全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – ： 2014 41 11 2313 2322 http // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail： yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–05–05；修回日期：2014–08–11
基金项目：河北省自然科学基金项目（C2007000547）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hjduan@hebau.edu.cn）
低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及
基因表达的差异分析
杨炳艳，霍秀爱，刘云婷，段会军*
（河北农业大学农学院，华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室，河北保定 071001）
摘 要：为了揭示西瓜二倍体及三倍体在低温胁迫下的耐冷性分子机制，以西瓜二倍体自交系
‘83166’（‘京欣 1 号’品种的母本）及其同源三倍体为材料，利用 MSAP 及 cDNA-AFLP 技术研究低温
处理前后基因表达的差异，并对差异带进行克隆、测序和比对。28 对 MSAP 引物扩增得到 2 356 个位点，
其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降 8.5%，三倍体下降 10.4%。将 13 条差异带与西瓜基因组数据库
比对，有 7 条带确定是西瓜基因组序列。26 对 cDNA-AFLP 引物组合扩增出 1 267 条带，其中二倍体上调
表达占 48.2%，下调表达占 51.8%；三倍体上调表达占 51.3%，下调表达占 48.7%。21 条差异带在 NCBI
中找到了同源序列基因，包括假定蛋白（38.1%）、能量与代谢（38.1%）、信号转导（9.5%）、物质运输（9.5%）
以及 DNA 修饰（4.8%），另有 9 条无同源序列。低温胁迫后，三倍体去甲基化率与上调表达量均大于二
倍体，而且三倍体诱导出更多的差异基因参与了能量代谢调控、信号转导、物质运输等过程，说明在抵
御低温胁迫中三倍体比二倍体有更强的耐冷性。
关键词：西瓜；低温；MSAP；cDNA-AFLP；基因表达
中图分类号：S 651 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2313-10

MSAP and Differential Expression of Homologous Diploid and Triploid
Watermelon Under Cold Stress
YANG Bing-yan，HUO Xiu-ai，LIU Yun-ting，and DUAN Hui-jun*
（College of Agronomy，Agricultural University of Hebei，North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of
Education Ministry，Baoding，Hebei 071001，China）
Abstract：The purpose of this study focused on molecular mechanism in low temperature of
watermelon seeding，making homologous diploid and triploid of watermelon of female precocious Jingxin
as materials，using MSAP and cDNA-AFLP analysis of genes differentially expressed before and after low
temperature stress，and selected different bands to be cloned，sequenced and compared. A total of 2 356
locus were amplied after using 28 MSAP primer combinations. Levels of decline in the total methylation
were 8.5% and 10.4% of the diploid and the triploid of watermelon，respectively. Took 13 different bands
with watermelon genome database，identified 7 bands as watermelon genome sequence. After being
screened with 26 cDNA-AFLP primer combinations，1 267 bands were amplied：48.2% with up-regulated

致谢：诚挚感谢中国地质大学长城学院张现彬教授对本文英文部分的审校。
2314 园 艺 学 报 41 卷
expression，51.8% with down-regulated expression in the diploid of watermelon；51.3% with up-regulated
expression，48.7% with down-regulated expression in the triploid of watermelon. NCBI Blast search
showed that 21 bands were homologous to functional genes，including hypothetical protein（38.1%），
energy and metabolism protein（38.1%），signal transduction protein（9.5%），material transportation protein
（9.5%），and DNA modification gene（4.8%），the function of the other 9 bands remained unknown. Under
low temperature stress，the demethylation rate and up-regulated genes of the triploid of watermelon were
greater than the diploid of watermelon，the triploid of watermelon induced more genes involved in energy
and metabolism，signal transduction and transportation process，illustrating that the triploid of watermelon
had stronger resistance to low temperature than the diploid of watermelon.
Key words：watermelon；cold stress；MSAP；cDNA-AFLP；gene expression

