg · L-1 卡那霉素（Kanamycin，Kan）和链霉素的 5 mL YEP 液体培养基中 28
℃震荡培养过夜，再倒入 50 mL YEP 继续培养 5 h，直到 OD 值为 0.4 ~ 0.7。菌液 700× g 离心 5 min
后，去除上清液，沉淀用等体积 MS 液体培养基重新悬浮。无菌外植体预培养 2 d 后，在农杆菌悬
浮液中浸润 5 min，在无菌滤纸上沥干，然后重置回预培养瓶中继续培养 2 d。
1.5 分化与生根培养
农杆菌侵染后，外植体在预培养基上共培养 2 d 后，转移到分别添加有 100、50、25 mg · L-1 Kan
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和 500 mg · L-1 Cef 的 MS 选择培养基上（植物生长调节剂浓度同预培养基）继续生长，直到获得不
定芽，统计出芽率（长出不定芽的外植体占总数的百分比）。分化苗延伸生长后转移到不含植物生长
调节剂的 MS 选择培养基上进行生根培养。生根后转移到含有营养土的塑料钵中，在温室中进行生
长，直至开花结果，收集种子。
1.6 转基因茄子的 RT-PCR 和 qRT-PCR 分析验证
为了检测转基因苗的基因干涉效果，用半定量 RT-PCR 分析检测 SmARF8 基因的转录表达情况。
利用 RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司），将转基因及对照非转基因苗的叶片组织，提取总
RNA 后，用 SuperScript Transcriptase Ⅲ（上海生工生物工程公司）逆转录成第一链 cDNA。以干涉
载体构建引物 SmARF8-INT-F 和 SmARF8-INT-R（表 1）进行 PCR 检测，以茄子 SmActin 为参考基
因，设计引物 SmActin-F 和 SmActin-R（表 1）。PCR 扩增条件为：94 ℃变性 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃
30 s，72 ℃ 30 s，运行 28 次循环。PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
根据 SmARF8 基因序列设计引物 SmARF8-Q-F 和 SmARF8-Q-R（表 1），进行荧光实时定量
qRT-PCR 分析验证。同样以 SmActin 为参考基因。根据 RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒（天
根生化科技有限公司），ABI Prism STEP-ONE PLUS real-time thermal cycler 仪器（Applied
Biosystems，Carlsbad，CA，USA）进行 qRT-PCR 分析。94 ℃变性 10 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s，
运行 40 次循环，同时进行溶解曲线分析，确保 PCR 产物唯一性。3 次重复。
1.7 转基因茄子 Southern blot 分析验证
为了进行 Southern blot 分析转基因植株的拷贝数，根据 CTAB 法以及改良的茄子 DNA 提取体
系（杜黎明 等，2007），分别从转基因与非转基因植株新鲜叶片中提取基因组 DNA。10 µg DNA 通
过限制性内切酶 EcoRⅠ酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后转移到 Hybond 尼龙膜上。根据载体上的抗性
基因 NPTⅡ序列设计引物 NPTⅡ-F 和 NPTⅡ-R（表 1），获得 700 bp PCR 片段为探针，α-[32P]（New
England Biolabs）进行同位素标记，根据 Sambrook 等（1989）的方法进行杂交。室温下将膜分别用
2× SSC + 0.1% SDS 和 1× SSC + 0.2% SDS 冲洗，65 ℃下分别在 0.5× SSC + 0.1% SDS 和 0.1× SSC +
0.1% SDS 中漂洗 30 min，晾干后分析。
2 结果与分析
2.1 消毒方法的确立
0.1% HgCl2 处理的种子，播种在不含 Cef 的 MS 固体培养基上生长发芽结果显示，处理 2 min
的种子不会污染，但是发芽率只有 10%；而处理 1 min 的种子污染率为 50%，发芽率也只有 50%。
因此，HgCl2 消毒方式不适合茄子无菌苗的培养。
10% NaClO 消毒 15 min 的种子，播种在不含 Cef 的 MS 固体培养基上，污染率为 30%，但是发
芽率达到 80% ~ 90%。MS 固体培养基中加入 200 mg · L-1 Cef 后，不会出现污染，发芽率也没有受
影响，能达到 90%左右。因此最后选择 10% NaClO 消毒 15 min，在含 200 mg · L-1 Cef 的 MS 固体
培养基上培养无菌苗。
2.2 融合表达载体 pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT 的构建
以 SmARF8-INT 为引物的 PCR 克隆扩增获得 294 bp 片段，产物位于 SmARF8 基因 1 609 ~ 1 902
bp 区段。首先将 PCR 扩增片段构建到含有内含子结构的 PBS-in 载体上，以至于当这个片段转导到
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植物体内时能形成发夹结构，从而达到干涉内源基因，使它们不能进行转录表达的目的。
为了构建不含 GUS 报告基因的转导载体，选择 pCAMBIAI 35S-2300 载体，但是该载体不含有
可以利用的 35S–启动子—终止子序列。所以首先将可以形成发夹结构的片段 A 构建到含有 35S–
启动子—终止子的 pCAMBIAI 35S-1300 载体上，产生 35S–启动子—片段 A—终止子的完整结构，
再将该部分酶切连接到 pCAMBIAI 35S-2300 载体上，从而获得融合表达载体 pCAMBIAI 35S-
2300-SmARF8-INT（图 1）。
EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切鉴定结果显示有约 2 500 bp 的条带从载体上切除下来，表示载体构建成
功（图 2），并经测序进一步验证了插入片段序列。


图 1 载体构建过程框架图
A：含有玉米 NIR1 基因第 2 个内含子的 PBS-in 载体，SmARF8 基因片段分别以相反方向构建到内含子区域两端，被命名为片段 A；
B：PCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT 载体 T-DNA 区域；C：PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT 载体 T-DNA 区域。
Fig. 1 Schematic representation of the vector
A：The PBS-in vector with No. 2 introns of maize NIR1，in which the SmARF8 PCR fragments are located in two sides of introns as reverse
direction and the fragment was named A；B：The T-DNA region of PCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT vector；
C：The T-DNA region of PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT vector.



图 2 PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT 载体 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切鉴定
2 500 bp 条带为酶切后的插入片段。
Fig. 2 The vector PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT was digested by EcoRⅠand Hind Ⅲ
The 2 500 bp band is the insert fragment.

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2.3 选择培养基条件筛选及转基因苗的产生
融合表达载体 pCAMBIA35S-2300-SmARF8-INT 带有 Kan 报告基因，因此选择培养基中须加入
合适浓度的 Kan，并加入 Cef 抗生素以抑制农杆菌。
紫红线茄材料‘E666’无菌苗的下胚轴和带柄子叶外植体经农杆菌侵染后转移到含不同浓度ZT，
IAA，25、50 和 100 mg · L-1Kan 及 500 mg · L-1 Cef 的选择培养基上生长，结果发现当 Kan 浓度为
100 和 50 mg · L-1 时，外植体生长 7 d 后就会开始褐化直到死亡；当 Kan 浓度降低到 25 mg · L-1 时，
外植体生长良好，因此表明 25 mg · L-1 Kan 浓度为较合适选择压。
在不同浓度 ZT、IAA 组合和 25 mg · L-1 Kan 及 500 mg · L-1 Cef 的选择培养基（表 2）上，‘E666’
无菌苗的下胚轴外植体生长情况有所区别，在 8 号培养基上生长情况最佳，大部分下胚轴能未经愈
伤组织分化而直接长出不定芽，出芽率达到 80%（图 3，A、B；表 2）；7 号和 9 号培养基出芽率分
别为 32%和 33.3%；其他的都低于 30%，甚至为 0。带柄子叶外植体在各选择培养基上均没有长出
不定芽，且在培养基上生长 7 d 后开始呈现褐化，最后死亡。
其他 3 种材料‘E25’、‘E22’和‘E673’的培养结果与‘E666’相似，下胚轴外植体能在 8
号培养基上诱导产生不定芽，出芽率为 60% ~ 80%，而带柄子叶外植体都在选择培养基上褐化直至
死亡。
终上所述，紫红线茄下胚轴外植体，较适宜的选择培养基为2.0 mg · L-1 ZT + 0.5 mg · L-1 IAA + 25
mg · L-1 Kan + 500 mg · L-1 Cef 的 MS 培养基，可以作为其转基因体系。
利用该优化转基因体系，一共获得 80 株分化苗。分化苗长到适宜大小后，尽量切除干净外植
体，转移到玻璃瓶中，在同样的 MS 选择培养基上继续延伸生长。28 d 后，转基因苗在不加任何激
素，含 25 mg · L-1 Kan 和 500 mg · L-1 Cef 的 MS 培养基上进行生根培养，能产生健壮根系，成功获
得完整植株。最后将 50 株有完整根系且发育良好的植株转移到含有营养土的塑料钵中，在玻璃温室
中继续生长（图 3，C ~ F），以便收集种子。