西瓜是喜温耐热性植物，早春和冬季种植常会受到低温伤害，造成产量和品质下降（段会军 等，
2007）。目前西瓜耐冷种质资源相当缺乏（张爱华 等，2010）。许勇等（2000）研究发现野生西瓜在
偏低温下表现出较强的耐冷性。刘文革等（2004a）以‘蜜枚’二倍体西瓜与同源四倍体和三倍体为
材料，研究耐冷性差异，发现经过冷锻炼的三倍体耐低温能力得到了提高，超过了二倍体。目前生
产上应用的主要是二倍体和三倍体西瓜品种，而三倍体西瓜既无籽又抗逆，是未来发展的一个方向。
近年来多种分子标记技术已经应用于西瓜遗传多样性研究（Zhang et al.，1994；Levi et al.，2004；
Joobeur et al.，2006）。刘文革等（2004b）利用 AFLP 技术分析不同倍性西瓜的遗传差异，结果大部
分引物组合扩增出的条带没有明显差异，说明了不同倍性西瓜在 DNA 水平上的多态性低。
DNA 甲基化修饰是最主要的表观遗传修饰形式，在高等植物中普遍存在，有 20% ~ 40%的胞嘧
啶以甲基化的状态存在于核基因组中（Gruenbaum et al.，1981；Messeguer et al.，1991）。甲基化敏
感扩增多态性（MSAP）是一种改良的 AFLP 技术，已经被广泛应用到非生物胁迫（温度）影响基
因组 DNA 水平的研究中。高桂珍等（2011）利用白菜型油菜种子为材料，分析不同温度对基因组
DNA 甲基化水平的影响，结果显示热胁迫过程中种子基因组 DNA 甲基化水平降低。盖树鹏等（2012）
研究发现牡丹休眠期间花芽内 DNA 甲基化程度很高，但是在低温处理进程中甲基化水平总体呈下
降趋势，说明基因组 DNA 甲基化与基因沉默相关。cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length
polymorphism）技术是 Bachem 等（1996）提出的一种差异表达鉴定技术，主要用于研究 mRNA 差
异表达图谱。cDNA-AFLP 具有可靠性、稳定性、高效性以及不需要预先知道序列信息等优点，已
经被应用于多种植物基因表达的研究中（娄平 等，2003；谷俊涛 等，2009；肖金平 等，2011）。
前人研究发现，不同倍性西瓜的遗传背景差异很小，但是在低温胁迫下的生理生化变化差异很大，
猜想不同倍性西瓜在 DNA 甲基化及差异表达上存在差异。
本研究中以‘京欣 1 号’西瓜的母本‘83166’（二倍体）及其同源三倍体为材料，利用 MSAP
和 cDNA-AFLP 技术对两者在低温胁迫前后基因表达的差异进行分析，将差异片段进行测序比对并
推测其可能的生物学功能，旨在进一步揭示二倍体及同源三倍体西瓜耐冷性的分子机制，为西瓜耐
冷性分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
西瓜二倍体自交系‘83166’（‘京欣 1 号’品种的母本）的种子由河北保定大农种子公司提供，
11 期 杨炳艳等：低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析 2315
2010 年本实验室采用浓度为 20 μmol · L-1 的胺磺灵（oryzalin）诱变‘83166’获得四倍体，2012 年
将‘83166’二倍体与其四倍体杂交获得三倍体。
1.2 试验方法
1.2.1 幼苗培养及低温处理
将西瓜种子用 55 ℃温水浸种，不断搅拌 15 min，自然降温 7 h，播种于盛有灭菌蛭石的塑料营
养钵中，每钵 3 粒，置于 PGX-3500-DN 型光照培养箱中（25 ℃/15 ℃，14 h 光照/10 h 黑暗，光照