表 2 分化培养基中玉米素和吲哚乙酸的浓度配比及分化效率
Table 2 The concentration of ZT and IAA on differential medium and the efficiency of buds induction
名称
Code
ZT/
（mg · L-1）
IAA/
（mg · L-1）
出芽的下胚轴数
Buds induction
不能出芽的下胚轴数
No buds development
出芽率/%
Ratio
1 2.5 0.1 5 50 9.1
2 2.5 0.3 10 60 14.3
3 2.5 0.5 8 40 16.7
4 2.5 0.8 28 110 20.2
5 2.5 1.0 2 80 2.0
6 2.0 0.1 6 45 11.7
7 2.0 0.3 36 76 32.0
8 2.0 0.5 40 10 80.0
9 2.0 0.8 14 28 33.3
10 2.0 1.0 10 40 20.0
11 1.5 0.1 5 60 7.6
12 1.5 0.3 15 45 25.0
13 1.5 0.5 16 38 29.6
14 1.5 0.8 10 49 16.9
15 1.5 1.0 6 56 9.6
注：基本培养基为 MS + 25 mg · L-1 Kan + 500 mg · L-1 Cef。
Note：The basic medium is MS with 25 mg · L-1 Kan and 500 mg · L-1 Cef.



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图 3 含有 PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT 载体的转基因茄子发育过程
A、B：下胚轴外植体在 2.0 mg · L-1 ZT + 0.5 mg · L-1 IAA + 25 mg · L-1 Kan + 500 mg · L-1 Cef 的 MS 选择培养基上培养
21 d 和 28 d；C：分化苗在选择培养基上继续伸长；D：分化苗在含有 25 mg · L-1 Kan 和
500 mg · L-1 Cef 的 MS 培养基上生根；E：转基因植株转移到塑料钵中生长；
F：植株在温室中生长结果。
Fig. 3 Development of transgenic eggplants var pCAMBIA-35S-2300-SmARF8-INT
A，B：Hypocotyl explants grew on MS selective medium supplemented with 2.0 mg · L-1 ZT，0.5 mg · L-1 IAA，25 mg · L-1 Kan
and 500 mg · L-1 Cef for 21 and 28 days；C：Elongated Kan-resistant shoots on selective medium；
D：Kan-resistant shoots rooting on basal MS medium containing 25 mg · L-1 Kan and 500 mg · L-1 Cef；
E：Transgenic plant transferred to a plastic pot and farmyard manure after rooting；
F：Mature transgenic plant bearing fruits.

2.4 分子验证分析
为了分析验证转基因植株的 SmARF8 基因 RNA 干涉效果，随机选择 20 株发育良好、生长健壮
及外形正常的假定转基因苗和非转基因苗，提取叶片组织总 RNA，逆转录成第一链 cDNA 后进行
PCR 分析。RT-PCR 结果显示，以 SmARF8-INT-F 和 SmARF8-INT-R 为引物，在对照非转基因植株
中通过 PCR 扩增能获得约 300 bp 大小的清晰条带，表明内源基因 SmARF8 显著表达。有 15 株转基
因植株中 SmARF8 表达量显著降低，图 4 为其中 5 株转基因植株 PCR 产物电泳结果，显示基因
SmARF8 在株系 4 中微弱表达，而在株系 6 中几乎不表达，结果说明 15 株转基因植株已成功导入载
体 pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT，并且 RNA 干涉效果较良好，以至于内源基因 SmARF8 表达
量显著降低或几乎不表达。
荧光定量 qRT-PCR 分析（图 5）进一步验证了该结果。以非转基因株系中的表达量作对照，尤
其是株系 4 和株系 6 几乎不表达。5 个株系的 SmARF8 基因表达量显著降低。
为了进一步验证分析转基因植株插入基因的拷贝数，使用植株基因组 DNA 进行 Southern blot
分析。经 RT-PCR 和 qRT-PCR 分析验证的 5 株转基因和 1 株非转基因植株 DNA，EcoR Ⅰ酶切后，
以同位素 32P 标记过的 NPTⅡ基因为探针进行杂交。结果显示转基因株系中有 1 个条带（图 6），表
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图 5 非转基因对照和转基因植株（T0）的 qRT-PCR 分析
qRT-PCR 分析鉴定 SmARF8 基因的 mRNA 转录表达水平，
SmActin 基因作为对照基因。1：非转基因对照植株；
2 ~ 6：转基因植株。
Fig. 5 qRT-PCR of non-transgenic control and
transgenic eggplants（T0）
qRT-PCR was performed to examine the SmARF8 gene mRNA
transcript. 1：Non-transgenic control plants；
2–6：Transgenic eggplants.
图 6 非转基因对照和转基因植株（T0）的 Sourthern blot 分析
RT-PCR 验证过的转基因植株 Southern blot 杂交分析。
1：非转基因对照植株；2 ~ 6：转基因植株。
Fig. 6 Southern blot ananalysis of non-transgenic control and
transgenic eggplants（T0）
Southern blot hybridization analysis of RT-PCR positive transgenic
plants. 1：Non-transgenic control plants；
2–6：Transgenic plants.
明它们含有一个 T-DNA 插入拷贝，而非转基因株系中没有条带，说明没有 T-DNA 插入拷贝存在。
将这 5 株转基因株系在温室中培养，果实成熟后收集种子，继续播种生长获得 T1 代植株，做进一步
的表型分析研究。