度 1 500 lx）。培养至三叶一心时进行 4 ℃低温处理 12 h，处理和对照各 15 株。
1.2.2 叶片 DNA 的提取及纯化
取西瓜新鲜叶片 5 g，采用 CTAB 法提取 DNA。将 DNA 溶于 ddH2O 后加入 RNA 酶，于 37 ℃
水浴锅中处理 2 h，除去 RNA。纯化后的 DNA 用琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪（NanoDrop ND-1000
Spectrophoto-meter）检测，于–20 ℃保存备用。
1.2.3 叶片 RNA 的提取与单链 cDNA 的合成
取液氮研磨后的西瓜叶片 0.5 g，用天根 TRNzol 总 RNA 提取试剂提取总 RNA，经过琼脂糖凝
胶电泳和核酸测定仪对总 RNA 的质量和浓度进行检测后，于–80 ℃保存备用。利用康为世纪的
cDNA 合成试剂盒合成单链 cDNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测，于–20 ℃保存备用。
1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
MSAP 体系和主要步骤包括：750 ng DNA、3U EcoRⅠ和 3U MspⅠ/3U HpaⅡ在 37 ℃酶切 7 h，
取酶切片段用 5 pmol EcoRⅠ接头、50 pmol MspⅠ~ HpaⅡ接头在 2U T4 连接酶 16 ℃连接过夜，并
用稀释 20 倍的连接产物作为预扩增底物，再将所得的预扩增产物稀释 20 倍用于选择性扩增，选择
性扩增的产物在 6%变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色，扩增程序参照 AFLP。
cDNA-AFLP 体系和程序参照 Bachem 等（1996）的方法，主要步骤包括：750 ng cDNA、3U
EcoRⅠ和 3U MseⅠ在 37 ℃酶切 4 h，升温到 65 ℃酶切 1 h 以上，取酶切片段用 5 pmol EcoRⅠ接头、
50 pmol MseⅠ接头和 2U T4 连接酶 16 ℃连接过夜，并用稀释 20 倍的连接产物作为预扩增底物，再
将所得的预扩增产物稀释 10 倍用于选择性扩增，选择性扩增的产物在 6%变性的聚丙烯酰胺凝胶上
电泳，银染显色，扩增程序与 AFLP 相同。
1.2.5 差异片段的回收及测序
用单刃刀片小心切下甲基化及 cDNA-AFLP 差异条带的凝胶，置于盛有 30 μL ddH2O 的 200 μL
的离心管中，在 PCR 仪上加热 15 min，离心 10 min（10 000 r · min-1），4 ℃静置过夜。取上清液进
行第 2 次扩增。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后利用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒回收。
回收产物连接到天根公司提供的 pGM-T 载体上，载体与片段的摩尔比控制在 1︰3 ~ 1︰8。连接
产物转入感受态大肠杆菌 Top10 内，蓝白斑筛选阳性克隆。所得的阳性克隆由上海生工生物工程技
术服务有限公司测序。
1.2.6 生物信息学分析
将测序得到的序列去除载体后与西瓜基因组数据库（http：//www. icugi. org/）及 NCBI（http：//www.
ncbi. nlm. nih. gov/）数据库中的 BLASTX 进行同源比对。
1.2.7 数据分析
利用两个样本平均数比较的 u 检验方法对甲基化水平上的差异进行显著性分析。

2316 园 艺 学 报 41 卷
2 结果与分析
2.1 MSAP的结果及分析
2.1.1 甲基化水平分析
采用 CTAB 法提取的西瓜叶片基因组 DNA OD260/OD280 值在 1.8 ~ 1.9 之间。经 1%琼脂糖凝胶
电泳检测主带清晰，不含 RNA，满足 MSAP 对模板的要求。
利用 28 对 MSAP 通用引物对二倍体、三倍体及低温处理后材料进行扩增，统计 100 ~ 500 bp
范围共得到 2 356 条带（图 1）。E18 + H7、E19 + H2、E20 + H18、E19 + H3 分别为 4 对 EcoRⅠ与
MspⅠ~ HpaⅡ引物组合。根据 MspⅠ与 HpaⅡ对甲基化的敏感程度不同，两种酶对应的扩增结果呈
现出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ不同的带型，如表 1。


图 1 部分引物 MSAP 扩增图谱
1：二倍体；2：低温处理的二倍体；3：三倍体；4：低温处理的三倍体。H：EcoRⅠ+ HpaⅡ双酶切；M：EcoRⅠ+ MspⅠ双酶切。
Fig. 1 Part of electrophoresis maps on MSAP
1：The diploid；2：The diploid in cold stress；3：The triploid；4：The triploid in cold stress.
H：EcoRⅠ+ HpaⅡdouble digestion；M：EcoRⅠ+ MspⅠdouble digestion.

表 1 HpaⅡ与 MspⅠ甲基化类型
Table 1 The methylation type of HpaⅡand MspⅠ
甲基化类型 Type H 带型 H bands M 带型 M bands 甲基化状态 Methylation status
Ⅰ 1 1 无甲基化 Non-methylated
Ⅱ 0 1 双链 DNA 内部甲基化 dsDNA internal methylated
Ⅲ 1 0 单链 DNA 外部甲基化 ssDNA external methylated
Ⅳ 0 0 双链 DNA 外部甲基化 dsDNA external methylated
11 期 杨炳艳等：低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析 2317
统计甲基化带型（表 2），二倍体经低温处理后总甲基化率下降 8.5%，三倍体下降了 10.4%。在
总甲基化水平上二倍体与三倍体无显著差异，二倍体与低温处理后二倍体差异极显著，三倍体与低
温处理后三倍体差异极显著；半甲基化水平上二倍体与三倍体无显著差异，二倍体与低温处理后二
倍体差异极显著，三倍体与低温处理后三倍体差异极显著；全甲基化水平上二倍体与三倍体无显著
差异，二倍体与低温处理后二倍体差异不显著，三倍体与低温处理后三倍体差异不显著。


表 2 基因组 DNA 经 MSAP 分析的甲基化水平
Table 2 DNA methylation levels based on MSAP analysis
全甲基化
Full methylated
半甲基化
Hemimethylated

总甲基化
Total methylated材料
Materials
Ⅰ类型
ⅠType
Ⅱ类型
ⅡType
Ⅲ类型
Ⅲ Type
Ⅳ类型
Ⅳ Type 位点
Sites
%
位点
Sites
%
位点
Sites
%
二倍体 Diploid 74 126 95 294 200 33.96 95 16.13** 295 50.08**
低温处理的二倍体 Diploid under cold stress 77 118 50 344 195 33.11 50 8.49 245 41.60
三倍体 Triploid 74 124 96 295 198 33.62 96 16.30** 294 49.92**
低温处理的三倍体 Triploid in cold 77 107 49 356 184 31.24 49 8.32 233 39.56


2.1.2 甲基化模式分析
将聚丙烯凝胶电泳上检测到的扩增位点计为“1”，未检测到的位点计为“0”，电泳谱带可分为
A、B、C 和 D，其中 A 包含 3 个亚类；B 和 C 分别包含 5 个亚类；D 包含 2 个亚类（表 3）。类型
A 为单态性位点，处理和对照之间 DNA 甲基化模式未发生改变，其中二倍体这种未发生甲基化模
式变化的位点数占所检测位点总数的 65.5%，三倍体为 64.8%。类型 B 是指低温处理后较对照发生
去甲基化的位点类型，其中二倍体这种甲基化程度降低的位点占 20.3%，三倍体占 21.5%。类型 C
是指低温处理后较对照发生过甲基化的类型位点，二倍体和三倍体这种甲基化程度升高的位点分别
占 13.6%和 12.5%。类型 D 所占比率极低，该类型位点甲基化程度和模式都发生改变，无法辨认 DNA
甲基化变动模式，因此不在分析之列。