图 4 非转基因对照和转基因植株（T0）的 RT-PCR 分析
RT-PCR 分析鉴定 SmARF8 基因的 mRNA 转录表达水平，SmActin 基因作为参考基因。
M：DNA marker；1：非转基因对照植株；2 ~ 6：转基因植株。
Fig. 4 RT-PCR ananalysis of non-transgenic control and transgenic eggplants（T0）
RT-PCR was performed to examine the SmARF8 gene mRNA transcript.
M：DNA marker；1：Non-transgenic control plants；
2–6：Transgenic eggplants.

3 讨论
茄子作为一种重要经济作物，转基因研究非常重要，如果能充分利用高效的转基因体系，可以
将一些重要而优良的农艺性状调控基因转导到茄子中，从而可以快速改良品种。因此结合本地育种
目标，创建适合本地品种的转基因体系非常重要。
6 期 包崇来等：紫红线茄转基因体系优化及 SmARF8 基因 RNA 干涉表达载体的遗传转化 1113

紫红线茄用目前已经发表的大部分转基因方法，都不能非常有效地获得分化苗，因此需要对转
基因方法进行改良，创建适合紫红线茄的转基因体系。作者前期曾利用添加有 6-BA、ZT、反式 ZT、
IAA及NAA等多种植物生长调节剂不同浓度组合的MS培养基进行分化培养预试验，发现ZT和 IAA
组合下外植体生长最好，将该组合进行不同浓度梯度试验，结果发现当 MS 培养基中 IAA 浓度
为 0.3 ~ 0.5 mg · L-1，ZT 浓度为 2.5 ~ 1.5 mg · L-1 时，都能有效获得分化苗。而当 IAA 浓度过低或过
高时，外植体都会迅速褐化死亡，因此 IAA 的浓度对转基因体系有着关键的调控作用。已公开的转
基因体系可以采用 100 mg · L-1 的 Kan 为选择压（Franklin & Lakshmi，2003），而在本方法中仅采用
25 mg · L-1 的 Kan 为选择压，表明紫红线茄对 Kan 的抵抗性较弱。
根据当前研究基础，发现大部分茄子转基因方法采用根或子叶为外植体。但是当紫红线茄以带
柄子叶为外植体时，应用已公布的转基因体系（Prabhavathi et al.，2002；Franklin & Lakshmi，2003；
Singh et al.，2010；Subramanyam et al.，2013）和本试验中各种植物生长调节剂浓度组合的培养基，
都不能产生分化苗，这个结果表明紫红线茄不适合以带柄子叶为外植体。Singh 等（2010）以茎为
外植体，利用基因枪轰击方法获得茄子转基因苗，但是再生率低于 50% ~ 55%。本研究体系中，以
下胚轴为外植体，分化苗再生率能达到 80%，且不用产生愈伤组织而直接产生不定芽，大幅度提高
了茄子转基因效率，缩短了培养时间。
转导载体中报告基因的存在，虽然有利于转基因苗的筛选，但是由于消费者担心报告基因的副
作用而不能充分接受，因此妨碍育种的应用进程。转基因植物的选择标记去除工作是植物生物学研
究的重要研究目标，无标记基因的转基因植株，更容易被消费者接受，且能消除对环境的不良影响
（Rosellini，2012）。孙磊等（2008）利用双 T-DNA 超级双元载体 pCAMB IA1300-gus，通过共转化
方法创建获得无选择标记基因的转基因菊花，大大改良了菊花转基因体系。本试验结果表明，
pCAMBIAI 35S-2300 载体经改造后，尽管没有 GUS 报告基因辅助筛选转基因苗，但是在随机选择
的 20 株分化苗中，经 RT-PCR 和 qRT-PCR 检测后，其中 15 株被成功导入外源载体，并达到较好的
RNA 干涉效果，转基因植株所占比例达到 75%。因此本研究体系能有效使用不含报告基因的载体，
有利于转基因材料在育种中的直接应用。

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