表 3 低温处理前后相比的 DNA 甲基化模式变化
Table 3 Comparison of the changes of DNA methylation patterns between control and cold stress treatment
对照 Control 低温处理 Cold stress treatment 位点数及比率Number and frequency of patterns类型
Type
亚类型
Sub type H M H M 二倍体 Diploid 三倍体 Triploid
A A-1 1 1 1 1 277 281
A-2 1 0 1 0 43 39
A-3 0 1 0 1 61 54
合计 Total 381（65.5%） 374（64.8%）
B B-1 1 0 1 1 46 48
B-2 0 1 1 1 5 14
B-3 0 0 1 1 16 13
B-4 0 0 1 0 5 5
B-5 0 0 0 1 46 44
合计 Total 118（20.3%） 124（21.5%）
C C-1 1 1 1 0 0 2
C-2 1 1 0 1 9 5
C-3 1 1 0 0 8 7
C-4 1 0 0 0 4 5
C-5 0 1 0 0 58 53
合计 Total 79（13.6%） 72（12.5%）
D D-1 0 1 1 0 2 3
D-2 1 0 0 1 2 4
合计 Total 4（0.7%） 7（1.2%）


2318 园 艺 学 报 41 卷
2.1.3 甲基化多态性片段分析及功能预测
MSAP 分析共回收了 13 条差异片段，其甲基化模式均是二倍体与三倍体共同发生去甲基化和过
甲基化。将差异片段进行二次扩增、回收、克隆、测序，其中 7 条序列与西瓜数据库比对后相似度
达到 99% ~ 100%。再利用 NCBI 网站的 BLASTX 程序对 7 条差异片段进行同源序列比对（表 4），
可以看出 M5、M6、M7 与 M8 均为假定蛋白，M1 序列的相似蛋白与植物生长发育有关，M2 参与
蛋白质磷酸化过程间接参与低温胁迫，M3 是一种能与真核启动子区域中顺式作用元件发生特异性
相互作用的转录因子。

表 4 MSAP 分离低温胁迫差异表达基因的同源性分析
Table 4 Homologies of sequences isolated by MSAP analysis under cold stress
名称
Name
大小/bp
Size
登录号
Accession
模式
Pattern
相似蛋白
Similar protein
物种
Organism
E 值
E-value
M1 292 EOX96331.1 去甲基化
Demethylation
C2H2 型锌指蛋白家族
C2H2-type zinc finger family protein
可可树
Theobroma cacao
9.00E-04
M2 258 EOY28153.1 去甲基化
Demethylation
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
Serine/threonine-protein kinase-like protein
可可树
Theobroma cacao
9.00E-32
M3 100 NP_173523.1 过甲基化
Hypermethylation
富含组氨酸的 C1 结构域家族蛋白
Histidine-rich C1 domain family protein
拟南芥
Arabidopsis thaliana
7.60E-01
M5 440 XP_004143605.1 去甲基化
Demethylation
假定蛋白
Uncharacterized protein
黄瓜
Cucumis sativus
9.00E-27
M6 385 XP_643160.1 过甲基化
Hypermethylation
假定蛋白
Uncharacterized protein
盘基网柄菌
Dictyostelium discoideum
5.30E-01
M7 214 XP_004167709.1 去甲基化
Demethylation
假定蛋白
Uncharacterized protein
黄瓜
Cucumis sativus
2.00E-11
M8 150 EOY02413.1 过甲基化
Hypermethylation
假定蛋白
Uncharacterized protein
可可树
Theobroma cacao
2.00E-10

2.2 cDNA-AFLP的结果及分析
2.2.1 差异表达分析
提取的总 RNA经 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测，可清晰看出 RNA 的 28S、18S 和 5.8S 3 条
谱带，RNA 样品的 OD260/OD280 值在 2.0 左右，
说明 RNA 的提取质量较高，可以满足反转录
试验的要求。RNA 反转录后的单链 cDNA，主
要弥散在 100 ~ 1 000 bp 之间，质量较好，可
以进行下一步 cDNA-AFLP 标记分析。
利用 cDNA-AFLP 技术检测了西瓜二倍体
以及三倍体表达图谱（图 2）的差异，图 2 中
显示通用引物 EcoRⅠ18 + MseⅠ17 扩增结果。用
26 对引物进行选择性扩增，共得到 1 267 条带，
片段多集中于 100 ~ 500 bp 之间，平均每对引
物组合扩增出约 49 条带。其中二倍体、三倍体
分别扩增出 325 条和 310 条，低温处理后二倍
体条带数减少，三倍体条带数有所增加，分别
是 312 条和 320 条。统计差异带结果：二倍体
图 2 部分 cDNA-AFLP 扩增图谱
1：二倍体；2：低温处理的二倍体；3：三倍体；
4：低温处理的三倍体。
A：相似表达；B：下调表达；C：上调表达。
Fig. 2 Part of electrophoresis maps of cDNA-AFLP
1：The diploid；2：The diploid under cold stress；3：The triploid；
4：The triploid under cold stress.
A：Similar expression；B：Up-regulated expression；
C：Down-regulated expression.
11 期 杨炳艳等：低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析 2319
共 353 条差异带，其中上调表达 170 条（48.2%），下调表达 183（51.8%）；三倍体共 382 条差异带，
其中上调表达 196 条（51.3%），下调表达 186 条（48.7%）。
2.2.2 差异片段分析及功能预测
cDNA-AFLP 共回收了 30 条差异片段，对差异片段进行二次扩增、回收、克隆、测序，利用
NCBI 网站的 BLASTX 程序对 30 条差异片段进行比对。结果显示：与已知基因有同源性的片段有
21 条，占测序数的 70.0%，包括假定蛋白 8 条（38.1%），能量与代谢相关 8 条（38.1%），物质运输
相关 2 条（9.5%），信号转导相关 2 条（9.5%），DNA 修饰相关 1 条（4.8%），另外的 9 条片段与已
知基因或序列无同源性，可能是尚未发现的新基因。
表 5 中列出了测序所得到的 13 条 cDNA 片段信息。

表 5 cDNA-AFLP 分离低温胁迫差异表达基因的同源性分析
Table 5 Homologies of TDF sequences isolated by cDNA-AFLP analysis under cold stress
类型
Type
名称
Name
登录号
Accession
大小/bp
Size
相似蛋白
Similar protein
物种
Organism
E 值
E-value
TDF1 WP_005400871.1 128 赖氨酸转运裂解酶
Lysine transporter LysE
约氏不动杆菌
Acinetobacter johnsonii
5.00E-04
TDF2 CCZ53703.1 239 胆碱脱氢酶
Choline dehydrogenase
小杆菌属
Dialister invisus
7.4
TDF3 WP_003760907.1 139 乙酰辅酶 A 羧化酶的羧基转移酶 β 亚基
Acetyl-CoA carboxylase carboxyl
transferase subunit beta
奈瑟氏菌属
Neisseria
6.00E-16
TDF4 WP_002924468.1 283 糖基转移酶
Glycosyl transferase
血链球菌
Streptococcus
sanguinis
1.9
TDF5 WP_016990997.1 304 1,4–二羟基–2–萘甲酸异戊烯转移酶
1,4-dihydroxy-2-naphthoate
prenyltransferase
黄质菌属
Flavobacterium
5.00E-39
TDF6 ABN08973.1 327 天门冬氨酸肽酶
Aspartate carbamoyltransferase
蒺藜苜蓿
Medicago truncatula
3.00E-22
TDF7 WP_022847483.1 134 脯氨酰–tRNA 合成酶
Prolyl-tRNA synthetase
除硫杆菌属
Desulfurobacterium
1.00E-09
能量与代谢相关
Related to energy
and metabolism
TDF8 YP_002251671.1 265 ATP 合酶 F0，A 亚基
ATP synthase F0，A subunit
嗜热网络球杆菌属
Dictyoglomus
thermophilum
9.30E
TDF9 YP_004484930.1 113 GTP 结合蛋白 HflX
GTP-binding protein HflX
甲烷炎菌属
Methanotorris
3.7 信号转导相关
Related to signal
transduction TDF10 WP_022397645.1 315 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
Serine/threonine protein kinase
突柄杆菌属
Akkermansia
4.00E-10
TDF11 YP_007542023.1 159 主要推动转运家族
Major facilitator superfamily transporter
嗜冷居水菌
Glaciecola
psychrophila
3.3 物质运输相关
Related to material
transportation
TDF12 NP_001180442.1 177 锌转运体亚型 1
Zinc transporter 6 isoform 1
智人
Homo sapiens
0.002
DNA 修饰相关
Related to DNA
modification
TDF13 WP_007414747.1 195 DNA 的 3–甲基腺嘌呤糖基化酶
DNA-3-methyladenine glycosylase
小韦永氏菌
Pedosphaera parvula
8.00E-19
3 讨论
3.1 低温胁迫下西瓜幼苗甲基化分析
研究发现二倍体和三倍体的全甲基化率、半甲基化率及总甲基化率差异均不显著，与王春国等
（2009）研究的结果一致，即 DNA 甲基化水平与倍性高低关系不大，不同倍体西瓜间的甲基化水

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平十分接近。但是经过低温处理后两个倍性的对照与处理间除了全甲基化率差异不显著外，半甲基
化率及总甲基化率差异均显著，说明了西瓜幼苗的甲基化水平受到低温影响显著，尤其是半甲基化
率下降的最为明显。朱红菊（2012）研究同样发现 NaCl 胁迫下不同倍性西瓜的全甲基化率、半甲
基化率及总甲基化率均下降。甲基化模式分析，二倍体和三倍体遇到低温后均发生了不同程度的去
甲基化和过甲基化变化，其中去甲基化概率最高，说明了二倍体和三倍体不仅存在不同甲基化机制
抵御低温迫害，而且通过自身的去甲基化使得更多的抗逆基因得到表达。植物 DNA 甲基化不仅发
生在核基因组中，也出现在线粒体、叶绿体等细胞器中（Finnegan & Kovae，2000），不仅有 5–甲
基胞嘧啶（5-mC）甲基化，也有少量 N6–甲基腺嘌呤（N6-mA）及 7–甲基鸟嘌呤（7-mG）甲基
化，而本试验仅利用 EcoRⅠ+ MspⅠ与 EcoRⅠ+ HpaⅡ分析了核基因组中 CCGG 的胞嘧啶甲基化程
度，不能准确反映植物实际的甲基化水平。
差异带的测序结果 7 条带与西瓜基因组数据库比对后相似度很高，可以确定为西瓜基因，此 7
条带与 NCBI 数据库比对结果：4 条是假定蛋白，3 条是有意义序列，分别是去甲基化模式的 M1、
M2，过甲基化模式的 M3。M1 序列与 C2H2 型锌指蛋白家族同源性最高，此蛋白家族主要涉及植物
的生长发育和对环境胁迫的应答（黄骥 等，2004）。M2 序列编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参
与蛋白质的磷酸化过程，一方面可以调节蛋白质的活性，另一方面还可将细胞外刺激信号，如生长
因子、植物激素、环境刺激等，转导至细胞及其核内，磷酸化为特异的转录因子（Seger & Krebs，
1995；Robinson & Cobb，1997；Khokhlatchev et al.，1998），此序列发生去甲基化使得该基因重新
获得表达，从而使二倍体和三倍体响应低温胁迫。M3 编码富含组氨酸的 C1 结构域家族蛋白，是一
种转录因子，与真核启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用， M3 发生过甲基化抑制转录
调控低温反应。
3.2 低温胁迫下西瓜幼苗cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP 分析结果显示二倍体的条带数在低温处理后减少，而三倍体的条带数有所增加，
同时，三倍体的上调表达量高于二倍体的上调表达量，说明低温条件可能诱导了西瓜二倍体和三倍
体中抗冷基因表达，尤其是三倍体，从而使得三倍体较二倍体有更好的耐冷性，与前人研究结果一
致。本试验得到的 30 条基因片段中有 21 条在 NCBI 中找到了同源序列，13 条 TDF 片段参与了能
量与代谢、信号转导、物质运输等过程，表明这些基因可能参与了低温的响应过程，对抵御低温胁
迫起到了关键性作用，具体的调控过程有待进一步探讨。
TDF6 属于二倍体的上调基因，而 TDF5、TDF7 以及 TDF11 属于二倍体的下调基因。TDF5 为
编码 1,4–二羟基–2–萘甲酸异戊烯转移酶的基因，根据异戊烯基转移酶的分类可归为芳香族异戊
烯转移酶，主要功能是将异戊烯单元融入含有芳环的化合物，从而形成具有重要生物学功能的各类
活性分子，包括初生代谢中的泛醌、质体醌和维生素 E 以及植物次生代谢中的异戊烯类黄酮和真菌
代谢物（Botta et al.，2005）。TDF7 序列编码表达脯氨酰–tRNA 合成酶，主要作用是催化脯氨酸与
同源 tRNA 氨酰化（周勤华和周盛梅，2009）。低温处理后此基因不表达，从而使二倍体西瓜积累较
多的脯氨酸，提高其自身抗冷性。TDF1 与 TDF12 在三倍体的低温胁迫中下调，其中 TDF1 编码赖
氨酸转运裂解酶，三倍体西瓜在受到低温胁迫后抑制 TDF1 的表达，从而抑制了赖氨酸的裂解，间
接抵御低温迫害。TDF2、TDF3、TDF4、TDF8、TDF9、TDF10 及 TDF13 在三倍体的低温胁迫中上
调。TDF3 与乙酰辅酶 A 羧化酶的羧基转移酶 β 亚基序列的同源性较高，是乙酰辅酶 A 羧化酶的重
要组成部分。乙酰辅酶 A 羧化酶是合成脂肪酸的限速酶（赵虎基和王国英，2003），而植物对低温
反应的一种重要的表现就是增加不饱和度较高的脂肪酸的含量，可以使植物在较低温度下保持细胞
膜的流动性。说明了三倍体西瓜可以通过调控乙酰辅酶 A 羧化酶的羧基转移酶 β亚基基因的上调表
11 期 杨炳艳等：低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析 2321
达，间接调控细胞膜的流动性，从而抵御低温胁迫。TDF13 是 DNA 的 3–甲基腺嘌呤糖基化酶，
是一种甲基化修饰酶，进一步说明了甲基化与低温胁迫相关。
试验分离得到的差异片段大小为 100 ~ 500 bp，片段偏短，原因是 EcoRⅠ与 MseⅠ双酶切切成
的 cDNA 片段较短，可以通过 RACE 方法获得全长 cDNA 序列，从而获得更准确的信息。而且本次
试验中只考虑了条带的有无，忽略了条带明暗及粗细差异，可以通过对更多不同酶切组合引物的筛
选来弥补。
总之，西瓜二倍体与三倍体之间的甲基化率、上调和下调表达比率不同，三倍体的去甲基化率
和上调表达量均高于二倍体，说明三倍体诱导了更多基因的表达响应低温胁迫，从而使三倍体耐冷
性强于二倍体。
两种分析方法共回收了 43 条差异带，甲基化差异带中有 7 条可以确定为西瓜基因，并且其中 3
条与低温胁迫相关；cDNA-AFLP 分析中 13 条带分别参与了能量与代谢、信号转导、物质运输以及
DNA 修饰相关过程，为下一步研究西瓜二倍体和三倍体耐冷性的调控机制奠定基础。

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